齊鶴鳴,　韓　深,　呂美玲,　尹志強(qiáng),　嚴(yán)　華,　李建輝,　崔鳳云*

(1. 北京出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心, 北京 100026; 2. 安捷倫科技(中國)有限公司, 北京 100102)

在現(xiàn)代畜禽養(yǎng)殖中,一些不法分子長期大量使用各種飼料添加劑和人工激素類藥物,造成動(dòng)物源性食品中的藥物殘留,最終成為食源性興奮劑的來源[1]。運(yùn)動(dòng)員誤服含有某些藥物殘留的食物,可導(dǎo)致其興奮劑檢測呈陽性。國家認(rèn)監(jiān)委規(guī)定的違禁興奮劑藥物主要包括β-受體激動(dòng)劑、類固醇激素、糖皮質(zhì)激素和玉米赤霉醇四大類[1]。長期攝入這四類激素類藥物會(huì)嚴(yán)重影響人類健康,因此世界各國十分重視激素類藥物的使用。我國農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告中規(guī)定倍他米松、地塞米松在?；蜇i肌肉組織中的最高限量均為0.75 μg/kg;克倫特羅、沙丁胺醇、丙酸睪酮、玉米赤霉醇和群勃龍不得在動(dòng)物源性食品中檢出;氫化可的松僅可外用,但未規(guī)定其最高殘留限量值[2]。歐盟規(guī)定潑尼松龍?jiān)谂Ｈ饨M織中的最高殘留量為4 μg/kg,地塞米松和倍他米松在牛、豬的肌肉中最高殘留限量為0.75 μg/kg[3]。

目前,測定食品中激素殘留的方法主要有酶聯(lián)免疫法[4]、高效液相色譜法(HPLC)[5]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)[6-9]及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[10-21]等。酶聯(lián)免疫法雖簡單快速,但易出現(xiàn)假陽性結(jié)果;HPLC僅靠保留時(shí)間定性,抗干擾能力差且靈敏度不能滿足殘留檢測要求;GC-MS/MS前處理步驟需衍生,較為繁瑣;LC-MS/MS可同時(shí)檢測多種目標(biāo)化合物,且樣品不需衍生化處理,彌補(bǔ)了上述方法的諸多不足,使該技術(shù)在殘留分析中得到廣泛應(yīng)用。

在前處理方面,凈化方法一般分為兩種,一種是固相萃取法,另一種是QuEChERS法。在固相萃取法中,大部分文獻(xiàn)[10-13]采用反相柱(HLB柱或C18柱)與氨基柱串聯(lián),雖然凈化效果好,但前處理過程復(fù)雜,耗時(shí)長,效率低;部分文獻(xiàn)選用MCX柱[14,15]或C18柱凈化[16-18],前處理過程相對(duì)簡單,但分析的激素種類單一。與傳統(tǒng)固相萃取柱相比,QuEChERS法可以同時(shí)凈化多種化合物,減少樣品轉(zhuǎn)移的過程,溶劑使用量少,操作簡便,回收率、精確度和準(zhǔn)確度均較好。但大部分文獻(xiàn)[19-21]只針對(duì)單種類激素或除β-受體激動(dòng)劑外多種類激素的提取和凈化。近年來基于體積排阻和疏水相互作用機(jī)理的商品化脫脂小柱可以選擇性吸附血漿中的磷脂、蛋白質(zhì)和表面活性劑,且對(duì)目標(biāo)化合物的吸附很弱,其操作簡單,使用前無需活化,目前主要應(yīng)用于血漿中的藥物分析[22],還未見其在食源性興奮劑類藥物殘留檢測方面的應(yīng)用報(bào)道。

本文擬開發(fā)基于脫脂小柱凈化,結(jié)合UHPLC-ESI-MS/MS,用于同時(shí)檢測四大類興奮劑類藥物。該方法前處理步驟簡單,便于動(dòng)物源性食品中興奮劑類藥物殘留的大批量篩查。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1　儀器、試劑與材料

Agilent 1290超高效液相色譜儀、Agilent 6490三重四極桿質(zhì)譜儀(配備鞘流電噴霧離子源)(美國Agilent公司); MS3渦旋振蕩器(德國IKA公司); EVAP 112氮吹濃縮儀(美國Organomation公司); 3K-15冷凍離心機(jī)(德國Sigma公司)。

甲醇和乙腈均為色譜純(德國Merck公司);甲酸(美國Mreda公司);醋酸銨、乙酸均為色譜純(美國Thermo Fisher Scientific公司); Captiva脫脂小柱、QuEChERS凈化包(美國Agilent公司)。實(shí)驗(yàn)用水(電阻率為18.2 MΩ5cm)均為超純水器(美國Millipore公司)制備。其他試劑均為分析純。

