馬鴻杰 毛新 鄧若娟 劉傳靈 傅月亮

克癀由三七、黃連、黃芩、黃柏、大黃、白花蛇舌草、山銀花、人工牛黃、皂角刺、人工麝香、石菖蒲、甘草等十六味中藥組成, 經(jīng)生物發(fā)酵等工藝加工制成膠囊, 具有清熱解毒、化瘀散結(jié)、活血利濕、利膽退黃等功效。其中三七為方中君藥, 有文獻(xiàn)報(bào)道［1］, 黃連、牛黃、黃芩、麝香、石菖蒲、甘草均能不同程度的抑制細(xì)菌生長, 黃連對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用最強(qiáng)；金銀花對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌均有不同程度的抑制作用［2］；牛黃解毒片對(duì)急性滲出性炎癥有明顯抑制作用, 對(duì)耐藥金黃色葡萄球菌等有明顯抑制作用、對(duì)綠膿桿菌等無明顯影響［3］；馬萬霞等［4］以大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn),結(jié)果表明5種中藥提取液對(duì)4種菌的抑菌效果明顯［5-7］?？笋ツz囊是應(yīng)用中藥發(fā)酵工藝并投入生產(chǎn)的為數(shù)不多的幾個(gè)品種之一, 發(fā)酵中藥所包含的成分極其復(fù)雜, 對(duì)其成分分離純化有較大的難度, 本文為了更加客觀科學(xué)的描述克癀膠囊的應(yīng)用功能, 采用了牛津杯法以及藥敏紙片法體外實(shí)驗(yàn)的方式進(jìn)一步驗(yàn)證了克癀膠囊對(duì)細(xì)菌的抑制作用。

1 材料與方法

1. 1 材料

1. 1. 1 菌種 金黃色葡萄球菌：國家微生物資源平臺(tái),第3代；白色念珠菌：國家微生物資源平臺(tái), 第2代；大腸埃希菌：中國食品藥品檢定研究院第, 第2代；銅綠假單胞菌：中國食品藥品檢定研究院, 第2代。

1. 1. 2 藥物 克癀膠囊(深圳同安藥業(yè)有限公司, 0.4 g/粒)；京制牛黃解毒片(北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠,0.6 g/片)；蒲地藍(lán)消炎膠囊(廣東心寶藥業(yè)科技有限公司,0.4 g/粒)；氨芐西林(中國食品藥品檢定研究院, 規(guī)格10 μg/ml)。上述藥品按照2015年版《中國藥典》鑒定合格。

1. 1. 3 試劑與儀器 MH瓊脂培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)；MH肉湯培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)；TSA平板(上海諾狄微生物科技有限公司)；3 ml 0.85%NaCl培養(yǎng)基(bioMerieux sa)；pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)；雙圈定量濾紙(中速)；立式高壓滅菌鍋；生物安全柜；生化培養(yǎng)箱；烘箱；打孔機(jī)；電子比濁儀。

1. 2 方法

1. 2. 1 藥液的制備 克黃膠囊抑菌作用初篩試驗(yàn)濃度：無菌取克癀膠囊16粒, 溶于25 ml pH=7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液中, 浸泡1～2 h, 4000 r/min, 離心30 min后, 無菌取上清液, 濃度為0.256 g/ml；氨芐西林對(duì)照品10 μg/ml, 用0.01 mol/L鹽酸、磷酸鹽緩沖液稀釋成1 μg/ml為陽性對(duì)照；pH=7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液為陰性對(duì)照。

克癀膠囊、蒲地藍(lán)消炎膠囊、京制牛黃解毒片藥液對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果對(duì)比初篩試驗(yàn)濃度：分別無菌取克癀膠囊8粒、5片京制牛黃解毒片、6粒蒲地藍(lán)消炎膠囊溶于10 ml pH=7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液中, 浸泡1～2 h,4000 r/min, 離心30 min后, 無菌取上清液, 濃度分別為0.32、0.30、0.24 g/ml。用pH=7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液分別對(duì)三種藥液進(jìn)行倍比稀釋, 濃度分別為0.32、0.16、0.08 g/ml, 0.30、0.15、0.075 g/ml, 0.24、0.12、0.06 g/ml。

