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(1.中國生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)協(xié)會(huì),北京 100833;2.蓮花健康產(chǎn)業(yè)集團(tuán)股份有限公司 博士后科研工作站,河南 項(xiàng)城 466200;3.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院,天津 300457)

氨基酸是蛋白質(zhì)合成的原料,同時(shí)其自身及其代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)許多重要的生命活動(dòng),如參與脂代謝、糖代謝等,為機(jī)體提供能量,維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài),合成激素和神經(jīng)遞質(zhì)等[1].自Udeka和Kinoshita于1957年發(fā)現(xiàn)谷氨酸棒桿菌天然可以分泌谷氨酸以來[2],科學(xué)家們通過誘變育種獲得了一系列氨基酸生產(chǎn)菌株[3].近年來通過基因工程理性設(shè)計(jì)極大的加速了育種進(jìn)程和擴(kuò)展了可發(fā)酵生產(chǎn)的氨基酸品種[4].目前,大多數(shù)氨基酸通過發(fā)酵法生產(chǎn),氨基酸發(fā)酵產(chǎn)業(yè)已經(jīng)成為整個(gè)發(fā)酵行業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)之一[5].

1 我國氨基酸產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀

我國2017年氨基酸行業(yè)總體運(yùn)行情況良好,主導(dǎo)產(chǎn)品谷氨酸、賴氨酸、蘇氨酸等生產(chǎn)狀態(tài)基本穩(wěn)定,其他品種氨基酸產(chǎn)量略有增長.據(jù)統(tǒng)計(jì),2017年我國氨基酸發(fā)酵產(chǎn)品總產(chǎn)量約為542萬噸,同比增長17.87%[6](表1).

由此可見,目前我國氨基酸產(chǎn)能已經(jīng)過剩,尤其大宗氨基酸產(chǎn)量達(dá)全球第一,企業(yè)間在技術(shù)提升和產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新上差異不突出,同質(zhì)性競爭較為激烈,氨基酸行業(yè)急需在高科技和新理念方面長久規(guī)劃和全面提升.同時(shí),由于缺乏自主知識(shí)產(chǎn)權(quán),部分產(chǎn)品在進(jìn)入國際市場時(shí)受到嚴(yán)重限制.比如,2017年我國谷氨酸鈉(味精)的產(chǎn)量已達(dá)到供銷平衡產(chǎn)銷飽和狀態(tài),預(yù)計(jì)今后味精產(chǎn)量不會(huì)有太大增加.目前,企業(yè)間在規(guī)模上已拉開了一定的差距,但由于缺乏技術(shù)優(yōu)越性,產(chǎn)品價(jià)格仍然不夠理想,企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益不好.賴氨酸及其鹽作為飼用氨基酸,約一半產(chǎn)量進(jìn)入國際市場.受其影響,今后一兩年內(nèi)還會(huì)有一些企業(yè)加入賴氨酸生產(chǎn)行列,產(chǎn)能增幅較大,產(chǎn)量也會(huì)隨之增長,國際市場的競爭會(huì)更加激烈.因此,提高產(chǎn)品層次,擴(kuò)大內(nèi)需,建立知識(shí)產(chǎn)權(quán)體系是今后發(fā)展的重點(diǎn).

表1 2017年我國氨基酸產(chǎn)量及出口情況Table 1 Amino acid production and export status in China in 2017

另一方面,其他高附加值氨基酸品種開發(fā)力度還不夠,氨基酸衍生物品種較少,產(chǎn)量還處于較低水平.大宗氨基酸主要用作調(diào)味品和飼料添加,而小品種氨基酸及衍生物的應(yīng)用可以擴(kuò)展到醫(yī)療保健、食品營養(yǎng)和美容化妝等諸多領(lǐng)域.隨著人民生活水平的提高,人們對(duì)健康的渴望和理解也在不斷進(jìn)步.目前大健康理念已經(jīng)被人們熟知和接受,迫切需要加強(qiáng)高附加值氨基酸衍生產(chǎn)品的研發(fā).這些品種市場需求較小,但利潤可觀,其特點(diǎn)是打“技術(shù)戰(zhàn)”,而非靠產(chǎn)能取勝.多數(shù)氨基酸企業(yè)已經(jīng)意識(shí)到這一點(diǎn),不斷強(qiáng)化與研發(fā)機(jī)構(gòu)的合作,主動(dòng)提升自身的技術(shù)創(chuàng)新能力,其核心是選育具有自主產(chǎn)權(quán)的優(yōu)良生產(chǎn)菌株.