β-受體激動(dòng)劑類:克倫特羅(clenbuterol)、噴布特羅(penbutolol)、萊克多巴胺(ractopamine)、沙丁胺醇(salbutamol)、特布他林(terbutaline);類固醇激素類:孕酮(progesterone);糖皮質(zhì)激素類:倍氯米松(beclomethasone)、倍他米松(betamethasone)、地塞米松(dexamethasone)、氫化可的松(hydrocortisone)、醋酸氟氫可的松(fludrocortisone acetate)、17-甲基睪酮(17-methyltestosterone)、美雄酮(metandienone)、潑尼松龍(prednisolone)、潑尼松(prednisone)、丙酸睪酮(testosterone-17-propionate)、群勃龍(trenbolone);玉米赤霉醇(zeranol),以上18種標(biāo)準(zhǔn)品均購自德國Dr. Ehrenstorfer公司。本實(shí)驗(yàn)所用牛肉基質(zhì)均購自北京農(nóng)貿(mào)市場。

1.2　標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取18種激素標(biāo)準(zhǔn)品各10.0 mg,用甲醇溶解并定容至10 mL,配制1.0 g/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液;分別移取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,置于10 mL容量瓶中,用甲醇稀釋并定容,配制成1.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液;用甲醇-水(7∶3, v/v)分別稀釋,配制成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

表 1 　18種食源性興奮劑類藥物的保留時(shí)間(t)、母離子、定量/定性離子、碰撞能量、駐留時(shí)間和離子化模式

* Quantitative ion.

1.3　樣品前處理

準(zhǔn)確稱取均質(zhì)化、已粉碎的牛肉樣品5.0 g(精確至0.1 g),置于50 mL具塞塑料離心管中,加入10 mL含1.0%(v/v)甲酸的乙腈溶液,渦旋2 min,然后加入4.0 g硫酸鈉和1.0 g氯化鈉,渦旋2 min,以5 000 r/min離心5 min。取上清液2.25 mL,向其中加入0.75 mL水,混勻后轉(zhuǎn)移至Captiva脫脂小柱中，真空抽干脫脂小柱,收集濾液至5 mL離心管中,然后加入0.3 g硫酸鎂,渦旋振蕩,以5 000 r/min離心5 min,移取1.0 mL上清液,置于干凈的5 mL離心管中,于40 ℃氮吹至近干。用0.35 mL甲醇溶解上述殘?jiān)?渦旋振蕩混勻,再加入0.15 mL水,振蕩混勻,以14 000 r/min離心5 min,移取上清液,置于含有內(nèi)襯管的2 mL進(jìn)樣瓶中,供UHPLC-MS/MS測定。

1.4　色譜條件

色譜柱:Agilent Zorbax Phenyl-Hexyl柱(150 mm×2.1 mm, 1.8 μm);柱溫:40 ℃;流動(dòng)相:A為5 mmol/L醋酸銨水溶液(含0.01%(v/v)醋酸), B為甲醇-乙腈(7∶3, v/v);流速:0.4 mL/min。梯度洗脫程序:0～3.0 min, 5%B～15%B; 3.0～3.5 min, 15%B～40%B; 3.5～13.0 min, 40%B; 13.0～15.0 min, 40%B～55%B; 15.0～17.0 min, 55%B～95%B; 17.0～19.0 min, 95%B。進(jìn)樣體積:3.0 μL。

1.5　質(zhì)譜條件

離子源:鞘流電噴霧離子源,正、負(fù)離子切換模式;檢測方式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM);干燥器溫度:200 ℃;鞘氣溫度:350 ℃;霧化氣壓力:241.4 kPa。18種食源性興奮劑類藥物的其他采集參數(shù)見表1。

2　結(jié)果與討論

2.1　超高效液相色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.1.1質(zhì)譜條件的優(yōu)化

對(duì)18種食源性興奮劑類藥物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析,通過Agilent MassHunter Optimizer軟件進(jìn)行優(yōu)化,獲得MRM采集參數(shù),包括一個(gè)母離子和兩個(gè)碎片離子信息及其對(duì)應(yīng)的最佳碰撞能量,選擇響應(yīng)值最高的子離子作為定量離子,另一個(gè)作為定性離子。優(yōu)化后的采集參數(shù)見表1。

