彭海山 黃華潔 楊潔霞 侯亞萍 郭芳芳 齊一鳴 尹愛華

【摘要】 目的? ?探討無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測（NIPT）在產(chǎn)前篩查中的臨床應(yīng)用價值。方法 收集23 852例孕婦檢測指征和結(jié)果，對提示高風(fēng)險孕婦建議進一步行有創(chuàng)產(chǎn)前診斷，對比分析NIPT與核型或微陣列結(jié)果。結(jié)果? ?23 852例孕婦的檢測指征中，以血清學(xué)篩查臨界風(fēng)險（30.18%）及高風(fēng)險（26.14%）居多。NIPT共檢出446例高風(fēng)險病例，常見的21?、18?、13?三體綜合征占高風(fēng)險總例數(shù)的37.39%。其中有226例選擇進一步行有創(chuàng)產(chǎn)前診斷，確診21?三體綜合征高風(fēng)險67例、18?三體綜合征14例、13?三體綜合征12例、性染色體異常54例、染色體缺失或重復(fù)57例、其他染色體數(shù)目異常21例以及多條染色體異常1例，NIPT診斷21?三體綜合征的PPV為88.06%，18?三體綜合征的PPV為78.57%，13?三體綜合征的PPV為33.33%，性染色體的陽性預(yù)測值（PPV）為33.33%，染色體缺失/重復(fù)的PPV為15.79%，其他染色體數(shù)目異常的PPV為4.76%。21?、18?、13?三體綜合征的復(fù)合PPV達(dá)79.57%。在對NIPT低風(fēng)險孕婦的隨訪中檢出8例染色體異常病例。結(jié)論? ?NIPT對21?、18?、13?三體綜合征具有較高的檢測效能，但是仍然存在假陽性與假陰性的局限性，僅可作為篩查手段，在臨床工作中應(yīng)做好NIPT檢測前和檢測后的咨詢工作。

【關(guān)鍵詞】? 無創(chuàng)產(chǎn)前基因篩查;應(yīng)用價值;指征;陽性預(yù)測值

【Abstract】 ObjectiveTo assess the application value of non?invasive prenatal testing （NIPT） in prenatal screening. MethodsThe testing indications and results of 23 852 pregnant women who underwent NIPT were collected. Those with a potential high risk further received invasive prenatal diagnosis. The detection results between NIPT and karyotyping and chromosomal microarray analysis （CMA） were statistically compared. Results? ? Among the testing indications of 23 852 pregnant women，the critical risk （30.18%） and high risk （26.14%） of serum screening accounted for the dominant percentage. NIPT demonstrated 446 patients were high risk cases and 37.39% of them were diagnosed with 21?，18? and 13?trisomy syndrome. Among them，226 cases chose to further receive invasive prenatal diagnosis and 67 women were diagnosed with high?risk 21?trisomy syndrome，14 with 18?trisomy syndrome，12 with 13?trisomy syndrome，54 with sex chromosomal abnormality，57 with chromosomal deletion/duplication，21 with other chromosomal abnormality and 1 with multiple chromosomal abnormalities. The positive predictive value of NIPT in the diagnosis of 21?trisomy syndrome was 88.06%，78.57% for 18?trisomy syndrome，33.33% for 13?trisomy syndrome，33.33% for sex chromosomal abnormality，15.79% for chromosomal deletion/duplication and 4.76% for other chromosomal abnormality，respectively. The composite positive predictive value for 21?，18? and 13?trisomy syndrome was up to 79.57%. During subsequent follow?up，chromosomal abnormality was detected in 8 low?risk pregnant women by NIPT. ConclusionsNIPT possesses relatively high efficiency in the diagnosis of 21?，18? and 13?trisomy syndrome，whereas it still yields false negative/positive outcomes. Therefore，NIPT can serve as a screening tool. Comprehensive pre? and post?NIPT counseling should be performed in clinical practice.

【Key words】 Non?invasive prenatal testing;Application value;Indication;Positive predictive value

染色體異常是出生缺陷的最常見原因之一[1]。我國每年約有10萬例染色體異?；純撼錾?，出生缺陷成為影響我國人口素質(zhì)及群體健康水平的公共衛(wèi)生問題[2?3]。預(yù)防出生缺陷的最有效手段是使用產(chǎn)前篩查與產(chǎn)前診斷干預(yù)[1，3?4]。近年產(chǎn)前診斷模式逐步向減少低危人群的有創(chuàng)檢查，提高高危人群的有效檢出發(fā)展[5]。目前，我國產(chǎn)前篩查與產(chǎn)前診斷仍以血清學(xué)篩查和有創(chuàng)產(chǎn)前診斷為主要方式，但存在假陽性率高與流產(chǎn)風(fēng)險的問題[6?7]。隨著無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測（NIPT）技術(shù)的問世與興起，以其安全、準(zhǔn)確、快速等優(yōu)點迅速受到廣泛關(guān)注與應(yīng)用，進一步實現(xiàn)了減少有創(chuàng)檢查、提高有效檢出的理念。本文就在廣東省婦幼保健院接受NIPT檢測的23 852例孕婦信息及結(jié)果進行回顧性分析，探討NIPT在產(chǎn)前篩查中的臨床應(yīng)用價值。

