曹艷平,　姜大峰,　李鳳華,　陳金東,　李　蔚,　焦燕妮

(山東省疾病預(yù)防控制中心, 山東 濟(jì)南 250014)

多氯聯(lián)苯(polychlorinated biphenyls, PCBs)是聯(lián)苯上面的氫被氯取代后的產(chǎn)物,它是各種氯化聯(lián)苯的混合物,PCBs理論上有209種同系物異構(gòu)體,目前已在商品中鑒定出130種同系物異構(gòu)體單體。PCBs在自然界不易降解,經(jīng)過(guò)幾十年人們才逐漸認(rèn)識(shí)到PCBs對(duì)全球環(huán)境的污染。PCBs對(duì)生物、人類都有極大的危害,屬于脂溶性物質(zhì),通過(guò)食物鏈產(chǎn)生生物積累作用[1]。在2001年由多個(gè)國(guó)家通過(guò)的斯德哥爾摩公約中,PCBs被列為首批限制的12種對(duì)人類和自然環(huán)境最具危害的持久性有機(jī)污染物之一,各國(guó)分別禁止PCBs的生產(chǎn)和使用[2]。由于PCBs有持久性和難降解性,進(jìn)入環(huán)境介質(zhì)中和很難被分解,可通過(guò)生物富集和放大,人類處于食物鏈頂端,除了直接受到環(huán)境介質(zhì)中PCBs的暴露影響,動(dòng)植物體內(nèi)的PCBs也通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體,對(duì)人體健康產(chǎn)生危害,歐盟制定了各類食品中PCBs的限值[3]。隨著對(duì)限值要求的進(jìn)一步嚴(yán)格,建立一個(gè)快速、準(zhǔn)確、可靠的分析食品中PCBs的測(cè)定方法十分重要。

PCBs的測(cè)定方法早期有氣相色譜法(GC)[4-6],后來(lái)有氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[4-6]、氣相色譜-高分辨質(zhì)譜法(GC-HRMS)[7-10]、氣相色譜-負(fù)化學(xué)源質(zhì)譜法(GC-NCIMS)[11]等。隨著氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(GC-MS/MS)的普及,自2014年6月起,歐盟頒布的法規(guī)[12]規(guī)定可使用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)食品和飼料中的二惡英樣和非二惡英樣PCBs的含量進(jìn)行確認(rèn)檢驗(yàn)。氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定PCBs有了快速的發(fā)展[13-15]。

PCBs在動(dòng)植物體內(nèi)主要存在于脂肪組織和富含脂肪的部位中,測(cè)定時(shí)首先要提取脂肪。脂肪中含有大量的飽和、不飽和脂肪酸等有機(jī)物,都會(huì)同時(shí)提取出來(lái),如果進(jìn)入色譜系統(tǒng)將導(dǎo)致色譜基線漂移,還會(huì)干擾PCBs的分析測(cè)定,因此去除此類干擾物質(zhì)是PCBs檢測(cè)的重點(diǎn)與難點(diǎn)[11,14,16]。由于PCBs含量很低,容易受到樣品基質(zhì)的干擾,在分析測(cè)定前要對(duì)樣品預(yù)處理,以便消除基體干擾,富集待測(cè)的PCBs,提高檢測(cè)的靈敏度。

目前測(cè)定PCBs的前處理方法主要包括提取和凈化。提取方法有傳統(tǒng)的索氏提取法[6,8]、加速溶劑萃取法[13]、超聲輔助萃取法[15]、微波輔助萃取法[14]和超臨界流體提取法[5]等。凈化方法主要有硅膠、氧化鋁柱凈化法[6,8,13],弗羅里硅土(Florisil)、N-丙基二乙胺(PSA)、無(wú)水硫酸鎂和C18等吸附劑組成的混合凈化法[14],固相萃取法[17]等。

