宋　珺， 韓　菁， 孫　越， 施偉民

(上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院皮膚科，上?！?00080)

侵襲性肺曲霉病(invasive pulmonary aspergillosis, IPA)是煙曲霉菌(Aspergillusfumigatus, AF)侵入免疫受損宿主所導致的一種高致死率的嚴重感染性疾病[1-3]。該病的病理表現(xiàn)為急性廣泛出血性壞死性肺炎、膿腫或由上皮細胞和巨噬細胞組成的肉芽腫，還表現(xiàn)為曲霉菌在肺組織內(nèi)增殖并侵入血管，導致壞死性血管炎、血栓和菌栓性出血，并可經(jīng)血行播散，甚至全身多器官受累，預后極差[1-3]。

煙曲霉是一種通過空氣傳播的腐生條件致病真菌，廣泛存在于自然界，其孢子直徑很小,可被動吸入呼吸道進入人體從而引起肺部感染，引起炎癥因子釋放激發(fā)免疫反應，進而引發(fā)IPA[4-7]。呼吸道黏膜通常是由氣道上皮細胞、間質(zhì)成纖維細胞和肺微血管內(nèi)皮細胞(pulmonary microvascular endothelial cells, PMVECs)組成一個功能單位，參與疾病的病理生理過程。PMVECs是肺臟內(nèi)含量最為豐富的細胞之一，其通過細胞間的相互作用以及與細胞外基質(zhì)連接構成肺微循環(huán)交換血管的最內(nèi)層，具備代謝活躍和功能復雜的特點[8-10]。PMVECs參與肺內(nèi)多種生理功能的調(diào)節(jié)，如微血管緊張性的維持、宿主自身防御反應以及血管生成等，其功能和結構的完整性對于維持正常肺生理功能至關重要[8-10]。在肺部炎癥反應過程中，PMVECs是病毒、細菌、真菌、炎癥因子等首先攻擊的效應細胞之一，其維持的結構和功能屏障被破壞以及由此造成的細胞通透性增加為肺部多種疾病的病理基礎之一[8-10]。

目前，尚未有研究報導煙曲霉對PMVECs通透性的影響。本研究考察了煙曲霉對PMVECs通透性的影響，并對其可能機制進行了探討。

1　材料與方法

1.1　材料

人PMVECs(HPMVECs)購于美國加利福尼亞州圣地亞哥ScienCell研究實驗室；煙曲霉菌株(AF 293)購于中國普通微生物菌種保藏管理中心；吐溫80購自生工生物工程(上海)股份有限公司；胎牛血清、DMEM、胰蛋白酶等細胞培養(yǎng)試劑購自賽默飛世爾公司；激光共聚焦掃描顯微鏡(Leica TCS SP5)購自Leica公司；跨膜電阻儀購自Millipore公司。

1.2　煙曲霉菌孢子懸液制備

取AF293煙曲霉菌菌株接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3d，0.1%吐溫80的生理鹽水10mL沖洗培養(yǎng)基表面，收集煙曲霉菌孢子懸液，8層無菌紗布(高壓滅菌)過濾，含0.1%吐溫80的PBS液清洗，后轉入離心管中，1000r/min，離心10min，棄去上清液，煙曲霉孢子重懸于含0.1%吐溫80的PBS液中，計數(shù)孢子數(shù)量，再將煙曲霉孢子懸液離心(1000r/min)10min，孢子重懸于PBS中，調(diào)整孢子濃度為5×107cfu/mL，備用。

1.3　細胞培養(yǎng)

HPMVECs的培養(yǎng)參照以前的研究[11]，培養(yǎng)液為專用內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液。HPMVECs達90%培養(yǎng)皿底壁后，棄舊培養(yǎng)液，適量PBS清洗，加入適度預熱的胰酶，置于37℃培養(yǎng)箱消化，加入培養(yǎng)液終止消化，移液器輕輕吹打，待細胞全部吹打下來后，收集HPMVECs懸液，于15mL離心管中離心5min(離心半徑30cm，1000r/min)，培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度后置于孵箱(37℃、5% CO2飽和濕度)中進行傳代培養(yǎng)。于傳代培養(yǎng)第5代(細胞達90%底壁)后，HPMVECs被給予煙曲霉菌孢子處理。

