白春杰　哈申高娃

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)通遼市食品藥品檢驗(yàn)所，內(nèi)蒙古　通遼　028000；　2.內(nèi)蒙古自治區(qū)通遼市科左后旗疾病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古　科左后旗　028100)

尖葉假龍膽來(lái)源于龍膽科植物尖葉假龍膽Gentianella acuta(Michx)Hulten的干燥全草。蒙名：阿古特-其其格，別名：苦龍膽，藥用同肋柱花，是蒙、藏藥中常見(jiàn)的5～6種地格達(dá)之一。屬一年生草本，產(chǎn)于赤峰西部、錫林郭勒盟東部及南部、大青山、蠻汗山、烏拉山、賀蘭山。分布于我國(guó)山西、寧夏、新疆；蒙古、俄羅斯(西伯利亞、遠(yuǎn)東地區(qū))、北美也有。生于山地林下、灌叢及低濕草甸，海拔1500M以下[1-2]。根據(jù)資料記載及內(nèi)蒙古習(xí)慣性用藥定名為“尖葉假龍膽”，并作為正名收入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。主治：黃疸，頭痛，發(fā)熱，口干，未成熟熱，膽熱。

齊墩果酸為尖葉假龍膽中所含的有效成分之一，屬于香樹(shù)脂醇型五環(huán)三萜類化合物，又名慶四素，土當(dāng)歸酸[3]廣泛存在于自然界多種植物中。研究表明，齊墩果酸毒性很低，具有抗病毒，抗炎，增強(qiáng)免疫和抑制免疫(免疫雙向調(diào)節(jié)作用)，抑制血小板凝集，降血脂，降糖，保肝，護(hù)腎，抗艾滋病毒等多種生物活性[4]。本文采用高效液相色譜法，測(cè)定6種不同來(lái)源的尖葉假龍膽中齊墩果酸的含量并加以比較，為尖葉假龍膽含量測(cè)定的進(jìn)一步研究提供參考依據(jù)。

1　儀器和試劑

1.1儀器ters e2695-2998型高效液相色譜儀(美國(guó)產(chǎn))，Empower 2色譜工作站，KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器，AE-163 型電子天平(梅特勒托利多)色譜柱：Inertsil ODS-SP C18柱 (150 ×4.6mm，粒度5μm)。

1.2試藥與試劑乙腈、甲醇為色譜純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；水為試驗(yàn)用高純水。其它試劑為分析純。

1.3藥材及對(duì)照品6種不同來(lái)源尖葉假龍膽，1號(hào)樣：購(gòu)于內(nèi)蒙古阿拉善蒙醫(yī)院；2號(hào)樣：采集于內(nèi)蒙古阿拉善賀蘭山南寺；3號(hào)樣：采集于內(nèi)蒙古呼倫貝爾市根河觀光大道旁；4號(hào)樣：采集于內(nèi)蒙古呼倫貝爾市根河滿歸鎮(zhèn)路邊；5號(hào)樣：采集于內(nèi)蒙古呼倫貝爾市根河林業(yè)局喇嘛溝附近；6號(hào)樣：購(gòu)于黑龍江省漠河縣特產(chǎn)店。齊墩果酸對(duì)照品購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢驗(yàn)研究院(110709-201607，使用前置五氧化二磷減壓干燥器中干燥12h以上)。

2　方法學(xué)考察

2.1色譜條件流動(dòng)相：乙腈-甲醇-0.05%乙醇胺溶液(68：15：17)；流速0.6mL/min；柱溫25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm；進(jìn)樣量：10μL。

2.2溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液的制備精密稱取齊墩果酸對(duì)照品19.89mg置25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1.5mL置10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2供試品溶液的制備： 取6批全草粉碎后過(guò)4號(hào)篩，精密稱取本品細(xì)粉0.5g置50mL具塞三角瓶中，精密加入甲醇25mL，稱重，浸泡2h，超聲提取30分鐘，放冷，再稱重，用甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，以0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3線性關(guān)系的考察精密量取上述對(duì)照品溶液(19.89mL→25mL)0.125mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL和2.5mL，各置10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取10μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖及峰面積值，以峰面積(A)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明齊墩果酸在10μg/mL～200μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為：Y=8685.78X-838.30，r=0.9999。

2.4精密度試驗(yàn)精密量取對(duì)照品溶液(100μg/mL)10μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定對(duì)照品峰面積，結(jié)果峰面積平均值為876494，RSD=0.69%，表明本實(shí)驗(yàn)精密度良好。

2.5穩(wěn)定性試驗(yàn)精密量取同一批供試品溶液(1號(hào)樣品)10μL，分別于0、2、4、6、8、10、12h注入液相色譜儀，測(cè)定并記錄峰面積值，結(jié)果峰面積平均值為883297，RSD=0.72%，表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)取同一供試品細(xì)粉(1號(hào))6份，精密稱取各0.5g，按2.2.2制備成供試品溶液，并按上述色譜條件測(cè)定每份供試品峰面積值，按外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果平均含量為5.0357mg/g，RSD=0.45%，表明本試驗(yàn)重現(xiàn)性良好。

2.7加樣回收率試驗(yàn)精密稱取含量為5.0357mg/g的供試品6份，各0.25g，置50mL具塞三角瓶中，精密加入對(duì)照品溶液(20.12mg→25mL)1.5mL，再精密加入甲醇23.5mL，按2.2.2制備成供試品溶液，并按上述色譜條件測(cè)定每份供試品峰面積值，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

3　樣品含量測(cè)定

取2.2.1項(xiàng)下方法制備對(duì)照品溶液及2.2.2項(xiàng)下方法制備的6批供試品溶液各10μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖及峰面積值，測(cè)得對(duì)照品峰面積平均值為1034193，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算每批供試品含量，結(jié)果見(jiàn)表2。該條件下齊墩果酸峰保留時(shí)間為15.2min。

表2　樣品中齊墩果酸含量測(cè)定結(jié)果

4　空白干擾試驗(yàn)

精密吸取空白溶劑10μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果：溶劑在與齊墩果酸相對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間處無(wú)色譜峰，表明溶劑對(duì)齊墩果酸的含量測(cè)定無(wú)干擾。對(duì)照品、樣品和空白溶劑色譜峰及對(duì)照品、樣品3D圖譜，見(jiàn)圖1～2。

5　討論

5.1含量測(cè)定本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)6種不同來(lái)源的尖葉假龍膽中齊墩果酸的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果6種藥材含齊墩果酸都較高，且差別不特別明顯(5.02～7.07mg/g)，均是很好的蒙藥材來(lái)源。

5.2樣品測(cè)定試驗(yàn)供試品分別浸泡2h、4h與過(guò)夜，超聲處理20min、30min、40min，結(jié)果浸泡2h，超聲30min即可達(dá)到良好提取。

5.3檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定齊墩果酸的吸收光譜，并參照文獻(xiàn)報(bào)道[5-7]，確定測(cè)定波長(zhǎng)為210nm。

5.4系統(tǒng)適用性試驗(yàn)理論塔板數(shù)>8000，拖尾因子為0.96。檢測(cè)過(guò)程中系統(tǒng)較穩(wěn)定。若長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)測(cè)定(超過(guò)48h)，柱壓會(huì)持續(xù)升高，若大批量測(cè)定建議間隔一定時(shí)間徹底沖洗色譜柱。

5.5本方法操作簡(jiǎn)便易行，靈敏度高，準(zhǔn)確性好，專屬性強(qiáng)，能有效控制尖葉假龍膽中齊墩果酸含量，為齊墩果酸的含量測(cè)定提供參考。