美國(guó)國(guó)家環(huán)境保護(hù)局(US EPA)方法1668A和我國(guó)GB/T 5009.190在PCBs提取時(shí)采用傳統(tǒng)的索氏提取器提取樣品18～24 h,提取的脂肪依次經(jīng)過(guò)3根凈化柱進(jìn)行凈化,每次需要預(yù)淋洗柱、洗脫目標(biāo)物、洗脫液濃縮,采用高分辨氣相色譜-質(zhì)譜或氣相色譜-質(zhì)譜進(jìn)行測(cè)定,在樣品前處理方面花費(fèi)大量時(shí)間和有機(jī)溶劑。本文在此基礎(chǔ)上,采用自動(dòng)索氏提取器提取樣品中的PCBs,經(jīng)一根硅膠、酸性硅膠、堿性氧化鋁復(fù)合柱進(jìn)行凈化,只需一次濃縮過(guò)程,縮短了分析時(shí)間,減少了有機(jī)溶劑的使用量。用氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式進(jìn)行測(cè)定。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1　儀器和試劑

TSQ 8000氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Thermo Fisher公司); 460/H超聲波清洗器(德國(guó)Elma公司); HR 2860食品粉碎機(jī)(Philips公司); CHRIST Alpha 2-4真空冷凍干燥機(jī)(德國(guó)Martinchrist公司); B-811自動(dòng)索氏提取器和R-300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(瑞士Büchi公司); N-EVAP112氮吹儀(美國(guó)Organmation Associates公司); VORTEX GENIE2渦旋混勻器(美國(guó)Scientific Industries公司)。

丙酮和二氯甲烷(農(nóng)殘級(jí),美國(guó)Fisher公司);正己烷(HPLC級(jí),美國(guó)Merck公司)。無(wú)水硫酸鈉(分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司): 550 ℃烘烤4 h,待用;硅膠(100～200目,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司):裝入玻璃柱中,依次用正己烷和二氯甲烷淋洗二次后,50 ℃烘烤至干,180 ℃烘烤8～12 h,置于磨口瓶中,放入干燥器中保存。44%酸化硅膠:稱取活化好的硅膠100 g,逐滴加入78.6 g濃硫酸,振至無(wú)塊狀物后,置于磨口瓶中,放在干燥器中保存。堿性氧化鋁:660 ℃烘烤6 h,置于磨口瓶中,放在干燥器中保存。玻璃凈化柱(300 mm×15 mm,帶聚四氟乙烯柱塞),帶有平液器。

多氯聯(lián)苯標(biāo)準(zhǔn)溶液EC9605-PAR(20種,100 μg/L),包括:PCB-18(2,2′,5-trichlorobiphenyl)、PCB-28(2,4,4′-trichlorobiphenyl)、PCB-33(2′,3,4-trichlorobiphenyl)、PCB-52(2,2′,5,5′-tetrachlorobiphenyl)、PCB-44(2,2′,3,5′-tetrachlorobiphenyl)、PCB-70(2,3′,4′,5-tetrachlorobiphenyl)、PCB-101(2,2′,4,5,5′-pentachlorobiphenyl)、PCB-118(2,3′,4,4′,5-pentachlorobiphenyl)、PCB-153(2,2′,4,4′,5,5′-hexachlorobiphenyl)、PCB-105(2,3,3′,4,4′-pentachlorobiphenyl)、PCB-138(2,2′,3,4,4′,5′-hexachlorobiphenyl)、PCB-187(2,2′,3,4′,5,5′,6-heptachlorobiphenyl)、PCB-128(2,2′,3,3′,4,4′-hexachlorobiphenyl)、PCB-180(2,2′,3,4,4′,5,5′-heptachlorobiphenyl)、PCB-199(2,2′,3,3′,4,5,5′,6′-octachlorobiphenyl)、PCB-170(2,2′,3,3′,4,4′,5-heptachlorobiphenyl)、PCB-195(2,2′,3,3′,4,4′,5,6-octachlorobiphenyl)、PCB-194(2,2′,3,3′,4,4′,5,5′-octachlorobiphenyl)、PCB-206(2,2,3,3′,4,4′,5,5′,6-nonachlorobiphenyl)、PCB-209(2,2′,3,3′,4,4′,5,5′,6,6′-decachlorobiphenyl)。