2.1.2色譜條件的優(yōu)化

進(jìn)一步考察采用不同色譜柱時(shí)18種食源性興奮劑類藥物的分離情況。在18種食源性興奮劑類藥物中,倍他米松和地塞米松互為同分異構(gòu)體,較難分離,在質(zhì)譜條件相同的情況下,需要通過改變固定相或流動(dòng)相組成及梯度洗脫程序進(jìn)行分離。實(shí)驗(yàn)首先采用Poroshell C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 2.7 μm),同時(shí)優(yōu)化流動(dòng)相組成和梯度洗脫程序(見圖1a),發(fā)現(xiàn)選用含甲酸或乙酸銨的甲醇水溶液作為流動(dòng)相時(shí),大部分化合物的色譜響應(yīng)均較好,但倍他米松(峰9)和地塞米松(峰10)一直處于共流出狀態(tài)。在相同流動(dòng)相體系和梯度洗脫條件下,改用Zorbax Eclipse Plus C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行分離,發(fā)現(xiàn)倍他米松和地塞米松仍無法基線分離,呈現(xiàn)肩峰形式。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化流動(dòng)相組成和梯度洗脫程序,發(fā)現(xiàn)采用5 mmol/L醋酸銨水溶液(含0.1%(v/v)甲酸)和甲醇-乙腈(7∶3, v/v)作為流動(dòng)相,有助于提高異構(gòu)體的分離度,但仍無法達(dá)到基線分離,而且色譜峰較寬,保留時(shí)間相對(duì)較長,在15 min左右(見圖1b)。

考慮到大部分待測化合物含有芳香環(huán),而苯基己基固定相可能有不同于C18固定相的選擇性,因此進(jìn)一步考察了相同柱長的苯基己基Zorbax Phenyl-Hexyl色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm),并適當(dāng)調(diào)整流動(dòng)相改性劑和梯度洗脫程序,發(fā)現(xiàn)異構(gòu)體的保留時(shí)間有所提前,在10～11 min出峰,且分離效果優(yōu)于C18色譜柱(見圖1c),但仍然難以實(shí)現(xiàn)基線分離。因此在相同條件下進(jìn)一步考察柱長為150 mm的苯基己基Zorbax Phenyl-Hexyl色譜柱(150 mm×2.1 mm, 1.8 μm),此時(shí)倍他米松和地塞米松可以達(dá)到基線分離。為兼顧在負(fù)離子模式下檢測的玉米赤霉醇的靈敏度,最終確定流動(dòng)相組成為5 mmol/L醋酸銨水溶液(含0.01%(v/v)醋酸)和甲醇-乙腈(7∶3, v/v),并確定了梯度洗脫程序。在選定的實(shí)驗(yàn)條件下,目標(biāo)化合物色譜峰較窄,靈敏度相對(duì)較高(見圖1d)。

2.2　樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)考察了4種不同凈化方法對(duì)加標(biāo)牛肉樣品中目標(biāo)化合物(2.0 μg/kg)回收率的影響(見圖2)。方法1為樣品提取液直接上機(jī)分析;方法2為樣品提取液經(jīng)QuEChERS方法凈化(所用吸附劑為50 mgN-丙基乙二胺(PSA)、150 mg C18和900 mg硫酸鈉)后直接上機(jī)分析;方法3為樣品提取液經(jīng)Captiva脫脂小柱凈化后直接上機(jī)分析;方法4為樣品提取液采用Captiva脫脂小柱凈化后經(jīng)干燥濃縮復(fù)溶再上機(jī)分析(即1.3節(jié)前處理步驟)。

結(jié)果表明,采用方法1直接分析提取液時(shí),18種食源性興奮劑類藥物的回收率均低于60%,其中沙丁胺醇和特布他林的回收率低于20%,表明肉類樣品中的基質(zhì)對(duì)檢測結(jié)果產(chǎn)生顯著干擾,需要進(jìn)一步凈化以降低基質(zhì)效應(yīng)(ME)的影響。在牛肉中,主要的基質(zhì)為蛋白質(zhì)和脂肪,雖然提取液乙腈有一定沉淀蛋白質(zhì)的作用,但提取液中的脂肪依然可以產(chǎn)生明顯的基質(zhì)干擾,嚴(yán)重影響測量的準(zhǔn)確度。

采用方法2凈化后,發(fā)現(xiàn)大部分目標(biāo)化合物的回收率較好,其中13種目標(biāo)化合物的回收率介于70%～120%之間,但噴布特羅和丙酸睪酮的回收率較低,分別為21%和25%。

