吳玨堃 熊志勇

【摘要】 目的 研究KIF4A基因在乳腺癌中的表達情況，并探討其可能的作用機制及表達差異與預后的關系。方法 從腫瘤基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫收集乳腺癌數(shù)據(jù)集，下載KIF4A基因表達譜資料，相對表達量的中位數(shù)為5.77，以5.77為節(jié)點將乳腺癌患者分為KIF4A高表達組與KIF4A低表達組，分析其與病例特征的關系;利用Kaplan?Meier Plotter分析KIF4A與乳腺癌患者預后的相關性。結果 KIF4A在乳腺癌組織中的表達明顯高于正常乳腺組織及乳腺細胞（P<0.01），KIF4A主要分布于細胞核和細胞骨架中，KEGG通路分析和GO功能分析顯示KIF4A與細胞周期、RNA轉運、P53信號通路、細胞分裂、端粒維持重組等功能有關。KIF4A與Ki67的表達高度正相關（P<0.001），預后分析表明KIF4A表達越高，乳腺癌患者總生存時間和無復發(fā)生存時間更短（P<0.001）。KIF4A的表達與淋巴結陰性乳腺癌的總生存率具有負相關性（P<0.001），而與淋巴結陽性乳腺癌的總生存率則不相關。結論 在乳腺癌中，KIF4A高表達并且和患者的預后相關，KIF4A在乳腺癌的發(fā)生中可能起著重要作用。

【關鍵詞】 乳腺癌;功能分析;KIF4A;預后

【Abstract】 Objective? To investigate the expression level of KIF4A gene in breast cancer，explore the potential mechanism and unravel the relationship between the expression difference and clinical prognosis. Methods? Data sets of breast cancer patients were collected from The Cancer Genome Atlas （TCGA） database and the expression profile of KIF4A gene was downloaded. The median relative expression level was 5.77. All participants were divided into the high? and low?expression groups according to the value of 5.77. The relationship between KIF4A gene expression and clinical characteristics was analyzed. Kaplan?Meier plot was utilized to analyze the correlation between KIF4A gene and clinical prognosis of breast cancer patients. Results? The expression level of KIF4A in the breast cancer tissues was significantly higher than that in the normal breast tissues and cells （P<0.01）. KIF4A was mainly distributed in the nucleus and cytoskeleton. KEGG pathway analysis and GO function analysis demonstrated that KIF4A was associated with cell cycle，RNA transport，P53 signaling pathway，cell division，telomere maintenance and recombination，etc. The KIF4A was positively correlated with the expression of Ki67 （P<0.001）. Prognostic analysis revealed that the higher the expression of KIF4A，the shorter the overall survival and recurrence?free survival time of breast cancer patients （P<0.001）. The expression of KIF4A was negatively correlated with the overall survival rate of patients diagnosed with lymph node?negative breast cancer （P<0.001），whereas it was not associated with that of their counterparts with lymph node?positive breast cancer. Conclusion? KIF4A is highly expressed in breast cancer patients and is associated with clinical prognosis. KIF4A may play a pivotal role in the incidence of breast cancer.

【Key words】 Breast cancer;Functional analysis;KIF4A;Prognosis

乳腺癌是女性常見、病死率高的惡性腫瘤之一[1]。乳腺癌的發(fā)生與遺傳、激素影響、生活方式等因素相關，但其具體發(fā)病機制尚未明確。乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程復雜，涉及多條信號通路[2]。其中驅動蛋白家族蛋白（KIF）作為在有絲分裂中沿著微管轉運染色體的工具分子在乳腺癌的疾病進展中發(fā)揮著重要作用[3]。KIF是一類馬達蛋白，利用ATP水解釋放的能量，使其自身及轉運的貨物沿微管運動，參與細胞內物質運輸、細胞的分裂并信號轉導，其家族有14個發(fā)揮著不同功能的成員，其中KIF4A可在染色體收縮和有絲分裂的機械隔離中發(fā)揮作用[4]。研究表明，KIF4A與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[5?9]。阿霉素可誘導乳腺癌細胞系凋亡，其機制可能涉及下調KIF4A進而導致DNA修復酶聚腺苷酸二磷酸核糖轉移酶?1（PARP?1）上調[10]。但是對KIF4A基因在乳腺癌中的表達及具體機制仍未明確，在本研究中，筆者通過腫瘤基因組圖譜TCGA數(shù)據(jù)庫，研究KIF4A在乳腺癌中的表達及其對預后的影響，并分析其在乳腺癌中可能的生物功能，為進一步研究KIF4A在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機制提供線索和思路。