多氯聯(lián)苯定量?jī)?nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液EC9605-SS(8種,2.0 mg/L)、多氯聯(lián)苯回收率內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液EC9605-RS(2種,2.0 mg/L)均購(gòu)自加拿大Wellington Laboratries公司。將EC9605-SS和EC9605-RS分別用異辛烷稀釋至40 μg/L,作為定量?jī)?nèi)標(biāo)和回收內(nèi)標(biāo)的使用液。

1.2　樣品前處理

1.2.1樣品預(yù)處理

將樣品可食部分粉碎混勻后,稱取樣品5 g(精確至0.01 g),在冷凍干燥機(jī)中干燥后,加入10 μL 40 μg/L定量?jī)?nèi)標(biāo)使用液,裝入自動(dòng)索氏提取器,以適量正己烷-二氯甲烷(1∶1, v/v)為提取溶劑,回流提取共60次。提取完成后,測(cè)定并計(jì)算脂肪含量。

1.2.2復(fù)合柱凈化

玻璃柱從底端到頂端依次填入玻璃棉、2.5 g活化堿性氧化鋁、4 g無(wú)水硫酸鈉、4 g活化硅膠、10 g酸化硅膠、2 g活化硅膠、4 g無(wú)水硫酸鈉。用100 mL正己烷預(yù)淋洗,用正己烷將提取到的脂肪全部轉(zhuǎn)移洗至凈化柱上,以180 mL正己烷洗脫,再以25 mL二氯甲烷-正己烷(5∶95, v/v)洗脫,收集洗脫液,濃縮至約1 mL。

1.2.3上機(jī)分析

將濃縮液轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣小瓶中,濃縮至0.5 mL,加入10 μL 40 μg/L回收內(nèi)標(biāo)使用液,混勻后上機(jī)分析。

1.3　分析條件

色譜柱:TG-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm);程序升溫:初始溫度100 ℃,保持2 min,以15 ℃/min升至180 ℃,再以3 ℃/min升至240 ℃,再以10 ℃/min升至285 ℃,保持10 min;載氣:高純氦氣;恒流模式:流速1.5 mL/min;進(jìn)樣口溫度:250 ℃,不分流進(jìn)樣,進(jìn)樣量1.0 μL。

離子源(EI)溫度:250 ℃;碰撞氣:氬氣;傳輸線溫度:280 ℃;溶劑延遲時(shí)間:4 min;掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式。相關(guān)參數(shù)見表1。

表 1 　20種PCBs的保留時(shí)間、定量及定性離子對(duì)、碰撞能量

表 1 　(續(xù))

1.4　計(jì)算

定量方法采用內(nèi)標(biāo)法,首先用回收內(nèi)標(biāo)計(jì)算樣品中定量?jī)?nèi)標(biāo)的回收率:用13C12-PCB-101作為13C12-PCB-28、13C12-PCB-52、13C12-PCB-118、13C12-PCB-153的內(nèi)標(biāo),用13C12-PCB-194作為13C12-PCB-180、13C12-PCB-202、13C12-PCB-206、13C12-PCB-209的內(nèi)標(biāo),樣品中定量?jī)?nèi)標(biāo)的回收率應(yīng)在80%～120%之間。樣品中定量?jī)?nèi)標(biāo)的回收率應(yīng)滿足要求后,再用定量?jī)?nèi)標(biāo)計(jì)算樣品中每個(gè)待測(cè)PCBs的含量。每族PCBs使用一個(gè)相同氯代程度的同位素內(nèi)標(biāo)物作為定量?jī)?nèi)標(biāo):三氯聯(lián)苯用13C12-PCB-28、四氯聯(lián)苯用13C12-PCB-52、五氯聯(lián)苯用13C12-PCB-118、六氯聯(lián)苯用13C12-PCB-153、七氯聯(lián)苯用13C12-PCB-180、八氯聯(lián)苯用13C12-PCB-202、九氯聯(lián)苯用13C12-PCB-206、十氯聯(lián)苯用13C12-PCB-209作為內(nèi)標(biāo)。

