安學鳳， 李姝君， 俞作仁， 韓　晶

(1. 同濟大學附屬東方醫(yī)院乳腺外科，上?！?00120; 2. 同濟大學附屬東方醫(yī)院醫(yī)學轉化研究中心，上?！?00120;3. 大連醫(yī)科大學，大連　116023)

乳腺癌是全球女性癌癥死亡的主要原因之一。2012年，調查發(fā)現(xiàn)乳腺癌占所有癌癥病例數(shù)的25%，且15%的女性死于乳腺癌[1]。乳腺癌的早期診斷可以使患者獲得更好的手術和治療的時機，并有效延長患者的生命[2]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)microRNA(miRNA)與腫瘤的發(fā)展、轉移、浸潤、復發(fā)以及對放化療藥物的抗性具有密切關系[3-4]，其在乳腺癌患者血液中的差異性表達還可以成為早期乳腺癌檢測的生物標志物[5]。但目前大多數(shù)相關研究均局限于正常人群和乳腺癌人群，并沒有將兩者的中間階段(非典型增生人群)納入研究。本研究對乳腺正常、非典型增生、原位癌、浸潤癌4個階段患者的組織和血液樣本分別進行miRNA高通量測序和RT-qPCR實時定量檢測，以得到與乳腺癌發(fā)生發(fā)展相關的特異性miRNA，并對其診斷早期乳腺癌的可行性進行分析研究，從而得到更能準確診斷早期乳腺癌的特異性血清miRNA。

1　材料與方法

1.1　一般資料

收集2016年11月至2017年7月，在同濟大學附屬東方醫(yī)院治療的4例乳腺組織樣本和96例血液樣本。其中正常組織取自乳腺良性病變周圍組織。乳腺組織樣本(1cm×1cm)均經(jīng)過病理活檢確診，分別是： 乳腺正常組織、乳腺非典型增生組織、乳腺原位癌組織和乳腺浸潤性癌組織。組織樣本收取后立即放入EP管置于-80℃冰箱凍存直至送出進行miRNA高通量測序。

本研究中96例血液樣本，包括從東方醫(yī)院健康體檢中心招募的24例30歲以上女性志愿者的正常對照血液樣本、10例非典型增生患者血液樣本、22例原位癌患者血液樣本、40例浸潤癌患者血液樣本。本研究收集的血液標本患者年齡均在30歲以上且乳腺腫瘤淋巴結轉移分期(TNM)為早期，包括乳腺原位癌、乳腺浸潤性癌I、II期。術前獲得乳腺疾病患者的血液樣本，排除具有以下特征的患者： (1) 收集血清前接受化療和(或)放療;(2) 同時(或)先前診斷具有其他癌癥者?？刂平】抵驹刚叩臉藴拾ㄟ^去半年內無任何癌癥或住院史。本研究由我院倫理委員會批準。

將患者的靜脈血收集到含有EDTA的Vacuette血清凝塊活化劑無凝膠管中，將其在冰上保存15～30min，隨后在4℃離心(離心半徑16cm，3000r/min，離心5min)沉淀血細胞，后將上清液分裝在不含RNA的2mL試管中，各500μL，儲存于-80℃直至進一步使用。

1.2　RNA的提取與反轉錄

根據(jù)實驗方案，使用TRIzol LS試劑(英杰生命科技有限公司)從200μL血清中提取RNA，溶解于10μL焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的水中，用于反轉錄反應。通過NanoDrop 2000(賽默飛世爾科技有限公司)對RNA濃度進行定量檢測。RNA反轉錄反應如下進行： 在8μL DEPC水中溶解500ng RNA，在室溫下用DNase和DNase緩沖液(默金斯生物技術有限公司)純化15min，進而加DNase 反應終止劑(默金斯生物技術有限公司)置于70℃水浴箱中5min，終止前面反應。然后添加至終體積為14μL轉錄混合物，進行下列操作： 37℃水浴箱90min和95℃水浴箱5min。合成的cDNA保存在-80℃冰箱中。

