陳躍龍

基因測序技術(shù)已廣泛應用于分子生物學和基礎(chǔ)醫(yī)學領(lǐng)域。本文主要介紹了第一、二、三代測序技術(shù)的優(yōu)缺點，第三代測序技術(shù)在生物醫(yī)學領(lǐng)域的應用，以及第四代測序技術(shù)的研究進展?；蚪M攜帶個體的所有遺傳信息，基因測序可以加深對疾病特別是惡性腫瘤分子機制的認識，在診斷和治療中發(fā)揮重要作用。

測序技術(shù)在基因診斷中的應用

運用第一代的測序技術(shù)，不管是Sanger雙脫氧鏈終止法，還是Maxam和Gilbert化學裂解法，都需要放射性同位素標記，操作復雜，自動化程度低，不能滿足基因大規(guī)模測序的要求。而在實踐中，毛細管陣列DNA測序時間長、成本高，不能滿足基因組學發(fā)展的需要。

單分子DNA測序。第三代測序技術(shù)是在單細胞和單分子水平上進行基因組測序的新技術(shù)。2007年以來，DNA平臺已被廣泛使用。同時，人類單體型項目、人類基因組計劃1000和癌癥基因組計劃等重大國際合作項目也日益成為基因組研究的頂峰。所有的材料都進行了測序，并且是與DNA混合的大量細胞樣品。這些材料不能滿足微生物生態(tài)學、腫瘤基因組學、法醫(yī)學，微觀診斷和遺傳印記研究領(lǐng)域的要求。第三代測序技術(shù)以實時測序和納米多孔單層技術(shù)為標志，為解決這些問題打開了新的門戶。

不像NGS依靠DNA模板對PCR擴增來結(jié)合固體表面，然后合成并測序，第三代測序是單分子測序，不需要進行PCR的擴增。第三代基因測序技術(shù)中有三種主要類型：單一測序、單鏈Helico測序技術(shù)和單個納米粒子測序技術(shù)等。

SMRT測序原理。使用熒光標記的DNA在顯微鏡下實時記錄熒光強度的變化。熒光標記的DNA結(jié)合DNA鏈，同時檢測DNA鏈中的熒光，當它與DNA鏈形成化學鍵時，熒光團DNA聚合酶被去除。熒光DNA不影響DNA聚合酶的活性，DNA鏈的熒光自然與DNA鏈相同。

牛津納米棒單分子測序原理：生物納米孔由α-溶血素構(gòu)成，外溶酶附著在底部孔的外表面。環(huán)糊精的共價合成連接到嵌入脂質(zhì)雙層中的孔的內(nèi)表面。預處理不同的鹽濃度應該基于兩個脂質(zhì)雙層。在適當?shù)碾妷合?，單鏈DNA被切割并且單鏈DNA進入孔中，與孔中的環(huán)糊精瞬時反應。這會影響通過毛孔的原始電流。

腺嘌呤與胸腺嘧啶（T）和胸腺嘧啶（T）相似，但與其他核苷酸相比，T在環(huán)糊精中的滯留時間為3倍。胞嘧啶（G）和停留時間也不同。因此，每個基因和當前的干擾幅度是唯一的。此外，由于C-甲基化在環(huán)糊精中的停留時間大約為正常C停留時間的2倍之久，所以C-納米孔單分子序列的甲基化可以以99.9%的準確度直接讀出，而無需重復測序孔快速去除。

測序技術(shù)的發(fā)展及其優(yōu)缺點

DNA測序是基因診斷史上具有里程碑意義和劃時代意義的技術(shù)革命，被稱為基因診斷的黃金標準。桑格在1977年發(fā)明了基因測序技術(shù)以來，基因測序技術(shù)誕生已經(jīng)有40多年，它廣泛應用于遺傳病的基因診斷和產(chǎn)前/植入前診斷，特別是單基因疾病。2007年，羅氏公司伊利米納公司和ABI公司發(fā)明了高通量測序技術(shù)，即下一代測序技術(shù)。然而，測序技術(shù)的發(fā)展至今仍未停止，以單分子實時測序和納米孔技術(shù)為標志的第三代測序新產(chǎn)品也進入了歷史階段。