采用方法3凈化后,發(fā)現(xiàn)有15種目標(biāo)化合物的回收率可達(dá)到70%～120%,說明該凈化方法能夠有效去除脂肪的基質(zhì)干擾。與方法2相比,使用Captiva小柱時(shí)大部分目標(biāo)化合物的回收率與采用方法2時(shí)相差不多。但對(duì)于噴布特羅,采用Captiva小柱時(shí)的回收率為70.7%,遠(yuǎn)高于采用QuEChERS方法的回收率(21%)。但沙丁胺醇、氫化可的松和丙酸睪酮的回收率仍不理想。可能是因?yàn)樵谔崛∨c凈化過程中目標(biāo)化合物被稀釋,影響對(duì)部分化合物的準(zhǔn)確測定。因此采用方法4在凈化、濃縮、復(fù)溶后再上機(jī)分析。結(jié)果顯示,在使用0.3 g硫酸鎂作為干燥劑時(shí)大部分目標(biāo)物的回收率相對(duì)于方法3有了進(jìn)一步提高。除了沙丁胺醇的回收率為58%外,其他目標(biāo)化合物的回收率均在70%～120%范圍內(nèi)。因此最終確定采用Captiva脫脂小柱凈化過濾后再濃縮富集的樣品制備方法。

2.3　標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測時(shí)常出現(xiàn)基質(zhì)干擾現(xiàn)象。本研究對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行了考察。采用牛肉空白樣品基質(zhì)溶液與純?nèi)軇┓謩e配制標(biāo)準(zhǔn)溶液,在相同條件下進(jìn)行UHPLC-MS/MS檢測,以各組分的峰面積對(duì)其質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,獲得目標(biāo)化合物的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用公式ME=k1/k2×100%計(jì)算方法的基質(zhì)效應(yīng)(見表2),其中k1和k2分別為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。ME越偏離100%,說明該化合物的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)越明顯,反之基質(zhì)抑制效應(yīng)越顯著。如表2所示,其中13種目標(biāo)化合物的ME介于80%～120%之間,基質(zhì)效應(yīng)可忽略。特布他林有較強(qiáng)的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng);群勃龍、甲基睪酮、孕酮和丙酸睪酮存在較強(qiáng)的基質(zhì)抑制效應(yīng),尤其是孕酮和丙酸睪酮的ME小于25%。因此本研究采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線和外標(biāo)法進(jìn)行定量。在0.10～50.0 μg/L范圍內(nèi),各目標(biāo)化合物的線性關(guān)系良好,線性回歸相關(guān)系數(shù)(R2)均≥0.995 0(見表2)。

圖 1 　在不同色譜條件下18種食源性興奮劑類藥物的MRM色譜圖Fig. 1 　MRM chromatograms of the 18 food-borne stimulant drugs under different chromatographic conditions　Conditions: a. column, Poroshell C18 (100 mm×2.1 mm, 2.7 μm); mobile phase A, 5 mmol/L ammonium acetate aqueous solution containing 0.1% (v/v) formic acid; mobile phase B, methanol containing 5 mmol/L ammonium acetate and 0.1% (v/v) formic acid; flow rate, 0.3 mL/min; gradient elution program, 0-3.0 min, 5%B-15%B, 3.0-3.5 min, 15%B-45%B, 3.5-5.0 min, 45%B, 5.0-5.1 min, 45%B-65%B, 5.1-9.0 min, 65%B-75%B, 9.0-12.0 min, 75%B-95%B, 12.0-18.0 min, 95%B. b. column, Zorbax Eclipse Plus C18 (100 mm×2.1 mm, 1.8 μm); mobile phase A, 5 mmol/L ammonium acetate aqueous solution containing 0.1% (v/v) formic acid; mobile phase B, methanol-acetonitrile (7∶3, v/v) containing 5 mmol/L ammonium acetate and 0.1% (v/v) formic acid; flow rate, 0.4 mL/min; gradient elution program, 0-3.0 min, 5%B-15%B, 3.0-3.5 min, 15%B-45%B, 3.5-15.0 min, 45%B-55%B, 15.0-23.0 min, 55%B-95%B. c. column, Zorbax Eclipse Plus Phenyl-Hexyl (100 mm×2.1 mm, 1.8 μm); mobile phase A, 2 mmol/L ammonium acetate aqueous solution; mobile phase B, methanol-acetonitrile (7∶3, v/v); flow rate, 0.4 mL/min; gradient elution program, 0-3.0 min, 5%B-15%B, 3.0-3.5 min, 15%B-40%B, 3.5-12.0 min, 40%B, 12.0-12.5 min, 40%B-55%B, 12.5-16.0 min, 55%B-95%B, 16.0-18.0 min, 95%B. d. Zorbax Eclipse Plus Phenyl-Hexyl (150 mm×2.1 mm, 1.8 μm); mobile phase A, 5 mmol/L ammonium acetate aqueous solution containing 0.01% (v/v) acetic acid; mobile phase B, methanol-acetonitrile (7∶3, v/v); flow rate, 0.4 mL/min; gradient elution program, 0-3.0 min, 5%B-15%B, 3.0-3.5 min, 15%B-40%B, 3.5-13.0 min, 40%B, 13.0-15.0 min, 40%B-55%, 15.0-17.0 min, 55%B-95%B, 17.0-19.0 min, 95%B.　　Peaks 1-18 are the same as that in Table 1.