1.3　目標miRNA的選擇

根據(jù)乳腺癌發(fā)生發(fā)展的過程： 正常(H1)、非典型增生(H10)、原位癌(H17)、浸潤癌(H18)，收集了各階段1例患者的乳腺組織。將收集4個階段組織的EP管放入干冰盒中，送到基因測序公司進行miRNA高通量測序。

1.4　實驗內參選擇的理論依據(jù)

研究[6-7]證明，miR-16在乳腺癌病變組織及病變周圍正常組織中表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，正常對照組血液樣本及乳腺癌患者血液樣本中均穩(wěn)定表達且差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，可以成為相關研究的內參。

1.5　RT-qPCR的實時定量檢測方法

使用SYBR Green熒光染料(默金斯生物技術有限公司)進行RT-qPCR定量檢測miRNA，在Quant Studio 6 Flex實時定量分析PCR系統(tǒng)上進行分析。在含有1μL cDNA，0.5mmol/L引物和1× SYBR Green的終體積為10μL中進行反應。PCR條件如下： 首先在95℃變性10min，隨后是95℃ 15s和60℃ 60s各40個循環(huán)，在此期間獲得熒光。熔解曲線從60～95℃獲得。使用以下公式計算倍數(shù)變化： RQ=2-ΔΔCt，其中ΔΔCt=(CtmiRNA-CtmiR16)疾病組-(CtmiRNA-CtmiR16)對照組平均值。Ct值>38則認為是不可能的擴增并棄掉。

1.6　目標miRNA在血清分析時的分組

由于高通量測序的組織樣本較少且來自不同個體，所得結果具有一定的不準確性和個體差異性的偏倚可能，因此應用大量血清樣本進行目標miRNA在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中變化趨勢的驗證，以得到較為準確的結果。應用公式計算出目標miRNA的RQ值。每種目標miRNA的RQ值分為正常組、非典型增生組、原位癌組和浸潤癌組，進行獨立樣本Kruskal-Wallist檢驗。

對在組織和血清中變化趨勢相似的miRNA的RQ值進一步分組，正常組和早期乳腺癌組(原位癌，Ⅰ期、Ⅱ期浸潤癌)并進行Mann-WhitneyU檢驗。

1.7　統(tǒng)計學處理

統(tǒng)計學分析使用SPSS 20.0軟件，進行獨立樣本t檢驗、Mann-WhitneyU檢驗和Kruskal-Wallist檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結　　果

2.1　miR-16作為內參的實驗驗證

miR-16在正常對照組、非典型增生組、原位癌組和浸潤癌組中的Ct值的中位數(shù)(范圍)分別是： 23.78(21.98～25.95)、24.1(21.79～26.25)、23.21(21.81～26.14)和23.4(21.58～26.25)，Kruskal-Wallist檢驗分析結果顯示各組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖1。因此，miR-16可以作為本研究的內參。

2.2　目標miRNA的選擇確定

將乳腺癌發(fā)生發(fā)展的4個階段組織送去基因測序公司進行miRNA高通量測序，并對測序結果進行分析，得到隨疾病進展呈明顯遞減表達的6種miRNAs(hsa-miR-144-5p、hsa-miR-451a、hsa-miR-486-5p、mir-132-x、mir-486-x、mir-6510-y)，見圖2。其中mir-132-x、mir-486-x、mir-6510-y為鼠源性miRNA，因此不納入研究。最終確定研究目標為hsa-miR-144-5p(miR-144)、hsa-miR-451a(miR-451a)和hsa-miR-486-5p(miR-486)。

圖1　miR-16在4組中的Ct值Fig.1　The value of miR-16 in healthy control,atypical hyperplasia, carcinoma in situ and invasive breast cancer groups

圖2　miRNA高通量測序分析結果熱圖Fig.2　The heat map of miRNA high-throughput sequencing analysisH1為乳腺正常組織，H10為乳腺非典型增生組織，H17為乳腺原位癌組織，H18為乳腺浸潤性癌組織

