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(1.青島瑯琊臺集團(tuán)股份有限公司,山東 青島 266400;2.中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所,山東 青島 266101;3.黃島出入境檢驗檢疫局,山東 青島 266400;4.青島市黃島區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局,山東 青島 266400)

二十碳五烯酸(C20∶5,n-3,EPA),是一種ω-3多不飽和脂肪酸,具有重要的生理功能,已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等行業(yè)[1-2].由于生物法生產(chǎn)EPA具有培養(yǎng)周期短、不受季節(jié)和來源限制等特點(diǎn),受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[3].微擬球藻是一種重要的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)微藻,其脂肪酸組成簡單,富含EPA,已在中國、日本和澳大利亞等國家實現(xiàn)了大規(guī)模養(yǎng)殖[4].然而,在自養(yǎng)培養(yǎng)條件下,微擬球藻的生長緩慢,油脂及EPA的產(chǎn)率較低,因此,提高在大規(guī)模培養(yǎng)中的生產(chǎn)效率,降低生產(chǎn)成本是本行業(yè)急需克服的關(guān)鍵問題[5-7].除改善培養(yǎng)條件,添加促生長、促油脂積累的物質(zhì)外,改變微藻培養(yǎng)方式也是可行的方案,目前已有學(xué)者開始嘗試密閉管道式培養(yǎng)與異養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)方式[6],一旦有所突破，必將大大提高我國微擬球藻的產(chǎn)業(yè)化水平.目前微擬球藻已經(jīng)成為工業(yè)化生產(chǎn)EPA的最佳藻株,然而,產(chǎn)量低和成本高仍然是利用微擬球藻大規(guī)模生產(chǎn)EPA的瓶頸.因此提高在大規(guī)模生產(chǎn)中的效率,降低成本,成為本領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[8-9].植物激素是一類能以極低的濃度來調(diào)節(jié)植物的生理過程的微量活性物質(zhì),目前已發(fā)現(xiàn)的植物激素主要有細(xì)胞分裂素、生長素、赤霉素、乙烯和落葉酸5類,以及水楊酸、茉莉酸類物質(zhì)、油菜素甾醇和多胺等新型植物激素[10].許多植物激素能夠在大規(guī)模的微藻培養(yǎng)中改善高價值生物制品的積累.劉飛等發(fā)現(xiàn)萘乙酸可以提高小球藻的生長,對蛋白質(zhì)、單糖、葉綠素a和b、總類胡蘿卜素等必需代謝物的含量有積極的影響[11].楊青等發(fā)現(xiàn)在適宜的濃度條件下,6種植物激素都能不同程度地提高裂壺藻的生長速度和DHA含量,但是濃度過高會產(chǎn)生抑制作用[12].

筆者研究了赤霉素(GA)、脫落酸(ABA)、細(xì)胞分裂素6-芐基腺嘌呤(BA)、糠基腺嘌呤(KT)、細(xì)胞生長素吲哚乙酸(IAA)和吲哚丁酸(IBA)6種植物激素對微擬球藻生長與EPA產(chǎn)量的影響,并初步探討其提高油脂產(chǎn)量的背后機(jī)理,為利用植物激素提高微擬球藻生產(chǎn)EPA提供了實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 藻種與培養(yǎng)條件

本實驗藻種來源于經(jīng)重離子誘變得到的EPA高產(chǎn)藻株,微擬球藻NannochloropsisoceanicaM44,培養(yǎng)基為BG -11海水培養(yǎng)基,培養(yǎng)溫度25 ℃,光強(qiáng)為150 μmol/(m2·s).

1.2 植物激素的添加

種子在25 ℃,200 r/min條件下培養(yǎng)2 d,然后按體積分?jǐn)?shù)10%的接種量接到搖瓶培養(yǎng)基中,并在搖瓶中添加不同質(zhì)量濃度的植物激素.6種植物激素的添加量為0,1,3,6,10,15,20 mg/L,25 ℃,200 r/min條件下培養(yǎng)8 d.每個實驗設(shè)3個平行,重復(fù)2次.