優(yōu)點。（1）DNA聚合酶的反應迅速，能較好地實現(xiàn)基本的測序技術(shù)，可在1秒內(nèi)測量10個核苷酸。測序速度為化學測序的速度的二萬倍。（2）DNA聚合酶反應具有持續(xù)性，可以進行長時間的基因測序，這種技術(shù)可以用來測量數(shù)千個堿基。高精度，高達99.999999%。這將大大減少體外轉(zhuǎn)錄。（3）基因聚合酶能夠測出不同基因序列，基于時間差異，可以確定模板C是否被甲基化?？梢垣@得許多重要的突變，節(jié)省項目成本。（4）挖掘DNA突變和來源的頻率，驗證率很高。（5）基因測序技術(shù)能夠有效的預防癌癥的發(fā)生。（6）區(qū)分正常和癌癥遺傳變異水平。（7）基因組測序，因為它讀取時間長，可以精確預測癌細胞的減少數(shù)量。在基因組測序中，重疊群測序重疊群（重疊后）顯著減少了隨后的基因組裝配和注釋的工作量，節(jié)省了大量時間。它比NGS快得多。因此，基因組測序和表征被廣泛用于細菌和病原體。單分子測序的優(yōu)點在突變或SNP鑒定的病理學檢測中是無與倫比的。沒有PCR擴增步驟，擴增過程中的基本錯誤沒有出現(xiàn)這種優(yōu)勢。允許它以特定的順序檢測SNP。產(chǎn)前診斷中的突變和罕見頻率測定在植入前基因診斷中具有獨特優(yōu)勢。（8）除了具有一定程度的組織和分化的人類和小鼠細胞的基因組測序外，它們也適用于各種細胞類型。對單細胞如腫瘤細胞、干細胞、循環(huán)腫瘤細胞、單個生殖細胞，胚胎細胞以及細胞（神經(jīng)，表皮等）進行第三代測序。測序技術(shù)具有高通量測序，長讀數(shù)時間短，成本低，測序時間短，初始劑量少，檢測精度高，即使變化小。

缺點。為了使基本測序技術(shù)更好地適用于基因的自動化識別、優(yōu)質(zhì)的基因測序，因此不適合單基因的檢測，例如需要單基因疾病，則檢測結(jié)果不太準確。另外，盡管第三代測序技術(shù)還不夠先進，但仍然需要的酶（或核酸聚合酶）以及如何保持其活性和穩(wěn)定性仍然是一個重要問題。對于太平洋生物科學技術(shù)的優(yōu)化升級，可以通過提高單基因的測序結(jié)果，來進一步完善生物科學技術(shù)的檢測升級。但是，仍然需要降低背景噪音和DNA速度控制。另外，如何在DNA固定的前提下解決和提高DNA分子結(jié)構(gòu)的延展性。

總結(jié)與建議

近年來，基因測序技術(shù)發(fā)展迅速。雖然第一代測序技術(shù)在各種檢測平臺上仍然十分活躍，但第二代和第三代測序器相繼出現(xiàn)，第四代測序技術(shù)日趨完善。第一代至第四代測序技術(shù)有其優(yōu)缺點。（1）第一代Sanger測序技術(shù)具有成本高、吞吐量低、讀取長度長、精度高等優(yōu)點。對于較小的樣本，排序仍然是最好的選擇。（2）第二代測序技術(shù)發(fā)展迅速，產(chǎn)量高、成本低，已被廣泛應用于大規(guī)模測序。但第二代測序技術(shù)的主要缺點是閱讀長度相對較短。（3）第三代測序技術(shù)不僅增加了閱讀長度，而且直接檢測RNA序列和甲基化序列。第三代測序技術(shù)仍在發(fā)展中。其中，離子流測序庫的制備過程繁瑣，讀取長度不足，SMRT測序技術(shù)的有效響應孔數(shù)不足，原始測序數(shù)據(jù)的準確性不高。（4）第四代測序技術(shù)是以第三代測序技術(shù)為基礎(chǔ)的。與前三代相比，具有代表性的納米孔測序技術(shù)在成本和速度上都有了很大的提高，儀器也越來越小型化。基因測序技術(shù)是人類探索生命奧秘的重要手段之一。它在生命科學和生物醫(yī)學的發(fā)展中發(fā)揮了巨大的作用。盡管最先進的納米級技術(shù)已經(jīng)取得了許多進展，但它仍然面臨著許多挑戰(zhàn)。例如，DNA控制和納米孔制造仍處于實驗室階段.。我們有理由相信，新一代測序技術(shù)的困難將逐步克服，在基因測序的指導下對遺傳病的診斷和治療。精確化的基因治療能取得更好的臨床療效，基因測序技術(shù)將對未來人類健康產(chǎn)生重大影響。