宋冠軍，趙 平，周 琦

（中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430074）

二型糖尿病是一種非胰島素依賴性的糖尿病?，F(xiàn)在90%以上的糖尿病都是二型糖尿病[1]。對(duì)于二型糖尿病的治療，注射胰島素并不能很好的控制病情，甚至可能使病情加重，因此，尋找能從根本上治療二型糖尿病的藥物就更為重要。

許多味道苦的物質(zhì)都體現(xiàn)了其較好的抗糖作用[2]。例如苦瓜[3]，小檗堿[4]，這些苦物質(zhì)通常都可以用來(lái)清熱降火。作為苦物質(zhì)的代表——氯喹，最初是用來(lái)治療瘧疾的藥物。隨著研究的深入，它的許多其他的作用也不斷被科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)。早在1991年時(shí)，就有科學(xué)家指出，氯喹可以增加胰島素的作用來(lái)促進(jìn)葡萄糖的攝取，但其具體的作用機(jī)制目前仍不清楚。

GLUT4是在骨骼肌葡萄糖代謝中一個(gè)非常重要的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體[5]，在本研究中，我們主要以GLUT4作為藥物研究的一個(gè)靶點(diǎn)，研究氯喹對(duì)L6細(xì)胞內(nèi)GLUT4轉(zhuǎn)位的影響并嘗試進(jìn)一步研究它的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

穩(wěn)定表達(dá)轉(zhuǎn)染了紅色熒光蛋白IRAP-mOrange的L6細(xì)胞：IRAP-mOrange-L6。

1.2 抗體及阻斷劑

Wortmannin（Sigma），G?6983（EMD Millipore），F(xiàn)luo-4 AM（Camarillo，CA，USA）。

1.3 細(xì)胞生理溶液

PSS生理鹽溶液（含2mM的Ca2+）（mM）：135 NaCl，5 KCl，1 MgCl2，2 CaCl2，10 HEPES，10 glucose，用NaOH調(diào)PH=7.4。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 利用激光共聚焦顯微鏡監(jiān)測(cè)L6細(xì)胞GLUT4轉(zhuǎn)位

之前有研究證明，受胰島素調(diào)節(jié)的氨基肽酶IRAP和GLUT4蛋白存在高度共定位關(guān)系，同時(shí)，許多實(shí)驗(yàn)已證明IRAP能夠作為一種報(bào)告分子反映GLUT4的轉(zhuǎn)運(yùn)狀況。借助這一機(jī)理，通過(guò)L6細(xì)胞質(zhì)膜上IRAP-mOrange熒光強(qiáng)度的動(dòng)態(tài)變化，我們能夠間接地檢測(cè)GLUT4蛋白轉(zhuǎn)位的變化，首先，我們將IRAP-mOrange-L6細(xì)胞接種在無(wú)菌蓋玻片上，放回于培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)使其貼壁。然后用不含血清的α-MEM培養(yǎng)液饑餓細(xì)胞2 h，再用配好的PSS溶液清洗。之后，將細(xì)胞放在激光掃描共聚焦顯微鏡下，加入1 mM氯喹，在555 nm激發(fā)波長(zhǎng)下觀測(cè)IRAP-mOrang熒光的變化。加藥后，每5分鐘拍一張照片共拍5個(gè)循環(huán)，一直拍照記錄到加藥后的30 min。記錄數(shù)據(jù)并利用Origin軟件進(jìn)行分析。

1.4.2 利用激光共聚焦顯微鏡監(jiān)測(cè)L6細(xì)胞內(nèi)的Ca2+水平

饑餓細(xì)胞之前的步驟同檢測(cè)IRAP相同。用PSS溶液洗掉沒(méi)有血清的α-MEM培養(yǎng)液后。利用2 mM的Fluo-4 AM在室溫下避光孵育L6細(xì)胞20 min，將細(xì)胞內(nèi)鈣離子標(biāo)記上綠色熒光，接下來(lái)用溫浴后的PSS溶液將Fluo-4 AM洗去，在激光共聚焦顯微鏡下，在488 nm激發(fā)波長(zhǎng)下觀察L6細(xì)胞中綠色熒光強(qiáng)度的變化。記錄數(shù)據(jù)并分析，繪制折線圖反映細(xì)胞中Fluo-4的熒光強(qiáng)度變化。

2 結(jié) 果

2.1 氯喹促進(jìn)GLUT4的轉(zhuǎn)運(yùn)上膜

我們通過(guò)檢測(cè)L6細(xì)胞中IRAP紅色熒光蛋白（IRAP-mOrange）來(lái)反映GLUT4在細(xì)胞膜上的定位。隨著氯喹的加入，可以觀察到L6細(xì)胞膜上的紅色熒光越來(lái)越明顯（圖2.1A）。數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)加入1mM的氯喹后L6細(xì)胞膜上的熒光強(qiáng)度與加藥前相比顯著升高（圖2.1B）。

圖2 .1 氯喹促進(jìn)GLUT4的轉(zhuǎn)運(yùn)