1.3 細(xì)胞干重、含油率及脂肪酸組成的測定

1.3.1 細(xì)胞干重測定

培養(yǎng)物經(jīng)8 000g離心10 min后,棄上清,加入等體積去離子水洗滌1次,-40 ℃真空冷凍干燥48 h,稱其干質(zhì)量.生物量=干質(zhì)量(g)÷培養(yǎng)物體積(L).

1.3.2 脂質(zhì)提取、薄層色譜(TLC)和脂肪酸組成分析

脂質(zhì)提取和脂肪酸甲酯化參照文獻(xiàn)方法并作適當(dāng)改進(jìn)[13].脂質(zhì)提取步驟:首先稱取100 mg的藻粉到2 mL離心管里,加入600 μL 6 mol/L鹽酸,振蕩混勻,室溫放置30 min.沸水煮沸10 min,-80 ℃凍存5 min,此過程重復(fù)2次.加入900 μLV(氯仿)∶V(甲醇)=2∶1的溶液,漩渦振蕩15 s,12 000 g離心5 min,取下層液相到另一個2 mL離心管中,加入等體積的飽和NaCl,漩渦振蕩15 s,12 000g離心5 min,將下層液相轉(zhuǎn)移到已經(jīng)稱重好的玻璃小瓶中,50 ℃真空干燥至恒重,稱量.含油率=油脂質(zhì)量(g)÷藻粉質(zhì)量(g)×100%.

薄層色譜(TLC)分析油脂組成變化實驗根據(jù)參考文獻(xiàn)[13]方法,中性脂展層劑組分為V(正己烷)∶V(乙醚)∶V(乙酸)=70∶30∶1.

脂肪酸甲酯化步驟:稱重完成后,在玻璃小瓶中加入1 mL氯仿和2.5 mLV(硫酸)∶V(甲醇)=1∶50的溶液,并壓蓋,在85 ℃下甲酯化反應(yīng)2.5 h,獲得脂肪酸甲酯(FAME).冷卻后加入1 mL飽和NaCl混勻,加入1 mL正己烷振蕩混勻后靜止分層,吸取上層液相至色譜瓶中.使用裝有HP-INNOWAX毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)的氣相色譜(Agilent Technologies,7890B)進(jìn)行分析[14].柱箱溫度設(shè)定為100 ℃保持1 min,以每分鐘15 ℃的速度升溫至250 ℃,然后在250 ℃下保持5 min.分流比為1∶19,載氣為氮?dú)?進(jìn)樣體積為1 uL.峰值檢測用火焰離子化檢測器(FID),檢測器和進(jìn)樣口的溫度為280 ℃.

1.4 油脂相關(guān)基因的表達(dá)檢測

通過實時定量PCR進(jìn)一步檢測油脂合成相關(guān)基因的表達(dá)水平.根據(jù)基因組測序數(shù)據(jù)設(shè)計引物序列(表1).使用試劑盒RNeasy Mini Kit(QIAGEN,Germany)提取總RNA.使用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo scientific)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄總RNA.反轉(zhuǎn)錄的體系:5 μg總RNA,1 μL Oligo dT,1 μL 隨機(jī)引物,4 μL 5×buffer,1 μL RiboLock RNase Inhibitor,1 μL Revert Aid Reverse Transcriptase,用RNAase free water補(bǔ)齊20 μL體系.25 ℃,5 min;42 ℃,1 h;70 ℃, 5 min.

表1 實時定量PCR引物序列1)Table 1 The primer sequences of RT-qPCR

注：1) 18 s為18S rDNA;Fas為脂肪酸合酶;Δ5,Δ6,Δ9,Δ12為Δ5,Δ6,Δ9,Δ12去飽和酶;Acc為乙酰輔酶A羧化酶;Dgat為二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶;EL1,EL2為延長酶1和延長酶2.

