蔣大程，高 珊，高海倫，邱念偉

(曲阜師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 曲阜 273165)

1921年，F(xiàn)olin首創(chuàng)了測定可溶性蛋白質(zhì)含量的方法，此法的原理是蛋白質(zhì)分子中酪氨酸和色氨酸殘基(酚基)與酚試劑(磷鎢酸－磷鉬酸)可發(fā)生藍色反應(yīng)，藍色化合物的顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度呈正比。這一方法被命名為Folin－酚試劑法，該法的缺點是靈敏度較低[1]。1951年，Lowry對Folin法進行了改進，他發(fā)現(xiàn)在堿性溶液中，蛋白質(zhì)分子中的肽鍵可與堿性銅試劑中的Cu2＋螯合，形成蛋白質(zhì)－銅復(fù)合物，該復(fù)合物能夠與Folin酚試劑反應(yīng)產(chǎn)生藍色化合物[1－2]，這一改進大大提高了測定的靈敏度，改進后的方法被稱為 “Lowry法”。不過Lowry法仍存在測定范圍窄、使用試劑多、干擾物質(zhì)多、耗費時間長及反應(yīng)時間難以控制等缺點[3－4]。1976年美國科學(xué)家 Bradford建立了用考馬斯亮藍G250與蛋白質(zhì)結(jié)合的方法來定量測定蛋白質(zhì)含量。考馬斯亮藍法是目前實驗室中最常見、靈敏度最高的一種測定蛋白質(zhì)含量的方法[5－6]。它將比色法和染料結(jié)合法相結(jié)合，與其他傳統(tǒng)方法相比具有許多突出的優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于各類生物材料的可溶性蛋白含量測定，是生物化學(xué)、植物生理學(xué)、分子生物學(xué)及食品科學(xué)等實驗課程中的經(jīng)典實驗項目之一。首先，此法所需的樣品量少，蛋白質(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的復(fù)合物顏色穩(wěn)定，消光系數(shù)高，光吸收值隨蛋白質(zhì)含量的變化比Lowry法靈敏得多，可檢測的蛋白質(zhì)數(shù)量低達1 μg[7]。其次，測定速度快，完成一個樣品的測定，只需要5 min左右。第三，該方法操作簡便，只需加一種考馬斯亮藍試劑，不像Lowry法需要試劑較多，費時費力，需要嚴格控制反應(yīng)時間[8]，適合大批量樣品蛋白質(zhì)含量的測定。此外，該方法還具有干擾物質(zhì)少的優(yōu)點。

此方法雖然操作簡單，但在操作過程中，仍有許多細節(jié)問題容易被忽視，從而導(dǎo)致實驗結(jié)果出現(xiàn)偏差甚至錯誤。相關(guān)教材和文獻中只介紹了3～4項重要的注意事項[9－11]，還有很多操作細節(jié)并未提及。本實驗室在長期的教學(xué)和科研中積累了測定蛋白質(zhì)含量的豐富經(jīng)驗，總結(jié)了30余條實驗注意事項，分為儀器設(shè)備的操作、試劑的配制與保存、標準曲線的繪制、樣品蛋白質(zhì)的提取和樣品吸光度的測定等5個方面，旨在培養(yǎng)精益求精、一絲不茍的科學(xué)態(tài)度。

1 實驗原理

考馬斯亮藍G250(coomassie brilliant blue G250)法測定蛋白質(zhì)含量的原理是:在酸性溶液中，考馬斯亮藍G250染料主要與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸 (特別是精氨酸和賴氨酸)[12]和芳香族氨基酸的殘基通過疏水力相結(jié)合，從而使染料的最大吸收峰(lmax)由465 nm變?yōu)?95 nm，溶液的顏色由棕紅色變?yōu)樗{色[13]。在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)(1～1 000 μg/mL)， 溶液在 595 nm 處的吸光度與蛋白質(zhì)濃度呈線性關(guān)系。根據(jù)標準蛋白溶液繪制標準曲線，就可通過測定樣品在595 nm的吸光度計算樣品的蛋白質(zhì)濃度。然后根據(jù)公式計算生物樣品的可溶性蛋白質(zhì)含量。

2 實驗試劑與儀器

2.1 試劑

1)考馬斯亮藍試劑:取考馬斯亮藍G250 100 mg溶于50 mL 95%乙醇中，加入100 mL 85%(W/V)磷酸，用蒸餾水稀釋至1 000 mL，過濾后備用。

2)標準蛋白質(zhì)溶液:用0.2 mol/L pH 7.0磷酸緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)將結(jié)晶牛血清蛋白配制成1 mg/mL標準蛋白質(zhì)溶液。