1.4　細胞處理以及激光共聚焦掃描顯微鏡檢測

HPMVECs被胰酶消化后，培養(yǎng)液重懸，取細胞懸液滴到的細胞爬片(鋪于培養(yǎng)孔板中)上，30min后，添加培養(yǎng)液，置于孵箱(37℃、5% CO2飽和濕度)中培養(yǎng)6h，然后用煙曲霉菌孢子刺激HPMVECs，PBS清洗，多聚甲醛(4%)于室溫固定1.5h，PBS清洗，與羅丹明-鬼筆環(huán)肽孵育(室溫)30min，取出細胞爬片，PBS漂洗，用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚染色，PBS漂洗，后封片劑封片(有細胞一面對著載玻片)，用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察并拍照。使用Image J測量熒光強度。

1.5　細胞跨膜電阻測定

細胞跨膜電阻值(transepithelial electrical resist-ance, TER)反映溶質(zhì)離子電流的強弱，與細胞通透性呈反比，可用于反映細胞通透性。將HPMVECs接種于基質(zhì)膠包被的Transwell小室，上、下室分別加入250、750μL培養(yǎng)液，HPMVECs達單層融合后，設置空白對照組(Con)、AF處理組(AF,MOI： 1∶8)、TNF-α(20ng/mL)處理組(TNF-α)、AF+SB203580(20μmol/L)處理組(AF+SB203580)、AF+Y27632(20μmol/L)處理組(AF+Y27632)以及AF+LY317615(10μmol/L)處理組(AF+LY317615)，其中TNF-α組為陽性對照組。將跨膜電阻測定儀調(diào)至歐姆檔，2個電極分別于置于Transwell小室表面和下室固定位置，于4、8、16、24h測量各組電阻，并測未接種HPMVECs的小室的電阻，每室重復3次，計算公式為TER=(測得電阻值-空白電阻值)×Transwell小室的底面積，單位為： Ωcm2。

1.6　統(tǒng)計學處理

2　結　　果

2.1　激光共聚焦掃描顯微鏡觀檢測HPMVECs

羅丹明-鬼筆環(huán)肽與胞質(zhì)內(nèi)肌動蛋白(F-actin)結合而發(fā)紅光，DAPI與細胞核結合發(fā)藍光。激光共聚焦掃描顯微鏡顯示，HPMVECs與煙曲霉共培養(yǎng)至8h，與對照組相比較，煙曲霉組HPMVECs數(shù)量減少，細胞F-actin明顯減少，應力纖維排列紊亂或部分消失，細胞間的連接縫隙增大或中斷，見圖1。細胞F-actin反映細胞骨架的改變，進而反映細胞的通透性，對F-actin染色熒光強度的統(tǒng)計學分析顯示，AF處理后F-actin染色的熒光強度顯著下降(P<0.01)，表明AF處理后引起HPMVECs的通透性增加，見圖2。

圖1　激光共聚焦掃描顯微鏡檢測HPMVECsFig.1　Detection of human pulmonary microvascular endothelial cells with confocal laser scanning microscopy

圖2　煙曲霉處理對HPMVECs F-actin表達的影響Fig.2　Effect of Aspergillus fumigatus on F-actin in human pulmonary microvascular endothelial cells與對照組比較,#P<0.01

2.2　細胞跨膜電阻的檢測

在4h時，空白對照組、AF組、TNF-α陽性對照組、AF+SB203580組、AF+Y27632組以及AF+LY317615組各組間跨膜電阻值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；8h時，與空白對照組比較，AF組和TNF-α組的跨膜電阻值均出現(xiàn)顯著下降(P<0.01)，與AF組比較，AF+SB203580組、AF+Y27632組以及AF+LY317615組的跨膜電阻值均顯著上升(P<0.05)，上述改變一直持續(xù)到24h，見圖3。

圖3　HPMVECs跨膜電阻的檢測Fig.3　Detection of transepithelial electrical resistance in human pulmonary microvascular endothelial cells與對照組比較，#P<0.01,；與煙曲霉組比較，*P<0.05；Con： 對照，SB： SB203580，Y： Y27632，LY： LY317615，AF： 煙曲霉，TER： 內(nèi)皮細胞細胞跨膜電阻；A、B、C、D分別為試驗后4、8、16、24h