在LightCycler R480實時檢測系統(tǒng)(Roche)進(jìn)行qPCR反應(yīng).反應(yīng)體系:10 μL FastStart Universal SYBR Green Master(ROX),1 μL qRT-PCR正向引物,1 μL qRT-PCR反向引物,9 μL 50×cDNA.在LightCycler R480實時檢測系統(tǒng)(Roche)中進(jìn)行qPCR,并用擴(kuò)增產(chǎn)物的融合曲線分析以確認(rèn)擴(kuò)增的特異性.最后以18S rRNA作為內(nèi)參,使用CT方法(2-ΔΔCT)分析計算基因表達(dá)差異.所有反應(yīng)一式三份,數(shù)據(jù)用內(nèi)標(biāo)平均值標(biāo)準(zhǔn)化.

2 實驗結(jié)果

2.1 植物激素對微擬球藻生長及油脂合成的影響

不同質(zhì)量濃度的6種植物激素對微擬球藻生長及油脂積累的影響,如圖1所示.在適宜的質(zhì)量濃度條件下,6種植物激素均能促進(jìn)微擬球藻的生長,在不同程度上提高微擬球藻的生物量以及油脂和EPA的產(chǎn)量,而在質(zhì)量濃度過高時抑制微擬球藻生長,這符合植物激素在低濃度時促進(jìn)生長、高濃度時抑制生長的規(guī)律.表2中詳細(xì)說明了每種植物激素在最佳質(zhì)量濃度下對微擬球藻生長以及油脂和EPA積累的促進(jìn)效果,其中添加20 mg/L IBA時油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)最多提高20.94%,其次是質(zhì)量濃度為15 mg/L的BA,油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高了20.27%.同時,當(dāng)BA在質(zhì)量濃度為15 mg/L時,EPA質(zhì)量分?jǐn)?shù)最多提高29.50%.綜合兩項指標(biāo),6-芐基腺嘌呤(BA)對微擬球藻的生長以及油脂和EPA的產(chǎn)量影響最大,最佳添加量為15 mg/L.而脫落酸(ABA)效果最差,油脂和EPA質(zhì)量分?jǐn)?shù)只分別提高了8.14%和3.78%.

表2最佳質(zhì)量濃度下植物激素對微擬球藻油脂和EPA產(chǎn)量的影響

Table2TheeffectsofplanthormonesonthelipidandEPAyieldofNannochloropsisoceanicaM44undertheoptimumconcentration

植物激素名稱最佳添加量/(mg·L-1)油脂產(chǎn)量提高百分比/%EPA產(chǎn)量提高百分比/%KT118.0620.52BA1520.2729.50GA315.2919.79ABA158.143.78IAA1019.4222.05IBA2020.9413.87

圖1 不同植物激素對微擬球藻生長以及油脂和EPA產(chǎn)量的影響Fig.1 The effects of different plant hormones on the growth, lipid and EPA yield of Nannochloropsis oceanica M44

2.2 植物激素對微擬球藻油脂及脂肪酸組成的影響

利用薄層色譜分析6種激素對微擬球藻油脂組成的影響發(fā)現(xiàn),與對照相比,添加植物激素后油脂組成沒有發(fā)生顯著變化,都是以甘油三酯(TAG)為主要的油脂儲存形式,但從圖2中看出:添加植物激素后TAG的量明顯高于對照組.

從表3中看出:添加植物激素后微擬球藻脂肪酸的組成并沒有發(fā)生變化.脂肪酸合成途徑中積累比較多的仍是棕櫚酸(C16∶0)、棕櫚油酸(C16∶1)、硬脂酸(C18∶0)、油酸(C18∶1)和二十碳五烯酸(C20∶5,EPA).EPA的含量占總脂肪酸的40%以上.

Lane 1,5—對照組;Lane 2～4,6～8—KT1,BA15,GA3,ABA15,IAA10,IBA20圖2 薄層色譜分析6種激素對微擬球藻油脂組成的影響Fig.2 TLC analysis of the effects of plant hormones on the lipid composition of Nannochloropsis oceanica M44