圖 2 　不同凈化方法對(duì)加標(biāo)牛肉樣品中目標(biāo)化合物(2.0 μg/kg)回收率的影響Fig. 2 　Effect of different clean-up conditions on the recoveries of the target compounds (2.0 μg/kg) spiked in beef samples　Conditions: method 1, extracted solution direct analysis; method 2, analysis of the extracted solution after QuEChERS with 50 mg primary secondary amine (PSA), 150 mg C18 and 900 mg sodium sulfate; method 3, analysis of the extracted solution after using Captiva lipid removal filtration cartridge; method 4, following method 3, the obtained filtrate was further enriched before analysis.

No.CompoundME/%Linear equationR2LOD/(μg/kg)LOQ/(μg/kg)1salbutamol101.8y=2.55×105x-2.18×1040.99820.00150.00502terbutaline140.1y=1.82×105x-3.18×1050.99690.00120.00403ractopamine82.7y=2.25×105x-1.10×1040.99780.00300.01004clenbuterol95.3y=1.69×105x-1.24×1040.99840.00060.00205prednisolone99.8y=8.13×103x-6.47×1020.99780.01800.06106prednisone100.6y=5.67×103x-5.42×1020.99840.06600.22007hydrocortisone100.6y=1.25×104x+3.62×1040.99510.00100.00308fludrocortisone acetate92.0y=4.76×103x-3.87×1020.99750.05700.19009betamethasone98.5y=1.26×104x-7.65×1020.99780.00600.020010dexamethasone99.6y=1.30×104x-7.84×1020.99870.00450.015011beclomethasone92.7y=2.44×104 x-1.29×1030.99820.01900.063012trenbolone74.2y=3.38×104x-2.73×1030.99750.02640.088013penbutolol86.6y=4.03×105x-1.55×1040.99890.00210.007014zeranol99.6y=3.00×103x-2.48×1020.99860.08100.270015metandienone79.5y=5.24×104x-2.75×1030.99850.02300.07801617-methyltestoster-one48.0y=3.86×104 x-2.71×1030.99630.01700.058017progesterone24.3y=2.36×104x+2.00×1040.99670.03300.110018testosterone-17-propionate10.2y=9.99×103x-1.57×1030.99500.09000.3000

y: peak area;x: mass concentration, μg/L.

2.4　檢出限和定量限

本研究對(duì)基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行分析,以其3倍和10倍信噪比(S/N)確定方法的檢出限和定量限。如表2所示,18種食源性興奮劑類藥物的檢出限和定量限分別為0.000 6～0.090 0 μg/kg和0.002 0～0.300 0 μg/kg,其中定量限均低于我國相關(guān)規(guī)定中最高殘留限量標(biāo)準(zhǔn)[2]。

2.5　回收率和精密度

在空白牛肉基質(zhì)中分別添加3個(gè)水平(0.40、1.0和2.0 μg/kg)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),每個(gè)水平做5個(gè)平行樣品。如表3所示,18種食源性興奮劑類藥物的平均加標(biāo)回收率為57.3%～117.5%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.1%～15.6%(n=5)。表明本方法準(zhǔn)確度高,穩(wěn)定性好,能夠滿足日常檢測需求。

表 3 　加標(biāo)牛肉樣品中18種食源性興奮劑類藥物的回收率和精密度(n=5)

3　結(jié)論

本文研究了牛肉組織中18種食源性興奮劑類藥物殘留的檢測方法。該方法采用酸化乙腈提取牛肉中的目標(biāo)化合物,經(jīng)脫脂凈化和干燥富集后用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行測定。該法樣品前處理簡單、快速,準(zhǔn)確度高,可滿足對(duì)牛肉組織中四大主要類別興奮劑類藥物殘留的高通量檢測要求。