3)磷酸緩沖液:用蒸餾水將KH2PO42.12 g和K2HPO45.56 g分別溶解，混合后定容至200 mL，配成0.2 mol/L pH 7.0的磷酸緩沖液。

2.2 儀器

紫外－可見光分光光度計、比色皿、移液槍、冷凍離心機、離心管、分析天平、藥匙、研缽、研杵、燒杯、量筒、試管、試管架、玻璃棒、剪刀。

3 實驗步驟

3.1 制作標準曲線

1)取7支試管，按如表1所示溶液量進行操作，每種濃度重復(fù)做3次。加入標準蛋白溶液和考馬斯亮藍后，立即搖勻，5～20 min內(nèi)以1號管為空白對照，在595 nm處測定吸光值，填入表1。

表1 標準溶液吸光度的測定

2)繪制標準曲線:以標準蛋白質(zhì)濃度為橫坐標，以A595為縱坐標，參照文獻[14]的方法，用Excel辦公軟件繪制蛋白質(zhì)標準曲線。

3.2 未知樣品蛋白質(zhì)含量測定

取待測植物材料1.0 g，用少量的石英砂和10 mL PBS研磨提取，研磨后經(jīng)兩步離心(12 000 g 6 min和26 900 g、16 min)，取其上清液即為蛋白提取液。將0.1 mL蛋白提取液和5 mL考馬斯亮藍試劑混合，2 min后即可測定其吸光度。每個樣品重復(fù)做5次，取其吸光度的平均值代入標準曲線方程，求出樣品蛋白質(zhì)濃度。然后代入式(1)計算植物材料蛋白質(zhì)含量。

4 注意事項

4.1 實驗儀器設(shè)備

1)用到的所有玻璃器皿必須用蒸餾水清洗干凈，晾干備用。因為在實驗過程中，仍有一些物質(zhì)干擾蛋白質(zhì)含量的測定，主要的干擾物質(zhì)有強堿性緩沖液、去污劑、Triton X－100及十二烷基硫酸鈉等[15]。所以在清洗玻璃器皿過程中使用去污劑、強堿性物質(zhì)時，一定要沖洗干凈。

2)比色皿內(nèi)外壁都需清洗，保證比色皿干凈透明，晾干或冷風(fēng)吹干后待用(濕潤的比色皿壁接觸考馬斯亮藍溶劑后會發(fā)藍)。為減小實驗誤差，測定前可先用少量待測液潤洗比色皿，然后再進行測定。

3)待測液體積大約為比色皿容積的2/3即可，溶液過滿容易外溢。流到比色皿外壁的待測液要及時用沾有酒精的吸水紙擦拭干凈，以免影響比色皿的透光率。

4)比色皿使用后，會殘留藍色染料，干燥后很難清洗，需用酒精及時洗滌干凈。一定不能將比色皿長期浸泡在酒精中，否則比色皿會因粘膠被溶解而散架 (比色皿上的兩塊透明玻璃是用膠粘上的)。

5)拿取比色皿時，只能接觸兩側(cè)的毛玻璃面，嚴禁用手指觸摸透光面[16]，以免留下指紋，影響測定準確性。

6)嚴禁用硬物擦拭比色皿的透光面，以免產(chǎn)生劃痕，應(yīng)使用鏡頭紙或絲綢順著同一方向擦拭干凈。

7)考馬斯亮藍可以與石英比色皿產(chǎn)生強烈的結(jié)合，因此本實驗建議使用玻璃或塑料比色皿[17]。

8)測試的同一批樣品必須使用同一套比色皿[18]，不同廠家、不同批次的比色皿透光率不同，影響測定結(jié)果。

9)分光光度計使用前應(yīng)預(yù)熱20 min[19]，使光源達到穩(wěn)態(tài)，此時測量的數(shù)值會比較穩(wěn)定。

10)使用移液管或移液槍移取液體體積要精確，為減小人為誤差，最好同一個人操作。

4.2 試劑的配制與保存

1)在配制考馬斯亮藍試劑時，應(yīng)先加入考馬斯亮藍G250粉末和乙醇，溶解后再加入磷酸，最后用蒸餾水定容?？捡R斯亮藍試劑必須要經(jīng)過過濾后才能使用，濾液應(yīng)為淺棕紅色，與蛋白質(zhì)結(jié)合后呈藍色，配制好的試劑可在4℃下棕色瓶中保存1個月。

2)考馬斯亮藍有G－250和R－250兩種類型。測定蛋白質(zhì)含量必須使用考馬斯亮藍G－250；考馬斯亮藍R－250與蛋白質(zhì)反應(yīng)緩慢，可以被洗脫，只能用于蛋白質(zhì)電泳條帶的染色[20]。