每個(gè)批次最多每15個(gè)樣品后,需做一次方法空白試驗(yàn)。

2　結(jié)果與討論

2.1　樣品前處理方法的優(yōu)化

自動(dòng)索氏提取器以正己烷-二氯甲烷(1∶1, v/v)為提取溶劑,共回流提取60次,8 h左右完成對(duì)樣品中脂肪的提取。同一樣品分別采用傳統(tǒng)的索氏提取器和自動(dòng)索氏提取器進(jìn)行脂肪的提取(n=6),分別將提取到的脂肪均按照本文建立的方法進(jìn)行凈化后測(cè)定,以考察不同的提取方法對(duì)PCBs總量測(cè)定結(jié)果的影響。用傳統(tǒng)的索氏提取器提取測(cè)定的樣品脂肪含量均值是6.33%、20種PCBs的總量均值是5.77 μg/kg,用自動(dòng)索氏提取器測(cè)定的樣品脂肪含量均值是6.38%、20種PCBs的總量均值是5.71 μg/kg。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析,兩種方法對(duì)脂肪的提取沒(méi)有差異,測(cè)得樣品中20種PCBs的總量均值沒(méi)有差異。此后脂肪提取全部采用自動(dòng)索氏提取器。

2.2　分析條件的優(yōu)化

PCBs是弱極性化合物,色譜柱采用弱極性毛細(xì)管柱TG-5MS,通過(guò)優(yōu)化色譜柱的程序升溫條件,采用三階升溫,全部20種PCBs及10種13C12-PCB同位素內(nèi)標(biāo)在33 min內(nèi)出峰,分離良好,標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流圖見圖1。

圖 1 　20種PCBs標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流圖Fig. 1 　Total ion chromatogram (TIC) of the 20 PCB standards　1. PCB-18; 2. PCB-28; 3. PCB-33; 4. PCB-52; 5. PCB-44; 6. PCB-70; 7. PCB-101; 8. PCB-118; 9. PCB-153; 10. PCB-105; 11. PCB-138; 12. PCB-187; 13. PCB-128; 14. PCB-180; 15. PCB-199; 16. PCB-170; 17. PCB-195; 18. PCB-194; 19. PCB-206; 20. PCB-209.

三重四極桿質(zhì)譜條件的優(yōu)化主要包括母離子、子離子、碰撞能量等幾個(gè)方面。分別使用0.1 μg/L的PCBs標(biāo)準(zhǔn)溶液、定量?jī)?nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液、回收內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行方法優(yōu)化,選擇豐度最高的離子對(duì);碰撞能量從5 eV到30 eV進(jìn)行優(yōu)化后,選擇出最佳碰撞能量,見表1。

根據(jù)歐盟委員會(huì)指令[18]中有關(guān)分析方法表現(xiàn)的排名,GC-MS/MS方法的識(shí)別點(diǎn)數(shù)與HRMS相似或更高,尤其是使用基于MS/MS的獨(dú)立離子對(duì)時(shí)。該指令還規(guī)定,有機(jī)物殘留或污染物適用的確認(rèn)方法必須是基于全掃描技術(shù)或“若方法不記錄全掃譜圖,則需要至少4個(gè)識(shí)別點(diǎn)(多氯聯(lián)苯、二惡英、呋喃等)”。本方法通過(guò)使用兩個(gè)一級(jí)離子的離子對(duì),為每種PCB單體化合物提供了4個(gè)識(shí)別點(diǎn),滿足其規(guī)定要求。