對象與方法

一、研究對象

選擇2015年1月至2017年12月在我院就診并接受NIPT檢測的孕婦。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：孕12周以上，單胎妊娠，符合國家技術(shù)規(guī)范的適用和慎用標(biāo)準(zhǔn)且自愿接受NIPT檢測的孕婦。排除標(biāo)準(zhǔn)：①夫婦一方有明確染色體異常者;②1年內(nèi)接受過異體輸血，移植手術(shù)，細(xì)胞治療者;③超聲提示胎兒結(jié)構(gòu)異常者;④基因遺傳病家族史或胎兒罹患基因病高風(fēng)險者;⑤母親孕期合并惡性腫瘤者。剔除臨床信息不全與檢測失敗者，共納入23 852例孕婦。孕婦年齡15～50歲、中位年齡31歲，孕12～38周、中位孕周22周。檢測前告知所有孕婦各項產(chǎn)前診斷方法的臨床適應(yīng)證、局限性及可能存在的風(fēng)險，經(jīng)過充分知情選擇，孕婦均簽署知情同意書。本研究符合倫理標(biāo)準(zhǔn)并通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。

二、檢測方法

1.標(biāo)本采集與處理

抽取孕婦外周靜脈血8 ml置于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管或游離核酸采樣管中，4 ℃或室溫（無創(chuàng)產(chǎn)前篩查采血管）保存，8 h或3 d（無創(chuàng)產(chǎn)前篩查采血管）內(nèi)分離血漿。4 ℃、1 600×g離心10 min，留取上層血漿，再以16 000×g離心10 min，最后分裝成每管600 μl的血漿于?80℃冰箱保存。

2.高通量測序無創(chuàng)基因產(chǎn)前篩查檢測

收到標(biāo)本后采用美國貝克曼Biomek 4000全自動化工作站和博奧晶芯胎兒染色體非整倍體檢測試劑盒提取血漿游離DNA及制備文庫，具體操作嚴(yán)格按照儀器和試劑盒說明書進行。通過質(zhì)量檢測的文庫使用博奧生物BioelectronSeq4000基因測序儀和賽默飛Proton高通量測序平臺檢測。測序后，通過序列的比對、拼接等生物信息學(xué)處理，對不同染色體水平進行統(tǒng)計，識別胎兒染色體是否非整倍體，并通過統(tǒng)計學(xué)公式得出胎兒患染色體非整倍體疾病的風(fēng)險 （尤其針對21?、l8?、13?三體綜合征）。采用基于二元假設(shè)的Z值判斷某條染色體是否有拷貝數(shù)的異常，主要判斷標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)Z值≥3時，結(jié)果提示為非整倍體高風(fēng)險或重復(fù);當(dāng)Z值為?2.9～2.9時，結(jié)果提示為非整倍體低風(fēng)險;當(dāng)Z值≤?3時，提示為單體可能性或缺失。

3.NIPT結(jié)果驗證及隨訪

無創(chuàng)基因檢測提示低風(fēng)險的孕婦，建議在醫(yī)師指導(dǎo)下定期進行常規(guī)產(chǎn)檢;無創(chuàng)基因檢測提示高風(fēng)險或缺失或重復(fù)的孕婦，建議進一步行羊水或臍血穿刺，通過染色體核型分析結(jié)果或染色體微陣列（CMA）結(jié)果驗證無創(chuàng)結(jié)果的準(zhǔn)確性。本研究對納入病例均進行電話隨訪。結(jié)果分析時剔除未產(chǎn)前診斷及失訪病例。高風(fēng)險孕婦隨訪至有妊娠結(jié)局出現(xiàn)，低風(fēng)險孕婦則隨訪至新生兒出生后。隨訪內(nèi)容包括孕期B超是否異常，孕婦妊娠結(jié)局，新生兒體檢結(jié)果，染色體核型結(jié)果（包括羊水臍血或新生兒外周血）。新生兒體檢無明顯異常者視為正常，新生兒異常、流產(chǎn)、死胎、引產(chǎn)、夭折等則根據(jù)出生后體格檢查、基因檢測結(jié)果、B超、病理結(jié)果等方面具體分析。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