藥敏紙片法抑菌試驗(yàn)濃度：上述方法制備克癀膠囊濃度分別為0.40、0.20、0.10、0.05 g/ml；蒲地藍(lán)膠囊濃度為濃度為0.32、0.16、0.08、0.04 g/ml；京制牛黃解毒片藥液濃度分別為 0.50、0.25、0.125、0.0625 g/ml。

1. 2. 2 菌懸液的制備 將受試菌種金黃色葡萄球菌(或大腸埃希菌或銅綠假單胞菌或白色念珠菌)接種至9 cm TSA平板 , 于 30～35℃培養(yǎng) 16～18 h ；取 3 ml 0.85%NaCl培養(yǎng)基 , 用無菌棉簽挑取數(shù)個(gè)單菌落, 研磨均勻, 滴管反復(fù)吹打均勻,用電子比濁儀測(cè)量麥?zhǔn)蠞舛? 取0.6、0.8、0.7、2.1 MCF濃度的菌懸液, 用平皿計(jì)數(shù)得出107cfu/ml菌懸液對(duì)應(yīng)的麥?zhǔn)蠞舛取?/p>

1. 2. 3 測(cè)定平板的制備 取直徑約9 cm的平皿, 倒入20～25 ml溫度＜45℃滅菌的MH瓊脂培養(yǎng)基, 鋪制約4 mm厚的測(cè)定板底層, 冷卻凝固后, 用無菌棉拭蘸取107個(gè)/ml(對(duì)應(yīng)的麥?zhǔn)蠞舛?的菌液(金黃色葡萄球菌或大腸埃希菌或銅綠假單胞菌或白色念珠菌), 在管內(nèi)壁液面上方旋轉(zhuǎn)緊壓,將多余菌液擠去, 然后在MH瓊脂培養(yǎng)基表面均勻涂布接種2次, 每次旋轉(zhuǎn)平板60°以確保接種菌的均勻分布, 最后沿平板內(nèi)緣涂抹1周。接種好的平板, 可敞開蓋子在室溫下干燥 3～5 min。

1. 2. 4 藥敏紙片擴(kuò)散法 用打孔機(jī)將10張雙圈定量濾紙(中速)打出直徑7 mm空白紙片, 置于玻璃平皿中, 用滅菌袋封好, 121℃滅菌30 min, 取出放置 37℃干燥箱烘干。用鑷子夾取已滅菌紙片, 在每個(gè)接種的MH瓊脂培養(yǎng)基平板中貼4個(gè)滅菌紙片, 紙片間隔、紙片與培養(yǎng)基邊緣的距離應(yīng)≥2 cm。

2 結(jié)果

2. 1 初篩試驗(yàn)(牛津杯法)

2. 1. 1 克癀膠囊抑菌作用 在生物安全柜中, 將4個(gè)牛津杯均勻放置在4種菌測(cè)定平板上, 牛津杯間隔距離應(yīng)≥2 cm,其中2個(gè)牛津杯分別加入200 μl濃度0.256 g/ml的克癀膠囊藥液、1個(gè)加入200 μl含1 μg/ml的氨芐西林對(duì)照品、1個(gè)加入pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液200 μl作為陰性對(duì)照。置陶瓦蓋內(nèi)于37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h, 觀察并測(cè)量抑菌圈直徑的大小(抑菌圈越大說明其抑菌作用越強(qiáng))。克癀膠囊對(duì)金黃色葡萄球菌有一定抑菌效果, 但低于氨芐西林, 對(duì)大腸埃希菌或銅綠假單胞菌或白色念珠菌無抑菌作用。見表1。

2. 1. 2 克癀膠囊、蒲地藍(lán)消炎膠囊、京制牛黃解毒片藥液對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果初步對(duì)比 在牛津杯中分別加入3個(gè)不同濃度的克癀膠囊藥液、蒲地藍(lán)膠囊藥液、京制牛黃解毒片藥液和pH=7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液(陰性對(duì)照)各200 μl。37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后, 觀察各濃度藥液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌性, 測(cè)量抑菌圈直徑的大小。克癀膠囊藥液的濃度對(duì)金黃色葡萄球菌抑制有關(guān), 即藥液濃度越高,抑菌能力越強(qiáng)。見表2。

表1 克癀膠囊藥液對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌的抑菌初篩結(jié)果(cm)

表2 不同濃度的克癀膠囊、蒲地藍(lán)消炎膠囊、京制牛黃解毒片對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌性結(jié)果(cm)

