謝孝川 劉清松 敬敏 李季

（1內(nèi)江市第一人民醫(yī)院病理科 四川 內(nèi)江 641000）（2內(nèi)江市第一人民醫(yī)院胸外科 四川 內(nèi)江 641000）

小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）占所有肺癌的大約15%，是目前臨床治療中棘手的腫瘤之一[1]。與非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）在靶向治療方面的飛速發(fā)展相比，SCLC發(fā)生發(fā)展的潛在機(jī)制仍未可知，缺乏可用于臨床靶向治療的驅(qū)動基因，現(xiàn)有治療手段仍然以傳統(tǒng)的化療和放療為主[2]。由于SCLC倍增時(shí)間短，雖然其對于化療敏感，但很快就會出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致治療失敗和死亡[3]。因此，化療耐藥的導(dǎo)致小細(xì)胞肺癌治療失敗的重要原因，其具體機(jī)制目前尚未完全闡明，可能涉及眾多耐藥相關(guān)基因的調(diào)控異常。

LncRNA是指一類長度超過200個(gè)核苷酸的RNA分子的總稱，是當(dāng)今分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一[4]。雖然在人類基因組中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些LncRNA，但關(guān)于其對基因組的調(diào)控及具體機(jī)制尚不清楚。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)通過LncRNA芯片發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA AC009336.24在SCLC耐藥細(xì)胞株中的表達(dá)較化療敏感細(xì)胞株明顯增高，提示LncRNA AC009336.24可能與SCLC的耐藥相關(guān)，然而關(guān)于LncRNA AC009336.24在SCLC中的表達(dá)及意義目前國內(nèi)外尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測LncRNA AC009336.24在SCLC組織中的表達(dá)，分析其表達(dá)與患者臨床病理特征及化療敏感性的關(guān)系。

1.資料與方法

1.1 病例資料

收集于2012年06月至2017年06月在我院腫瘤科、胸外科及呼吸內(nèi)科進(jìn)行手術(shù)或穿刺活檢或支氣管鏡活檢的SCLC組織標(biāo)本96例，其中30例手術(shù)切除的SCLC的癌旁組織（距離癌組織≥2cm），66例未進(jìn)行手術(shù)治療的患者的癌組織取自支氣管鏡或CT引導(dǎo)下的穿刺活檢標(biāo)本。所有患者的病例資料完整，手術(shù)前均未接受過放化療。同期收集40例因各種原因?qū)е路瓮鈧恼７谓M織標(biāo)本作為對照組。96例患者均接受以鉑類為主的化療，首先給予一線化療方案（依托泊苷＋鉑類）化療；出現(xiàn)耐藥后，給予二線化療方案（伊立替康＋鉑類）。其中化療敏感者（化療4～5個(gè)周期后腫瘤縮小30%以上或消失）42例，化療耐藥者（化療4～5個(gè)周期后腫瘤增大30%或以上，或出現(xiàn)新的轉(zhuǎn)移灶）54例；其中54例耐藥者給予二線化療方案治療。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 隨訪

所有患者出院后都進(jìn)行了隨訪，隨訪時(shí)間為3～58個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為33個(gè)月，隨訪截止日期為2018年2月1日。至隨訪結(jié)束，存活30例，死亡66例，無失訪病例。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測SCLC組織中LncRNA RP11-401E9.3的表達(dá)水平

采用TRIZOL提取總RNA。將提取的總RNA，按如下條件進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：37℃，15min的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，98℃，5min的酶失活反應(yīng)，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-20℃保存。Real-time PCR采用2*SYBR Green PCR Master Mix，取適量cDNA 作為摸板進(jìn)行擴(kuò)增，以GAPDH作為內(nèi)參照，以 RQ=2-ΔΔCt 的方法進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料采用One way ANOVA或t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Chi-Square檢驗(yàn)分析LncRNA AC010145.4與各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系；采用Kaplan-Meier法分析患者生存時(shí)間的關(guān)系，單因素及多因素分析影響SCLC預(yù)后的因素。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 LncRNA RP11-401E9.3在SCLC組織中高表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測LncRNA RP11-401E9.3在96例SCLC組織、30例癌旁組織及40例正常肺組織中LncRNA RP11-401E9.3的表達(dá)，結(jié)果提示， LncRNA RP11-401E9.3在SCLC組織中的平均表達(dá)水平（9.678±1.730）顯著高于癌旁組織（1.570±0.690）及正常肺組織（1.475±0.450），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=30.10，P＜0.001）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)LncRNA RP11-401E9.3在54例耐藥患者中的平均表達(dá)（6.902±0.187）明顯高于化療敏感者（12.360±0.221，n=42），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=17.490，P＜0.001）。