（A）通過(guò)confocal觀察在L6細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)的IRAP紅色熒光蛋白，隨著氯喹的加入，IRAP在細(xì)胞膜上的熒光強(qiáng)度明顯的增強(qiáng)。圖中比例尺=50 μm。（B）對(duì)L6細(xì)胞膜上的IRAP-mOrange熒光強(qiáng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)在加入1mM的氯喹后的30 min內(nèi)，L6細(xì)胞膜上的IRAP-mOrange熒光強(qiáng)度保持顯著的增強(qiáng)。

2.2 氯喹可以通過(guò)Akt/PI3K信號(hào)通路來(lái)增強(qiáng)GLUT4的轉(zhuǎn)運(yùn)

我們利用Akt/PI3K阻斷劑wortmannin（100 nM）作用細(xì)胞30 min，我們發(fā)現(xiàn)wortmannin對(duì)氯喹引起的Ca2+的增加起到了一定的抑制作用（圖2.2下），但具體的作用機(jī)制還有待我們進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)和探討。另外，wortmannin抑制了L6細(xì)胞中氯喹刺激的IRAP熒光強(qiáng)度的增加（圖2.2上）。這證明氯喹確實(shí)可以通過(guò)Akt通路來(lái)刺激GLUT4的轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而促進(jìn)葡萄糖的吸收。

圖2 .2 PI3K的抑制劑可以阻斷氯喹刺激的GLUT4的轉(zhuǎn)運(yùn)

wortmannin抑制了GLUT4到細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)（上）。同時(shí)，wortmannin也明顯的降低了氯喹刺激的Ca2+的升高（下）。***：P＜0.001。該實(shí)驗(yàn)證明Akt/PI3K確實(shí)參與了氯喹刺激的GLUT4的轉(zhuǎn)運(yùn)。

2.3 氯喹可以通過(guò)PKC信號(hào)通路來(lái)增強(qiáng)GLUT4的轉(zhuǎn)運(yùn)

接下來(lái)，我們用PKC的抑制劑G?6983（10 μM）作用L6細(xì)胞30 min后，加入1mM氯喹之后用激光共聚焦顯微鏡監(jiān)測(cè)L6細(xì)胞中IRAP-mOrange的熒光強(qiáng)度。結(jié)果表明G?6983顯著抑制了氯喹引起的GLUT4的轉(zhuǎn)位（圖2.3上）；同時(shí)，G?6983對(duì)氯喹引起的Ca2+的增加沒(méi)有影響（圖2.3下）。這個(gè)實(shí)驗(yàn)證明PKC參與了氯喹誘導(dǎo)的GLUT4的轉(zhuǎn)運(yùn)。

圖2 .3 PKC抑制劑作用會(huì)抑制氯喹刺激的GLUT4的轉(zhuǎn)運(yùn)

與正常細(xì)胞相比，G?6983明顯的抑制了GLUT4到細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)（上）；然而卻沒(méi)有減少氯喹刺激的L6細(xì)胞內(nèi)Ca2+的增加（下）。***：P＜0.001。

3 討 論

有報(bào)道稱氯喹可以增強(qiáng)胰島素抵抗病人中葡萄糖的攝取[6]。然而，對(duì)于氯喹抗糖機(jī)制以及其相對(duì)應(yīng)的機(jī)制仍不清楚。本課題就針對(duì)氯喹在治療二型糖尿病方面的潛在作用機(jī)制進(jìn)行了研究。

實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)氯喹可以促進(jìn)GLUT4的轉(zhuǎn)運(yùn)上膜，為了進(jìn)一步研究其作用機(jī)制。我們分別用wortmannin和G?6983處理L6細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)wortmannin能抑制氯喹引起的GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)的增加和胞內(nèi)Ca2+的增加，而G?6983顯著抑制了氯喹引起的GLUT4的轉(zhuǎn)位，但對(duì)氯喹引起的Ca2+的增加沒(méi)影響。證明氯喹是通過(guò)Akt/PI3K和PKC信號(hào)通路增強(qiáng)L6細(xì)胞內(nèi)GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)。同時(shí)，氯喹能通過(guò)Akt/PI3K信號(hào)通路促進(jìn)胞內(nèi)Ca2+的增加，結(jié)合之前報(bào)道，氯喹誘導(dǎo)的胞內(nèi)Ca2+的增加能促進(jìn)L6細(xì)胞內(nèi)GLUT4與細(xì)胞質(zhì)膜的融合[7]。這些結(jié)果說(shuō)明氯喹可能開(kāi)發(fā)為一種新的潛在的降血糖藥物。當(dāng)然，我們的研究也存在著不足。我們目前缺乏氯喹在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)上的數(shù)據(jù)。未來(lái)我們將通過(guò)獲得不同類型的二型糖尿病小鼠，直接觀測(cè)藥物對(duì)其血糖以及生命活動(dòng)的影響，從而進(jìn)一步確認(rèn)氯喹的可靠性與安全性。