材料與方法

一、 數(shù)據(jù)收集

利用Bioconductor/TCGAbiolinks函數(shù)包從腫瘤基因圖譜TCGA數(shù)據(jù)庫下載并預處理乳腺癌數(shù)據(jù)集的mRNA表達數(shù)據(jù)，在人類蛋白圖譜數(shù)據(jù)庫中驗證KIF4A蛋白在乳腺癌中的表達水平，利用Kaplan?Meier Plotter在線分析KIF4A與乳腺癌患者預后的相關性。利用Chipbase在線分析基因表達相關性。

二、KIF4A的相關基因分析

通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析KIF4A基因在乳腺癌組織中具有相關性的基因群，設置相關系數(shù)>0.4或<-0.4，篩選出638個基因，進一步通過DAVID分析軟件對KIF4A具有相關性的基因群進行KEGG和GO分析。

三、統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0分析數(shù)據(jù)。計量資料以x±s表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，基因表達之間的關系采用Pearson相關分析，生存分析采用Kaplan?Meier Plotter。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

一、KIF4A基因在乳腺癌中的表達

利用TCGA數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)分析了KIF4A基因在113名正常人的乳腺組織、1 090例乳腺癌患者中mRNA的表達情況，KIF4A在乳腺癌中的相對表達水平為6.91±0.32，高于正常乳腺組織的相對表達水平0.33±0.07（t=5.978，P<0.01）。人類蛋白圖譜數(shù)據(jù)庫中的臨床樣本分析結果顯示，KIF4A在乳腺癌組織中的表達量高于正常乳腺組織，見圖1。

二、KIF4A基因在乳腺癌細胞內分布情況

人類蛋白圖譜數(shù)據(jù)庫收集到乳腺癌及乳腺正常組織的免疫組織化學檢查（免疫組化）圖，結果顯示KIF4A主要分布于細胞核和細胞骨架中，見圖2。

三、KIF4A在乳腺癌中的功能分析

分析TCGA數(shù)據(jù)庫中乳腺癌的基因表達數(shù)據(jù)，采用Pearson相關分析篩選出與KIF4A表達具有正相關關系的基因563個，具有負相關關系的基因75個。進一步通過DAVID分析軟件對KIF4A具有相關性的基因群進行KEGG和GO分析，KEGG通路分析顯示KIF4A與DNA復制、范可尼貧血途徑、細胞周期、卵母細胞減數(shù)分裂、RNA轉運、人類親T細胞病毒?1（HTLV?1）感染、嘌呤代謝、mRNA監(jiān)測途徑、病毒致癌、P53信號通路等相關，GO功能分析顯示KIF4A與細胞分裂、核分裂、DNA復制、姐妹染色單體結合、有絲分裂細胞G1/S期、有絲分裂細胞G2/M期、染色體轉移、染色體分離、重組啟動、端粒維持重組相關。Ki67是一種增殖細胞相關的核抗原，其功能與有絲分裂密切相關，可反映腫瘤細胞的增殖和侵襲能力，分析乳腺癌中KIF4A? mRNA表達與Ki67表達的相關性，結果顯示它們高度相關（r =0.94、P<0.001），見圖3。

四、 KIF4A表達與乳腺癌預后的相關性

從TCGA數(shù)據(jù)庫中下載乳腺癌KIF4A mRNA表達數(shù)據(jù)和相應腫瘤患者生存時間數(shù)據(jù)，相對表達量的中位數(shù)為5.77，以5.77為節(jié)點將乳腺癌患者分為KIF4A高表達組與KIF4A低表達組。利用Kaplan?Meier Plotter對這些腫瘤的數(shù)據(jù)集進行在線生存分析。結果顯示，KIF4A的表達與乳腺癌患者的總生存率（HR=1.8、P<0.001）、無復發(fā)生存率（HR=1.75、P<0.001）有相關性，KIF4A表達越高，乳腺癌患者總生存時間和無復發(fā)生存時間更短，見圖4。因為KIF4A可能和腫瘤侵襲轉移相關，再進一步分析了淋巴結轉移陽性和陰性的乳腺癌患者的總生存率和無復發(fā)生存率，結果顯示，對于無復發(fā)生存率，KIF4A的表達與淋巴結陰性（HR=1.62、P<0.001）和淋巴結陽性（HR=1.82、P<0.001）均具有相關性。但對于總生存率，KIF4A的表達與淋巴結陰性乳腺癌預后具有相關性（HR=2.16、P<0.001），而與淋巴結陽性乳腺癌無相關性（HR=1.02、P=0.920），見圖5。