2. 2 克癀膠囊對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC值測(cè)定

2. 2. 1 藥敏紙片擴(kuò)散法 平皿1分別加入80 μl的0.16g/ml蒲地藍(lán)消炎膠囊藥液、0.40 g/ml克癀膠囊藥液、0.20 g/ml克癀膠囊藥液、pH=7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液(陰性對(duì)照)；平皿2分別加入80 μl的0.16 g/ml蒲地藍(lán)消炎膠囊藥液、0.20 g/ml克癀膠囊藥；0.10 g/ml克癀膠囊藥液、pH=7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液(陰性對(duì)照)。將測(cè)定平皿于37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后, 觀察并測(cè)量抑菌圈直徑的大小?？笋ツz囊對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為0.10～0.20 g/ml。見表3。

2. 2. 2 微量肉湯稀釋法 (96孔板法)0.80 g/ml的克癀膠囊藥液, 用移液槍無菌吸取 100 μl, 注入 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板, 平行2個(gè)孔, 然后加入MH肉湯培養(yǎng)基做連續(xù)4次對(duì)倍稀釋, 得出0.40、0.20、0.10、0.05 g/ml的克癀膠囊藥液；制作0.32 g/ml濃度的蒲地藍(lán)消炎膠囊藥液作為起始濃度, 同法稀釋得出0.32、0.16、0.08、0.04 g/ml的蒲地藍(lán)膠囊藥液作為對(duì)照；將以上藥液孔加入含菌量≤100 cfu的金黃色葡萄球菌20 μl/孔,用20 μl菌液代替藥液、加入100 μl MH培養(yǎng)基作為陽性對(duì)照, 20 μl MH培養(yǎng)基加入100 μl MH培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。置37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后, 置于顯微鏡下觀察是否有菌生長, 每孔分別取30 μl 培養(yǎng)物用 TSA平板上涂布, 于30～35℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h, 觀察是否有菌生長?？笋ツz囊對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC值為0.10～0.20 g/ml。見表4。

表3 不同濃度的克癀膠囊對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用(cm)

表4 微量肉湯稀釋法對(duì)克癀膠囊對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC值的測(cè)定

3 討論

抗生素的應(yīng)用使人類許多嚴(yán)重的細(xì)菌感染性疾病得到有效控制。然而由于抗生素的不合理使用導(dǎo)致了大量耐藥性細(xì)菌的出現(xiàn), 降低了現(xiàn)有抗生素的應(yīng)用效率, 耐藥性細(xì)菌感染嚴(yán)重地威脅著人類的健康［8,9］。研究和開發(fā)抗菌中藥對(duì)解決耐藥菌株的產(chǎn)生和抗生素短缺問題具有重要意義, 傳統(tǒng)中藥對(duì)常見病原細(xì)菌具有一定的抑制作用。但不同中藥對(duì)不同細(xì)菌表現(xiàn)不同的抑菌作用［10,11］。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 克癀膠囊藥液的濃度對(duì)金黃色葡萄球菌抑制有關(guān), 即藥液濃度越高, 抑菌能力越強(qiáng), 其對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為0.10～0.20 g/ml。而克癀膠囊對(duì)大腸埃希菌或銅綠假單胞菌或白色念珠菌無抑菌作用。通過研究可以看到, 克癀膠囊的對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用較強(qiáng), 且隨著濃度的提高, 其抑菌能力越強(qiáng)。而另外2種藥物對(duì)金黃色葡萄球菌的的體外抑制作用較弱。目前, 金黃色葡萄球菌耐藥性問題是臨床治療中面臨的一大難題。大量研究報(bào)道也指出,黃連對(duì)耐甲氧西林的葡萄球菌具有一定的抑菌作用［12,13］, 克癀膠囊成分較為復(fù)雜, 如果能夠進(jìn)一步對(duì)克癀膠囊的抑菌機(jī)理進(jìn)行闡述, 將有助于在金葡菌感染中嘗試應(yīng)用中藥克簧進(jìn)行治療。在傳統(tǒng)中藥中進(jìn)行抗菌藥物的發(fā)掘, 將有助于發(fā)揮傳統(tǒng)中藥在臨床抗感染中的應(yīng)用, 本研究將為克癀膠囊的臨床應(yīng)用提供科學(xué)的的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

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