所有計數(shù)資料用頻數(shù)和頻率表示。無創(chuàng)結(jié)果和核型或CMA結(jié)果比較則通過靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值（PPV）、陰性預(yù)測值（NPV）進行評估。靈敏度=真陽性病例數(shù)/（真陽性病例數(shù)+假陰性病例數(shù)），特異度=真陰性病例數(shù)/（真陰性病例數(shù)+假陽性病例數(shù)），PPV=真陽性病例數(shù)/（真陽性病例+假陽性病例），NPV=真陰性病例數(shù)/（真陰性病例+假陰性病例）。

結(jié)果

一、孕婦的NIPT指征構(gòu)成及結(jié)果分析

23 852例行NIPT孕婦的指征構(gòu)成以血清學(xué)篩查臨界風(fēng)險（30.18%）及高風(fēng)險（26.14%）居多，見表1。NIPT共檢出446例高風(fēng)險，常見的21?、18?、13?三體綜合征占高風(fēng)險總例數(shù)的37.39%（166/444），性染色體異常占23.20%（103/444），缺失或重復(fù)占33.78%（150/444），其他染色體三體綜合征比例較低，占5.18%。NIPT 446例高風(fēng)險病例中，血清學(xué)合并超聲異?；虿涣荚挟a(chǎn)史以及超聲異常合并不良孕產(chǎn)史者比例較高，見表2。

二、NIPT高風(fēng)險者的染色體核型及CMA分析及妊娠結(jié)局隨訪

446例NIPT高風(fēng)險孕婦中有226例選擇進一步行有創(chuàng)產(chǎn)前診斷，其中經(jīng)染色體核型分析或CMA確診異常的共102例，包括21?三體綜合征59例、 18?三體綜合征11例、 13?三體綜合征4例、性染色體異常18例、染色體缺失或重復(fù)9例、其他染色體三體綜合征1例。NIPT診斷21?三體綜合征的PPV為88.06%，18?三體綜合征的PPV為78.57%，13?三體綜合征的PPV為33.33%，性染色體的PPV為33.33%，染色體缺失/重復(fù)的PPV為15.79%，其他染色體數(shù)目異常的PPV為4.76%。21?、18?、13?三體綜合征的復(fù)合PPV達(dá)79.57%，見表3。

未行產(chǎn)前診斷的220例高風(fēng)險病例中，成功隨訪了90例，其中出生后體檢正常56例（NIPT結(jié)果為染色體重復(fù)或缺失），出生發(fā)現(xiàn)扁平鼻梁1例;因超聲異常引產(chǎn)5例;未行產(chǎn)前診斷直接引產(chǎn)共12例，其中1例引產(chǎn)后觀察外觀正常，8例為流產(chǎn)、胎死宮內(nèi)或早產(chǎn)夭折，7例拒絕產(chǎn)前診斷但未作說明。

三、NIPT低風(fēng)險孕婦的隨訪結(jié)果

對23 408例無創(chuàng)基因檢測篩查中結(jié)果為低風(fēng)險的孕婦進行電話隨訪，截至2018年4月30日，隨訪成功15 318例，隨訪成功率達(dá)65.44%。成功隨訪的低風(fēng)險孕婦中，出生體檢正常14 765例（96.39%）、出生體檢異常223例（1.46%）、流產(chǎn)或死產(chǎn)162例（1.06%）、出生后死亡30例（0.20%）;檢出染色體異常8例，其中18?三體假陰性（后確診為18?三體嵌合體）1例，45，X假陰性1例，X染色體2 Mb重復(fù)1例，6號染色體8.2 MB缺失1例，9號染色體重復(fù)13.5 Mb 1例，21號染色體重復(fù)1.26 Mb 1例，10號染色體缺失7.7 Mb 1例，4號染色體18 Mb雜合性缺失1例。NIPT診斷各高風(fēng)險類別的靈敏度、特異度、NPV見表4。

討論

自1997年香港中文大學(xué)盧煜明教授發(fā)現(xiàn)了母體外周血中存在胎兒游離DNA，隨著新一代測序技術(shù)的發(fā)展，目前已可使用高通量測序技術(shù)檢測母體外周血中胎兒游離DNA判斷胎兒染色體異常。根據(jù)我國NIPT工作開展的經(jīng)驗，國家衛(wèi)生健康委員會也總結(jié)了試點工作經(jīng)驗并結(jié)合國內(nèi)外研究成果制定了我國《孕婦外周血胎兒游離DNA產(chǎn)前篩查與診斷技術(shù)規(guī)范》指導(dǎo)NIPT工作的開展[8]。本研究顯示，血清學(xué)篩查臨界風(fēng)險為最常見指征，其次為血清學(xué)篩查高風(fēng)險、單純高齡和一些其他情況，包括孕期用藥、X線接觸史、乳腺纖維腺瘤切除術(shù)、甲狀腺功能異常等。這一結(jié)果與既往報道相似[3，9]。在NIPT推廣應(yīng)用前，血清學(xué)篩查高風(fēng)險和高齡孕婦一般建議行有創(chuàng)產(chǎn)前診斷，抽取羊水、臍血或絨毛做染色體核型分析以確定胎兒染色體情況。雖然介入性產(chǎn)前診斷準(zhǔn)確度高，但是容易引起宮內(nèi)感染、流產(chǎn)等，導(dǎo)致了一部分孕婦依從性差，也增加了孕婦的心理負(fù)擔(dān)。NIPT作為篩查手段中靈敏度最高的技術(shù)，可有效減少這部分孕婦的穿刺率[5，10?12]。因此，越來越多的血清學(xué)篩查異常孕婦以及高齡孕婦選擇NIPT。