討論

KIF通過微管的分子馬達蛋白可沿微管做定向運動，進而在細胞內運輸機制中發(fā)揮著重要的作用，同時也在細胞有絲分裂和維持細胞形態(tài)中起著關鍵作用[11]。KIF4A參與染色體的濃縮與分離，是有絲分裂胞質分裂和后期紡錘體動力學的關鍵因素，其參與細胞內物質運輸、細胞有絲分裂調控、DNA損傷修復、免疫細胞的活化及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等[12]。

在本研究中，筆者利用TCGA數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)分析了乳腺癌中KIF4A mRNA的表達情況，發(fā)現(xiàn)KIF4A在乳腺癌中的表達明顯高于正常乳腺組織，利用人類蛋白圖譜數(shù)據(jù)庫中的樣本對KIF4A的細胞內水平進行分析發(fā)現(xiàn)KIF4A主要分布于細胞核和細胞骨架中，同時對在乳腺癌中與KIF4A表達相關的基因群進行KEGG和GO分析，發(fā)現(xiàn)KIF4A與DNA復制、范可尼貧血途徑、細胞周期、卵母細胞減數(shù)分裂、RNA轉運、HTLV?1感染、嘌呤代謝、mRNA監(jiān)測途徑、病毒致癌、P53信號通路等相關，與細胞分裂、核分裂、DNA復制、姐妹染色單體結合、有絲分裂細胞G1/S期、有絲分裂細胞G2/M期、染色體轉移、染色體分離、重組啟動、端粒維持重組有關，這與研究表明的KIF4A主要參與細胞有絲分裂和細胞運動結果相一致[12]。

在乳腺癌原發(fā)病灶較大、有腋窩淋巴結轉移和國際抗癌聯(lián)盟（UICC）分期較晚者中，Ki67表達陽性可反映腫瘤細胞的增殖和侵襲能力強，惡性程度高。在浸潤性乳腺癌中發(fā)現(xiàn)Ki67與腫瘤細胞增殖及侵襲轉移密切相關。因此腫瘤生長速度快、侵襲性大，轉移的機會高，預后差。Ki67高表達是乳腺癌預后不良的指標[13]。筆者分析了乳腺癌中KIF4A和Ki67的基因表達相關性，結果發(fā)現(xiàn)兩者高度相關，提示KIF4A在乳腺癌的淋巴結轉移和遠處轉移中可能具有重要的作用，其具體機制有待進一步的研究。

生存分析表明，KIF4A的表達與乳腺癌患者的總生存率、無復發(fā)生存率均具有相關性，KIF4A表達越高，乳腺癌患者總生存時間和無復發(fā)生存時間更短。我們進一步分析了淋巴結轉移陽性和陰性的乳腺患者的總生存率和無復發(fā)生存率，發(fā)現(xiàn)無論淋巴結陰性或陽性，KIF4A的表達與乳腺癌患者的無復發(fā)生存率均具有相關性，但是對于總生存率，KIF4A的表達與淋巴結陰性乳腺癌預后具有相關性，而淋巴結陽性乳腺癌則無關。結合KIF4A與Ki67高度相關，這提示KIF4A與腫瘤轉移高度相關，我們推測在淋巴結陽性的乳腺癌組織中，KIF4A均呈高表達，所以高表達KIF4A和低表達KIF4A的患者無明顯預后差別，而對于淋巴結陰性的乳腺癌，高表達KIF4A的乳腺癌患者生存率明顯下降，這提示KIF4A可預測淋巴結陰性的乳腺癌患者的預后，同時可預測是否有淋巴結轉移，這與KIF4A在結直腸癌中也與淋巴結轉移有關的結論相一致[8]。

在本研究中，筆者通過生物信息學分析為KIF4A基因的功能學研究提供了基礎。綜上所述，KIF4A與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有著密切相關性，對其作深入研究可進一步揭示其在乳腺癌中的功能及作用機制，深入的研究可為腫瘤的預防和治療提供新的思路。由于KIF4A在有絲分裂中的特殊作用，選擇性抑制KIF4A的活性，進而抑制細胞有絲分裂的過程，可能會成為新的抗腫瘤策略。

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（收稿日期：2018?09?18）

（本文編輯：洪悅民）