3　討　　論

細胞骨架在維持細胞的形態(tài)和結構的完整性方面起著重要作用，負責執(zhí)行和協(xié)助完成多種細胞功能。微絲是細胞骨架的組成成分，微絲主要由F-actin等組成，具可收縮性的特點。當細胞受到異常刺激時，F(xiàn)-actin會發(fā)生重組和再分布，細胞中央出現(xiàn)大量呈束狀密集排列的應力纖維，導致細胞中心張力增高，加速細胞收縮，引起凋亡壞死，最終導致細胞通透性增高。TER是評價緊密連接蛋白完整性的指標之一，常用于反映細胞通透性。一般而言，微血管內(nèi)皮細胞的通透性與細胞跨膜電阻的變化成反比，即細胞跨膜電阻升高則細胞通透性降低，細胞跨膜電阻降低則細胞通透性升高。因此，TER的測量可反映微血管內(nèi)皮細胞的通透性。本研究觀察到，煙曲霉處理后PMVECs F-actin染色的熒光強度顯著下降(P<0.01)，煙曲霉處理組也出現(xiàn)細胞跨膜電阻值的顯著下降(P<0.01)。以上結果表明，煙曲霉感染PMVECs導致其通透性升高。

本研究進一步探討了煙曲霉致PMVECs通透性升高的機制。與單獨煙曲霉處理組比較，SB203580(20μmol/L, p38 MAPK抑制劑)干預組、Y27632(20μmol/L, ROCK抑制劑)干預組以及LY317615(10μmol/L,蛋白激酶C抑制劑)干預組的跨膜電阻值均顯著上升(P<0.05)。有絲分裂原激活的蛋白激酶(mitogen activated protein kinases, MAPK)信號通路是真核細胞內(nèi)最普遍的信號調(diào)節(jié)機制之一。MAPK信號通路參與調(diào)節(jié)細胞骨架的聚合及穩(wěn)定性，并且影響相關的細胞活動，如細胞分裂、細胞黏附、遷移等。迄今為止，在哺乳動物內(nèi)已發(fā)現(xiàn)多種MAPK家族亞群，如細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-regulated protein kinase, ERK)通路、c-jun氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinase, JNK)通路，p38 MAPK通路等。有研究[12]表明，p38 MAPK通路激活后引起微絲重排及相關細胞形態(tài)的改變，p38 MAPK激酶還可通過影響微絲的完整性及穩(wěn)定性調(diào)節(jié)細胞的凋亡或再分化等[13]。本研究結果表明，p38 MAPK信號通路可能參與煙曲霉致PMVECs通透性的改變，也提示p38 MAPK有可能成為煙曲霉感染的潛在治療靶點之一。ROCK屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員，是小G蛋白家族成員Rho A的下游靶效應分子。Rho A/ROCK信號通路是體內(nèi)普遍存在的一條信號通路，此通路可能通過一個復雜的磷酸化/脫磷酸化級聯(lián)反應調(diào)節(jié)微絲骨架的聚合，控制微血管內(nèi)皮細胞的諸多生物學行為，是內(nèi)皮功能調(diào)節(jié)的重要信號分子[14-15]。本研究結果也表明，ROCK信號通路可能參與煙曲霉致PMVECs通透性的改變，據(jù)此推測，ROCK信號通路可能是煙曲霉感染介導的PMVECs功能損傷的重要調(diào)控靶位之一。本研究還表明，PKC信號通路可能參與煙曲霉致PMVECs通透性的改變。蛋白激酶C(PKC)也屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，是細胞內(nèi)的重要信號轉導分子，它的激活是導致內(nèi)皮細胞功能紊亂的關鍵因素之一[16-17]。關于血管內(nèi)皮屏障功能障礙的研究顯示，肌球蛋白輕鏈(myosin light chain, MLC)磷酸化可引起細胞骨架重組。肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase, MLCK)和Rho激酶對MLC磷酸化水平的調(diào)節(jié)作用在細胞骨架重組起重要作用，而PKC也是MLCK的上游激活分子之一。據(jù)此推測，PKC通路通過維持MLC磷酸化水平，從而促發(fā)肌動-肌球蛋白絲收縮，進而引起內(nèi)皮細胞骨架結構和收縮狀態(tài)的改變，最終導致內(nèi)皮細胞通透性的改變。因此，PKC通路可能是介導煙曲霉改變HPMVECs通透性的信號途徑之一。

綜上所述，本研究結果顯示，煙曲霉處理致PMVECs通透性增加，其機制可能涉及p38 MAPK、ROCK激酶以及蛋白激酶C通路，有必要開展進一步的深入研究以揭示更加精確的機制。