3)應(yīng)預(yù)先通過微量凱氏定氮法測定結(jié)晶牛血清蛋白的氮含量，根據(jù)其純度，再用磷酸緩沖液配制標準蛋白質(zhì)溶液[13]。配置好的標準蛋白質(zhì)溶液分裝后可冷凍保存6個月。

4)標準蛋白溶液母液(1 mg/mL)可以先分別稀釋成不同濃度梯度的標準溶液，然后分別吸取0.1 mL繪制標準曲線，以減少取樣誤差，稀釋液如表2所示。

表2 標準蛋白溶液的稀釋

5)標準蛋白質(zhì)溶液、考馬斯亮藍試劑、磷酸緩沖液恢復(fù)至室溫后再使用，因為低溫影響染色效果，并使比色皿壁產(chǎn)生水霧。

4.3 標準曲線的繪制

1)各種蛋白質(zhì)中堿性氨基酸(特別是精氨酸)和芳香族氨基酸含量不同，因此考馬斯亮藍法用于測定不同蛋白質(zhì)含量時有較大偏差，為減少這方面的偏差，在制作標準曲線時，一般以牛血清蛋白作為標準蛋白質(zhì)。

2)由于試劑保存時間及貯藏條件等因素的影響，各試劑成分會有變化，影響測量結(jié)果。因此，每次實驗均需重新繪制標準曲線。

3)實驗過程中，若考馬斯亮藍試劑不足，重新配置后，應(yīng)重新繪制標準曲線。

4)標準曲線上的每個濃度點應(yīng)做3個重復(fù)，若無異常值，則取3個重復(fù)的平均值；若有異常數(shù)據(jù)，則去掉異常數(shù)據(jù)后取平均值。若某個濃度點的3個數(shù)據(jù)全部異常，則應(yīng)重做該濃度點或者刪除該濃度點。

5)一般要求標準曲線的相關(guān)系數(shù)(r)達到0.99，才能保證實驗結(jié)果的精確性[14]。

6)標準蛋白濃度過高時，該濃度點會偏離標準曲線，應(yīng)將該點刪除。

7)徒手繪制標準曲線誤差較大，標準曲線應(yīng)采用Excel等辦公軟件繪制[14]。

4.4 樣品蛋白質(zhì)的提取

1)每種樣品建議做5個以上重復(fù)，取材要均一，以增加實驗結(jié)果的可靠性和穩(wěn)定性。

2)蛋白質(zhì)提取過程中用到的研缽、研杵等儀器及磷酸緩沖液需提前預(yù)冷，提取過程(包括離心)應(yīng)在低溫(0～4℃)下進行，以防止植物組織中的蛋白酶降解蛋白質(zhì)。

3)研磨要充分，研磨時應(yīng)先加2 mL磷酸緩沖液，研磨成勻漿后(提取液加入過多，葉片漂浮在液面上，難以研磨充分)，再用2～3 mL磷酸緩沖液繼續(xù)研磨提取。最后用剩余的磷酸緩沖液沖洗研缽和研杵，合并蛋白質(zhì)提取液，混勻后離心。

4.5 樣品吸光度的測定

1)測定樣品在595 nm處的吸光度時，以5 mL考馬斯亮藍試劑和0.1 mL磷酸緩沖液混勻后調(diào)零。

2)在加入考馬斯亮藍溶液和蛋白樣品混勻后，染料與蛋白質(zhì)的結(jié)合約需2 min達到平衡。在5～20 min內(nèi)，結(jié)合最為穩(wěn)定，此時測定吸光度最為可靠[21]。超過1 h蛋白質(zhì)就會明顯沉淀。

3)為避免反復(fù)清洗比色皿，測定標準樣品吸光度時，可從低濃度到高濃度測定，這樣干擾和誤差較小。

4)做標準曲線及測定樣品時，吸光度應(yīng)在0.1～0.6之間(常見實驗中吸光度一般要求在0.1～0.8)，因為考馬斯亮藍溶液在595 nm處的本底吸光度較高，約為0.2～0.3。所以樣品吸光度高于0.6時，吸光度與蛋白質(zhì)濃度已不成正比，此時應(yīng)將蛋白質(zhì)提取液用磷酸緩沖液稀釋至合適濃度后再進行測定。

5)不必每測定一個樣品清洗一次比色皿，同一處理的多個重復(fù)樣品可用同一個比色皿連續(xù)測定。不同處理的樣品應(yīng)清洗比色皿，并晾干或吹干后再進行測定。