2.3　目標miRNA在血清中的表達

將高通量測序所得的目標miRNA(miR-144、miR-451a和miR-486)進行血清RT-qPCR的檢測分析。統(tǒng)計學分析結果顯示miR-144和miR-451a差異均無統(tǒng)計學意義且表達趨勢無規(guī)律(P>0.05)，僅miR-486差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。miR-486在4個階段患者血清中的表達不僅有統(tǒng)計學差異，同時其表達的趨勢與高通量測序結果相近即隨疾病的進展逐漸降低，見圖3。因此，miR-486與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展具有密切相關性。

圖3　血清miR-486在4組中的表達Fig.3　Comparison of miR-486 expression levels in four groups

2.4　血清miR-486診斷早期乳腺癌的可行性分析

與正常對照組相比，早期乳腺癌組血清miR-486的檢測分析結果差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖4A。繪制ROC曲線檢驗所得統(tǒng)計學差異性結果的準確性，分析結果顯示： cut-off值為0.528，AUC值為81.2%，95%CI為0.707～0.917，靈敏度和特異度分別為62.5%和90.3%，見圖4B。以上結果顯示，血清miR-486可以準確地診斷早期乳腺癌并具有較高的靈敏度和特異度。

圖4　血清miR-486診斷早期乳腺癌的可行性Fig.4　The feasibility of serum miR-486 in diagnosing early-stage breast cancerA： 血清miR-486在健康組與早期乳腺癌組中的表達; B： 診斷早期乳腺癌的ROC曲線圖

2.5　miR-486在乳腺癌不同亞型中的表達

臨床上根據(jù)雌激素受體(estrogen receptor, ER)、孕激素受體(progesterone receptor, PR)、人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2, Her2)、人表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor, EGFR)以及Ki67將乳腺癌分為4個亞型，見表1。本研究將miR-486的RQ值分為Luminal A組、Luminal B組、Her2過表達組以及基底型組并進行統(tǒng)計學分析，以便檢測miR-486與乳腺癌亞型之間的關系，結果顯示各組之間并無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，見圖5。

表1　乳腺癌臨床分子分型

圖5　血清miR-486在乳腺癌4種亞型中的表達Fig.5　The expression of serum miR-486 in different breast cancer subtypes patients

3　討　　論

乳腺癌目前公認的發(fā)病機制為“多階段發(fā)展模式學說”，即乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程是： 乳腺正常組織、乳腺非典型增生、乳腺原位癌、乳腺浸潤性癌[8]，而此發(fā)展過程的機制目前尚不明確。雖然乳腺非典型增生是從正常組織到惡性改變的中間階段，是由量變到質變的關鍵點，但從治療上來說，非典型增生只需要局部手術、術后隨訪即可；早期乳腺癌和中晚期乳腺癌患者在治療上也存在較大的差異性，前者的手術范圍更小且可以根據(jù)患者情況選擇性進行保乳手術，并且總生存期和無進展生存期延長，患者的生活質量更高。因此，乳腺癌早期甚至其癌前病變的診斷具有重要的臨床意義。

miRNA是一種與腫瘤特異性表達相關的非編碼小RNA，有19～25個核苷酸序列，通過靶向mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)導致mRNA降解或抑制其翻譯來調節(jié)基因表達。研究發(fā)現(xiàn)，某些特定的miRNA可以從癌癥組織中釋放進入血液循環(huán)系統(tǒng)，并且在目前尚未明確的機制下被保護免于內源性RNA酶水解，進而在血液中可以穩(wěn)定地表達，是診斷癌癥的潛在生物標志物[9]。近年研究發(fā)現(xiàn)，多種血清miRNAs在正常人群與乳腺癌患者血清或組織中表達存在差異性，可作為診斷早期乳腺癌的生物標志物[10-12]。然而，目前幾乎所有與血清miRNA診斷早期乳腺癌相關的研究均局限于正常人群和乳腺癌人群，并沒有將血清miRNA與乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程緊密相連而進行研究。因此，實驗所得的早期乳腺癌診斷相關的血清miRNA較為廣泛，不具有特異性。