表 2 　20種PCBs的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r)、檢出限和定量限

2.3　凈化方法的優(yōu)化

本文在US EPA方法1668A的基礎(chǔ)上,對(duì)凈化方法進(jìn)行了改進(jìn),采用一根多層復(fù)合凈化柱,從柱底端到頂端依次填入堿性氧化鋁、活化硅膠、酸化硅膠,預(yù)淋洗后,將樣品提取液過(guò)柱凈化,依次采用正己烷和有二氯甲烷配比的正己烷洗脫,收集合并全部洗脫液,濃縮后上機(jī)分析。一次過(guò)柱、一次濃縮過(guò)程,節(jié)省樣品分析時(shí)間、減少有機(jī)溶劑的使用量。分別采用這兩種方法對(duì)凈化的效果進(jìn)行比較,選擇魚樣品中脂肪含量比較高(13.8%)的樣品,兩種方法均顯示出良好的凈化效果,沒(méi)有本底干擾。同一樣品按兩種方法凈化后測(cè)定的總離子流圖見圖2。

圖 2 　樣品經(jīng)不同方法凈化后的總離子流圖Fig. 2 　TIC chromatograms of a sample purified by different methods　a. US EPA 1668A; b. this method.　Peak Nos. are the same as those in Fig. 1.

2.4　標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

用異辛烷將EC9605-PAR逐級(jí)稀釋成0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,各取1.0 mL,分別各加入20 μL 40 μg/L定量?jī)?nèi)標(biāo)和回收內(nèi)標(biāo)使用液,使測(cè)定液中定量?jī)?nèi)標(biāo)和回收內(nèi)標(biāo)均為0.8 μg/L,混勻后與樣品相同儀器條件上機(jī)分析。分別將標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定液中待測(cè)PCBs與其相應(yīng)定量?jī)?nèi)標(biāo)的定量離子對(duì)峰面積比值對(duì)PCBs的質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸。采用基質(zhì)加標(biāo)回收的方法,以信噪比(S/N)>3確定檢出限(LOD),以S/N>10確定定量限(LOQ)。結(jié)果見表2。

表 2 　(續(xù))

y: peak area ratio of the quantitative ion of each standard to the corresponding internal standard;x: mass concentration, μg/L

2.5　回收率與精密度

分別用US EPA方法1668A和本文方法進(jìn)行凈化,進(jìn)行0.1、1.0和5.0 ng/g的加標(biāo)回收試驗(yàn)與精密度測(cè)定(每組n=6),兩種方法低、中、高3種水平下的加標(biāo)回收率均在80.3%～117.6%之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在5.09%～18.5%之間(見表3),均符合分析檢測(cè)的要求。內(nèi)標(biāo)校正使在前處理過(guò)程中損失的目標(biāo)化合物得到校正,低水平下的加標(biāo)回收率也比較令人滿意。兩種方法的回收率與精密度無(wú)顯著性差異。

表 3 　不同凈化方法下20種PCBs的加標(biāo)回收率(n=6)

表 3 　(續(xù))

2.6　樣品測(cè)定

采用本文方法對(duì)山東省沿海地區(qū)的常見魚類進(jìn)行了分析測(cè)定,包括黃花魚(大、小)、鲅魚、鱸魚、帶魚、偏口魚。在所有魚樣中均檢出多個(gè)PCBs單體,總量在1.2～8.8 μg/kg(濕重)之間,7種指示性PCBs的含量總和在0.68～6.4 μg/kg(濕重)之間(見表4)。我國(guó)GB 2762-2017中PCBs的限量指標(biāo)以7種指示性PCBs的總和計(jì),水產(chǎn)動(dòng)物及其制品<0.5 mg/kg。山東省沿海常見魚中PCBs的檢出量沒(méi)有超出國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)限值。

表 4 　魚樣中PCBs的含量

3　結(jié)論

本文建立了氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式測(cè)定魚樣中PCBs的方法,采用自動(dòng)索氏提取器提取PCBs,用一根多層復(fù)合凈化柱凈化,凈化效果好,縮短了分析時(shí)間,減少了有機(jī)溶劑使用量,降低了復(fù)雜本底對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾,提高了檢測(cè)靈敏度。該方法適用于魚樣中PCBs的檢測(cè)。