隨著NIPT的廣泛應(yīng)用與發(fā)展，擴展NIPT檢測譜的研究也在逐年增加，但目前臨床上仍主要用于檢測常見的染色體非整倍體即21?、18?、13?三體綜合征[13]。本研究446例結(jié)果異常的孕婦中，常見染色體非整倍體（21?、18?、13?三體綜合征）占了37.39%。國內(nèi)外關(guān)于NIPT在常見染色體非整倍體的診斷效能評價有很多，張麗科等[13]分析了1 207例孕婦的NIPT結(jié)果，21?、18?三體綜合征靈敏度皆為100%，PPV分別為87.5%和71.43%;羅麗雙等[12]報道了5 756例孕婦NIPT的21?、13?、18?三體綜合征及性染色體異常的PPV分別為86%、40%、25%和73%;Petersen等[14]研究顯示，13?、18?、21?三體綜合征的PPV為45%、76%、84%。本研究中，NIPT診斷21?、18?、13?三體綜合征的靈敏度分別為100%、91.67%、100.00%，PPV則為88.06%、78.57%、33.33%。與多數(shù)研究結(jié)果相近，21?三體綜合征的PPV最高，13?三體綜合征的PPV較低，可能與樣本例數(shù)少，13號染色體鳥嘌呤和胞嘧啶（GC）含量較低導(dǎo)致測序偏差及13?三體綜合征孕婦胎盤小，胎兒游離DNA釋放較少有關(guān)[15?16]。盡管13?三體綜合征PPV偏低，21?、18?、13?三體綜合征復(fù)合PPV可達(dá)79.57%，由此可知，NIPT對21?、18?、13?三體綜合征有較好的診斷效能。另外，本研究還分析了NIPT對常見染色體非整倍體以外的其他染色體異常的診斷效能，結(jié)果顯示對于性染色體異常篩查的靈敏度為90%，特異度為99.77%，PPV為33.33%，NPV為99.98%;對染色體缺失/重復(fù)篩查的靈敏度為64.29%，特異度為99.69%，PPV為15.79%，NPV為99.97%;對其他染色體數(shù)目異常篩查的PPV只有4.76%，但NPV有100%?？梢姡琋IPT在其他染色體異常檢測中準(zhǔn)確性不高，但仍有一定的參考價值，排除效果較好。因此，當(dāng)NIPT提示相關(guān)異常時，更應(yīng)該謹(jǐn)慎咨詢，進一步行介入性產(chǎn)前診斷，通過染色體核型和CMA確診。

雖然NIPT對常見染色體非整倍體的篩查有著較好的檢測效能，但是它仍然存在局限性即假陽性和假陰性，本研究也存在假陽性和假陰性的案例。由于無創(chuàng)產(chǎn)前基因篩查檢測的并非胎兒自身的DNA，而是由胎盤凋亡釋放入母血中的游離DNA，并不能完全代表胎兒本身，且受到多種因素的影響。當(dāng)母體存在染色體異常、拷貝數(shù)變異，母親患惡性腫瘤，限制性胎盤嵌合，雙胎之一停育都會引起無創(chuàng)結(jié)果的假陽性[17]。母血中胎兒游離DNA濃度過低，胎盤正常但是胎兒異常則會導(dǎo)致假陰性的出現(xiàn)。因此，對選擇NIPT進行胎兒染色體異常篩查的孕婦，檢測前和檢測后的咨詢工作非常重要，應(yīng)充分告知孕婦，無創(chuàng)的陽性結(jié)果需做進一步確診，陰性結(jié)果仍需結(jié)合后續(xù)B超檢查排除異常[18]。

綜上所述，無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測對21?、18?、13?三體綜合征具有較高的檢測效能，但是仍然存在假陽性與假陰性的局限性，僅可作為篩查手段，在臨床工作中應(yīng)做好NIPT檢測前和檢測后的咨詢工作。NIPT在其他染色體異常中準(zhǔn)確度不高，如何提高預(yù)測的準(zhǔn)確度，是我們今后的研究重點。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2018?06?18）

（本文編輯：林燕薇）