本試是首個將乳腺癌發(fā)生發(fā)展的4個階段(正常、非典型增生、原位癌、浸潤癌)均納入為研究對象的研究。其中，由于乳腺非典型增生的發(fā)病率低(3%～4%)[13]，影像學診斷無法與乳腺良性腫瘤區(qū)分，造成多數(shù)患者在就診時已發(fā)展到乳腺癌階段；因此，臨床樣本的收集較困難，僅獲得10例血液樣本。通過對4個階段組織進行miRNA高通量測序和對24例正常、10例非典型增生、22例原位癌以及40例早期乳腺癌患者血清進行RT-qPCR檢測分析，最后獲得miR-486與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展最為密切的證據(jù)。雖然RT-qPCR的分析結果顯示，血清miR-486在正常對照組與其在乳腺非典型增生組的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),但仍可以看出其在組織和血液中均隨疾病進展呈明顯下降變化趨勢。此外，對miR-486在正常人群和早期乳腺癌患者(原位癌Ⅰ、Ⅱ期)血清表達量的統(tǒng)計學分析結果顯示，其在早期乳腺癌患者血清中呈顯著低表達并與正常對照差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，而在不同分子分型乳腺癌中的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；ROC曲線分析結果顯示，AUC值為81.2%(95%CI=0.707～0.917)，以及其診斷早期乳腺癌的靈敏度和特異度分別高達62.5%和90.3%。過表達的miR-486可通過靶向癌基因PIM-1顯著抑制乳腺癌細胞的增殖，誘導G0/G1停滯并促進癌細胞凋亡[14]。在MCF-7乳腺癌細胞中，miR-486的高表達可以有效調節(jié)Smad2，抑制上皮間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的發(fā)生，進而達到降低乳腺癌細胞轉移和侵襲的能力[15]。因此推斷，miR-486在乳腺癌中可能發(fā)揮著抑癌基因的作用，不僅可以作為診斷早期乳腺癌的生物標志物，還可能成為治療乳腺癌的一個新靶點。

關于miR-486在其他腫瘤的功能，研究[16]表明： miR-486通過靶向胰島素生長因子(insulin growth factor, IGF)信號轉導的成分，包括IGF1、IGF1受體(IGF1R)和磷酸肌醇-3-激酶，調節(jié)亞基1(alpha)等，在非小細胞肺癌中發(fā)揮著抑癌基因的作用；同時ANK1的甲基化可以降低miR-486在非小細胞肺癌中的表達[17]，其在血清中的低表達可以作為非小細胞肺癌的診斷標志物[18]；過表達的miR-486可以通過靶向PIK3R1和刺激磷脂酰肌醇3-激酶-AKT活化抑制肝細胞癌的進展[19]，并增加肝細胞癌對于化療藥物的敏感性[20]；同樣，miR-486也可以抑制結直腸癌[21]、骨癌[22-23]和食管癌[24]細胞的增殖、遷移和浸潤。值得注意的是： miR-486在慢性粒細胞白血病中卻呈上調狀態(tài)，通過抑制miR-486的表達可以有效減緩慢性粒細胞白血病祖細胞的生長和促進癌細胞的凋亡[25]；在前列腺癌中，miR-486通過直接靶向多種負調控因子(PTEN/P13K/Akt/，F(xiàn)OXO)驅動腫瘤的發(fā)展[26]。由此可見，miR-486在不同腫瘤中發(fā)揮著差異性的作用(抑癌作用或促癌作用)，可以為癌癥的特異性診斷和治療提供新思路。

本研究還具有一定的不足之處： 組織及血液樣本的收集還需要進一步的完善，并應加強乳腺非典型增生樣本量的收集。接下來的研究則會收集大量組織及血液樣本進行RT-qPCR，以進一步驗證分析結果，并對miR-486在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用機制進行研究。

綜上所述，miR-486在乳腺癌發(fā)生發(fā)展的過程中呈逐漸下調趨勢，并且其在早期乳腺癌患者的血清中呈顯著的低表達，可以作為特異性診斷早期乳腺癌的生物標志物。