2.2 LncRNA RP11-401E9.3的表達(dá)與SCLC患者臨床病理特征的關(guān)系

患者的基本資料見表1。根據(jù)LncRNA A RP11-401E9.3平均表達(dá)水平（9.678）將SCLC患者分為LncRNA RP11-401E9.3高表達(dá)組（LncRNA RP11-401E9.3≥9.678）50例及低表達(dá)組（LncRNA RP11-401E9.3＜9.678）46例。進(jìn)一步分析LncRNA RP11-401E9.3表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LncRNA RP11-401E9.3表達(dá)與患者的年齡、性別（P值均＞0.05）無關(guān)；而與疾病分期、淋巴及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、化療敏感性及患者的生存狀態(tài)明顯相關(guān)（P值均＜0.05，見表1）。

表1 LncRNA RP11-401E9.3表達(dá)與SCLC患者臨床病理特征間的關(guān)系Table 1 The relationship between LncRNA RP11-401E9.3 expression and pathological characteristics in patients with small cell lung cancer （SCLC）

2.3 SCLC患者生存分析

采用Kaplan-Meier法分析發(fā)現(xiàn)LncRNA RP11-401E9.3高表達(dá)患者的無進(jìn)展生存時(shí)間[（11.76±1.03）個(gè)月]短于低表達(dá)者[（21.89±1.64）個(gè)月]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=34.12，P＜0.00）；LncRNA RP11-401E9.3高表達(dá)患者的總生存時(shí)間[（36.64±1.75）個(gè)月]短于低表達(dá)者[（23.68±1.27）個(gè)月]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=30.72，P＜0.001）。

2.4 單因素及多因素分析影響SCLC患者預(yù)后的因素

單因素及多因素分析結(jié)果顯示，疾病分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、LncRNA RP11-401E9.3表達(dá)是SCLC患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素（P值均＜0.05，見表2）。

表2 影響 SCLC患者OS的臨床病理因素Table 2 The clinicopathological factors affecting the OS in SCLC patients.

3.討論

小細(xì)胞肺癌是一種有著高死亡率的侵襲性惡性腫瘤[5]。由于缺乏有效的針對SCLC的靶向藥物，目前仍以傳統(tǒng)的化療治療及放射治療為主，但療效差，極易出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[6]。因此，臨床急需尋找新的生物標(biāo)志物去早期診斷及預(yù)后評估小細(xì)胞肺癌。

近年來的研究發(fā)現(xiàn),LncRNA在多種類型腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，有望成為新的腫瘤標(biāo)志物和腫瘤治療靶點(diǎn)[7]。研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA HOTTIP通過富集miR-216a增加BCL-2的表達(dá)，誘導(dǎo)小細(xì)胞肺癌的化療抵抗[8]。LncRNA HOTTIP的表達(dá)與小細(xì)胞肺癌的疾病進(jìn)展和預(yù)后相關(guān)[9]。LncRNA HOTAIR通過調(diào)節(jié)HOXA1的甲基化影響小細(xì)胞肺癌的化療耐藥[10]。LncRNA TUG1通過EZH2調(diào)節(jié)LIMK2b的表達(dá)影響小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞增殖和化療藥物耐藥[11]。本研究發(fā)現(xiàn)SCLC組織中LncRNA RP11-401E9.3的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織及正常肺組織。LncRNA RP11-401E9.3在化療耐藥患者中的表達(dá)明顯高于化療敏感者；LncRNA RP11-401E9.3表達(dá)與SCLC患者的性別、年齡無關(guān)，而與疾病分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、化療耐藥相關(guān)。高表達(dá)LncRNA RP11-401E9.3患者的總生存時(shí)間及無進(jìn)展生存時(shí)間均短于低表達(dá)者。LncRNA RP11-401E9.3表達(dá)是SCLC患者獨(dú)立的預(yù)后因素。以上研究結(jié)果提示，LncRNA RP11-401E9.3參與調(diào)節(jié)SCLC的發(fā)生和發(fā)展，可能作為潛在的SCLC患者療效及預(yù)后評估的生物標(biāo)志物。然而，影響SCLC預(yù)后的分子機(jī)制復(fù)雜，LncRNA RP11-401E9.3調(diào)節(jié)SCLC患者預(yù)后的具體作用機(jī)制及參與的信號通路，尚需進(jìn)一步研究。

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