6)測定結(jié)束后可用乙醇將比色皿中的藍色染料溶解洗滌下來，然后用蒸餾水沖洗干凈，晾干備用。

7)考馬斯亮藍試劑不與單體氨基酸及相對分子量小于3 kDa的多肽結(jié)合，多肽類激素和很多重要的活性肽分子量都低于3 kDa，考馬斯亮藍法不能用于這些蛋白質(zhì)和氨基酸的濃度測定[22]。

5 結(jié)束語

蛋白質(zhì)含量測定是生物學(xué)中的經(jīng)典實驗，該實驗涉及很多技術(shù)細節(jié)和專業(yè)知識，忽視任何一個細節(jié)都會導(dǎo)致實驗結(jié)果出現(xiàn)偏差，沒有經(jīng)驗的初學(xué)者測定的結(jié)果往往是錯誤的，他們既不知道實驗結(jié)果的可靠性，也不知道實驗失敗的原因。本文從5個方面系統(tǒng)總結(jié)了本實驗項目的操作細節(jié)，不僅有助于學(xué)生熟練掌握該項實驗技術(shù)，而且對其他類似實驗項目也具有很好的參考價值。我們已經(jīng)將上述實驗技術(shù)細節(jié)應(yīng)用到科研和教學(xué)中，使得蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果的準確性和穩(wěn)定性大大提高，也拓展了學(xué)生的專業(yè)知識，提高了學(xué)生的實驗技能，培養(yǎng)了學(xué)生嚴格、認真、細致的科研素質(zhì)。

[1]劉漢才，陳舒麗.生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗教程[M].北京:科學(xué)出版社，2013.

[2]高國全，王桂云.生物化學(xué)實驗[M].武漢:華中科技大學(xué)出版社，2014.

[3]胡瓊英，秦春，陳敏.生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗技術(shù)[M].3版.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2014.

[4]李凌.生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗指導(dǎo)[M].2版.北京:人民軍醫(yī)出版社，2015.

[5]BRADFORD M M.A rapid and sensitive method for the quantization of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein－dye binding[J].Analytical Biochemistry， 1976， 1(72):248－254.

[6]王貴.紫外可見分光光度計及其應(yīng)用[J].廣州化工，2016， 44(13):52－53.

[7]王鏡巖，朱圣庚，徐長法.生物化學(xué)[M].3版.北京:高等教育出版社，2002.

[8]LOWRY O H， ROSEBROUGH N J， FARR A L， et al.Protein measurement with the folin phenol reagent[J].Journal of Biological Chemistry， 1951， 193(1):265.

[9]王元秀，李華，張恒.生物化學(xué)實驗[M].武漢:華中科技大學(xué)出版社，2014.

[10]歐芹，林雪松.生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗教程[M].2版.北京:北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2015.

[11]羅先群，曹獻英.生物化學(xué)實驗[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2015.

[12]SEDMAK J J， GROSSBERG S E.A rapid， sensitive，and versatile assay for protein using Coomassie Brilliant Blue G250 [J]. Analytical Biochemistry， 1977，79(1):544－552.

[13]夏俊，段巧玲.醫(yī)學(xué)生物化學(xué)實驗與習(xí)題指導(dǎo)[M].合肥:中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)出版社，2016.

[14]馬宗琪，衣寧，趙文倩，等.生物學(xué)實驗中標準曲線的繪制——以蛋白質(zhì)標準曲線為例[J].實驗科學(xué)與技術(shù)，2014，12(5):8－10.

[15]何鳳田，連繼勤.生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗教程[M].北京:科學(xué)出版社，2016.

[16]何曉明，黨云潔，李志強，等.紫外光度實驗中比色皿的鑒別、使用和管理維護[J].實驗室科學(xué)，2016， 19(2):53－56.

[17]CHIAL H J， THOMPSON H B， SPLITTGERBER A G.A spectral study of the charge forms of Coomassie Blue G250[J].Analytical Biochemistry， 1993， 209(2):258－266.

[18]劉新，汪玉瓊，宋慶雄.淺談使用分光光度計易出現(xiàn)的幾個問題[J].福建分析測試，2007，16(4):50－52.

[19]李位.分光光度計使用中不容忽視的幾個問題[J].廣州化工，2016，44(11):172－174.

[20]薩姆布魯克，弗里奇，曼尼阿蒂斯.分子克隆實驗指南[M].2版.北京:科學(xué)出版社，1992.

[21]武金霞.生物化學(xué)實驗教程[M].北京:科學(xué)出版社，2012.

[22]FRIENDENAUER S，BERLET H H.Sensitivity and variability of the bradford protein assay in the presence of detergent[J].Analytical Biochemistry， 1989， 178(2):263－268.