楊金穎

(天津市武清區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，天津 301700)

頭痛滴丸是由川芎、藁本、菊花等8味中藥組成的復(fù)方制劑，具有疏風(fēng)止痛、涼肝熄風(fēng)之功，臨床用于治療血管性頭痛。阿魏酸是川芎、藁本的共有成分，木犀草苷是菊花的有效成分，二者均有一定的抗炎和鎮(zhèn)痛作用[1，2]，均為頭痛滴丸的主要活性成分。中藥制劑涉及多個(gè)成分，單一指標(biāo)成分不足以代表處方的整體作用，本試驗(yàn)采用HPLC法同時(shí)測(cè)定阿魏酸和木犀草苷兩指標(biāo)成分，為建立頭痛滴丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 高效液相色譜儀：安捷倫液相色譜儀1100系列(包括安捷倫色譜工作站、G1310A四元液相梯度泵、G1313A自動(dòng)進(jìn)樣器、G1314AVWD檢測(cè)器、CO-201柱溫箱)；分析柱：Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；BD211D型電子天平 (十萬分之一，Sarlorius提供)；AB204-N型電子分析天平(萬分之一，Mettler-Toledo提供)。

1.2試藥 阿魏酸對(duì)照品(批號(hào)110773-201313，含量以99.6%計(jì))、木犀草苷對(duì)照品(批號(hào)111720-201408，含量以94.9%計(jì))均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。頭痛滴丸為自制樣品(批號(hào)100001，100002，100003)。乙腈、磷酸為色譜純；水為娃哈哈純凈水。

2 含量測(cè)定方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱：Diamonsil-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫程序：0～15 min A-B(18∶82)，15～30 min A-B(18∶82→20∶80)，30～35 min A-B(20∶80→30∶70)；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：328 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μl。

2.2溶液的制備

2.2.1混合對(duì)照品溶液的制備 分別稱取阿魏酸和木犀草苷對(duì)照品適量，精密稱定，各置于50 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別得儲(chǔ)備液；各取適量?jī)?chǔ)備液置50 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得1 ml含阿魏酸19.74 μg和木犀草苷26.38 μg的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備 取研細(xì)的本品約0.15 g，精密稱定，置具塞三角瓶中，精密加入15 ml流動(dòng)相，密塞，稱定重量，然后超聲處理30 min，放至室溫，用流動(dòng)相補(bǔ)足減失的重量，搖勻，靜置，取上清液用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液。

2.2.3陰性對(duì)照溶液的制備 按處方比例分別稱取本處方中缺菊花藥材的陰性對(duì)照和缺川芎及藁本藥材的陰性對(duì)照，經(jīng)提取、萃取后，按照滴丸成型工藝用相應(yīng)輔料制備陰性供試品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.3專屬性試驗(yàn) 分別吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各10 μl，依“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果在該方法下樣品分離度好，陰性對(duì)照對(duì)測(cè)定無干擾。色譜圖見圖1。

2.4線性關(guān)系的考查 分別稱取阿魏酸和木犀草苷對(duì)照品適量，精密稱定，各置于50 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別得儲(chǔ)備液；再配成系列濃度混合對(duì)照品溶液(分別含阿魏酸2.01、4.02、12.05、20.08、32.13和40.16 μg/ml，含木犀草苷2.20、4.40、13.19、21.98、44.96和65.94 μg/ml)。依“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)分析，分別以阿魏酸和木犀草苷的峰面積值為縱坐標(biāo)(Y)，對(duì)照品濃度(μg/ml)為橫坐標(biāo)(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得阿魏酸回歸方程為Y=52.069X-0.111 7(r=0.999 9)，線性范圍為2.01～40.16 μg/ml；木犀草苷回歸方程為Y=12.279X+17.947(r=0.999 8)，線性范圍為2.20～65.94 μg/ml。

1.木犀草苷 2.阿魏酸

2.5精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，分別計(jì)算阿魏酸和木犀草苷峰面積的RSD值，結(jié)果分別為0.63%和0.57%，表明儀器精密度良好。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液(批號(hào)100001)，室溫放置，分別于0、2、4、8、12和24 h，依“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果阿魏酸和木犀草苷峰面積的RSD分別為0.89%和1.17%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)供試品(批號(hào)100001)6份，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，結(jié)果阿魏酸RSD為0.79%，木犀草苷RSD為1.22%，表明該方法的重現(xiàn)性良好。

2.8回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的供試品(批號(hào)100001)9份，每份約0.075 g，精密稱定，分別置于9個(gè)具塞三角瓶中，各取3份分別精密加入混合對(duì)照品(含阿魏酸濃度為0.032 8 mg/ml，木犀草苷濃度為0.031 6 mg/ml)4、5和6 ml，最終加溶劑為15 ml，超聲提取30 min，放至室溫，用流動(dòng)相補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置，取上清液0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液10 μl，依“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，阿魏酸和木犀草苷的平均回收率分別為100.33%和100.06%，RSD%分別為1.12%和1.27%。結(jié)果見表1和表2。

表1 阿魏酸加樣回收率試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果(n=9)

表2 木犀草苷加樣回收率試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果(n=9)

2.9樣品的測(cè)定 取3批頭痛滴丸樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積并計(jì)算3批樣品中阿魏酸和木犀草苷的含量，結(jié)果見表3。

表3 頭痛滴丸的含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1提取方法的考查 在供試品溶液制備方法中，提取溶媒研究中曾使用甲醇、70%甲醇、乙醇、70%乙醇和流動(dòng)相進(jìn)行提取，比較后發(fā)現(xiàn)用流動(dòng)相超聲提取的樣品得到的阿魏酸和木犀草苷的含量高，因此采用流動(dòng)相提取。研究中還對(duì)提取時(shí)間進(jìn)行了考查，分別超聲提取20、30、45和60 min，結(jié)果表明提取30 min時(shí)木犀草苷已提取完全，且雜質(zhì)較少。

3.2流動(dòng)相的選擇 本試驗(yàn)分別考查甲醇-磷酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液、甲醇-水溶液和乙腈-水溶液對(duì)色譜峰的分離能力，也考查等度洗脫和梯度洗脫，結(jié)果表明采用乙腈-磷酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫，可以將阿魏酸和木犀草苷實(shí)現(xiàn)較好的分離。對(duì)于檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇，綜合考慮《中國(guó)藥典》[3]、DAD檢測(cè)器、紫外全波長(zhǎng)掃描的結(jié)果，最終選擇328 nm為最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。

本試驗(yàn)采用高效液相色譜法同時(shí)對(duì)阿魏酸和木犀草苷進(jìn)行含量測(cè)定，并進(jìn)行了方法學(xué)研究及3批樣品的含量測(cè)定，結(jié)果表明該法簡(jiǎn)便準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好、專屬性較強(qiáng)，可有效地控制頭痛滴丸的質(zhì)量，為完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了參考依據(jù)，對(duì)中藥復(fù)方新藥研究及質(zhì)量控制提供參考。

1 鄒全飛,馬坤,陸榕.阿魏酸藥動(dòng)學(xué)研究進(jìn)展[J].藥物評(píng)價(jià)研究,2013,36(4):297-301

2 劉圓,李園園,馮婷婷,等.木犀草素鎮(zhèn)痛抗炎作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2010,31(15):2368-2370

3 中國(guó)藥典[S].一部.2015：41,311,38