脂肪酸總脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%CKKT1BA15GA3ABA15IAA10IBA20C14∶08.34±0.117.24±0.175.01±0.085.84±0.115.18±0.085.22±0.125.05±0.09C16∶018.34±0.1519.16±0.4117.07±0.2718.85±0.2817.63±0.0717.40±0.6116.80±0.85C16∶1Δ99.61±0.119.25±0.1510.28±0.099.77±0.2310.34±0.479.78±0.1810.79±0.69C18∶04.51±0.284.90±0.324.68±0.104.99±0.386.38±0.155.47±0.496.29±0.14C18∶1Δ98.18±0.177.79±0.038.74±0.217.78±0.399.53±0.258.18±0.5511.17±1.13C18∶2Δ9,123.40±0.103.57±0.153.74±0.013.75±0.213.65±0.043.67±0.053.43±0.08C20∶4Δ5,8,11,143.11±0.032.92±0.362.88±0.292.92±0.133.01±0.012.97±0.033.12±0.05C20∶5Δ5,8,11,14,17(EPA)44.25±0.3845.17±0.2247.52±0.1945.97±0.1444.05±1.4446.91±0.3743.22±0.64

2.3 植物激素對微擬球藻油脂合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

為了闡明植物激素促進(jìn)微擬球藻油脂及EPA產(chǎn)量增加的分子機(jī)制,筆者選取了脂肪酸及油脂合成過程中起重要作用的各個關(guān)鍵酶[15]:乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸合酶(Fas)、脂肪酸延長酶1(EL1)和延長酶2(EL2)、脂肪酸去飽和酶(Δ5,Δ6,Δ9,Δ12去飽和酶)以及二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶(DGAT),研究添加不同植物激素(選取對油脂合成影響最顯著的糠基腺嘌呤(KT),6-芐基腺嘌呤(BA),吲哚乙酸(IAA))后,它們各自轉(zhuǎn)錄水平的變化.通過定量PCR結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)(圖3):從轉(zhuǎn)錄水平上看,添加BA時各基因轉(zhuǎn)錄水平變化最大,其中Δ9去飽和酶、FAS和DGAT轉(zhuǎn)錄水平分別提高了9.3,9.6,7.7倍,其次為IAA,Δ9去飽和酶、FAS和DGAT轉(zhuǎn)錄水平分別提高了2.1,8.9,2.7倍.這說明BA和IAA對微擬球藻油脂合成的影響是一致的,兩者都通過影響Fas的轉(zhuǎn)錄水平提高了軟脂酸C16∶0的合成,再通過影響去飽和酶及DGAT的轉(zhuǎn)錄水平增加了TAG的合成.

CK—對照組;KT1—1 mg/L糠基腺嘌呤;BA15—15 mg/L6-芐基腺嘌呤;IAA10—10 mg/L吲哚乙酸 圖3 3種植物激素對微擬球藻油脂合成關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平的影響 Fig.3 The effects of plant horones on the gene transcriptions of lipid synthesis in Nannochloropsis oculata M44

而KT對微擬球藻油脂合成的影響與BA和IAA不同,主要通過增強(qiáng)脂肪酸延長及去飽和途徑關(guān)鍵酶的轉(zhuǎn)錄水平來實現(xiàn)增加油脂產(chǎn)量的目的,表現(xiàn)為延長酶2、Δ9去飽和酶、Fas的轉(zhuǎn)錄水平分別提高了2.7,4.0,2.4倍.

3 結(jié) 論

植物激素對細(xì)胞生長發(fā)育的調(diào)控一般通過調(diào)控細(xì)胞分裂、細(xì)胞分化、胞內(nèi)代謝和環(huán)境脅迫響應(yīng)機(jī)制等方式實現(xiàn)[16-17].不同的激素有可能通過調(diào)控相同的下游基因的表達(dá)來控制相同生理過程[18].本研究證實植物激素對微擬球藻的影響主要是集中在對微擬球藻油脂合成途徑的改變上,BA和IAA通過影響Fas的轉(zhuǎn)錄水平提高了脂肪酸合成的總量,增加了油脂合成的底物供應(yīng),再通過增加DGAT的轉(zhuǎn)錄水平,促進(jìn)了甘油三酯的合成,增加了細(xì)胞中油脂的產(chǎn)量.而KT對油脂合成的影響與BA和IAA不同,主要是影響脂肪酸延長及去飽和途徑的活力,通過增加軟脂酸向下游脂肪酸的持續(xù)轉(zhuǎn)化來推動油脂的合成過程.

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