2 常規(guī)育種技術(shù)

常規(guī)育種技術(shù),也叫傳統(tǒng)育種技術(shù),包括誘變、雜交和馴化等.誘變育種是人們利用人工誘變手段使得微生物基因發(fā)生突變,進(jìn)而選育具有特定性狀的菌株.常用的誘變因子有物理因子和化學(xué)因子,前者包括紫外線、激光、X-射線和γ-射線等,后者包括甲基磺酸乙酯(EMS)、硫酸二乙酯(DES)和亞硝基胍(NTG)等.原核細(xì)胞的雜交方法有接合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo),真核細(xì)胞雜交包括單核菌絲體雜交和原生質(zhì)體融合等.馴化也叫適應(yīng)性進(jìn)化,是在實(shí)驗(yàn)室中人為設(shè)置選擇壓力、對(duì)微生物自發(fā)突變進(jìn)行有效篩選和富集的過程.近年來,由清華大學(xué)開發(fā)的常壓室溫等離子體(ARTP)誘變育種技術(shù)由于條件溫和、操作簡便、正突變率高等特點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于各種微生物的誘變育種中.

采用常規(guī)育種技術(shù),如誘變育種可以在短時(shí)間內(nèi)獲得大量突變體,如何篩選具有目標(biāo)性狀的菌株是關(guān)鍵.在氨基酸和核苷生產(chǎn)菌株選育中,在誘變基礎(chǔ)上往往采用產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)類似物作為選擇壓力,可以快速高效篩選解除反饋抑制的突變株.另外,在足夠庫容量的基礎(chǔ)上,采用高通量篩選可以節(jié)省時(shí)間,提高選擇效率.實(shí)驗(yàn)室常采用孔板培養(yǎng)、流式細(xì)胞儀(FACS),甚至應(yīng)用微流控和機(jī)械臂來實(shí)現(xiàn)超高通量.本研究室采用ARTP對(duì)一株尿苷生產(chǎn)菌BacillussubtilisTD12np進(jìn)行多輪誘變,依次在添加尿嘧啶結(jié)構(gòu)類似物2-硫脲嘧啶、6-氮雜脲嘧啶和5-氟尿嘧啶培養(yǎng)基上獲得耐性菌落,并通過多孔板高通量篩選最終獲得解除尿苷酸反饋抑制的氨甲酰磷酸合成酶大亞基突變體,獲得的突變株尿苷產(chǎn)量達(dá)到30.3 g/L,較出發(fā)菌株提高8.7倍[7].

由此可見,常規(guī)育種技術(shù)并沒有過時(shí),在現(xiàn)階段菌株選育過程中還應(yīng)該受到足夠的重視.其雖然不定向、周期長,但結(jié)合合適的篩選體系也可以快速獲得特定的性狀.比如解除關(guān)鍵酶的反饋抑制,獲得不代謝某一目標(biāo)產(chǎn)物的菌株,獲得某一物質(zhì)細(xì)胞膜攝取/輸出途徑突變的菌株,并通過對(duì)關(guān)鍵基因或全基因組測序,解析關(guān)鍵酶的突變,揭示目標(biāo)產(chǎn)物的降解途徑和跨膜運(yùn)輸途徑.由于目前對(duì)重要氨基酸生產(chǎn)菌種谷氨酸棒桿菌的一些關(guān)鍵基因還沒有解析,比如色氨酸的代謝途徑,色氨酸和組氨酸的運(yùn)輸途徑尚不清楚,這嚴(yán)重制約了理性代謝工程手段的使用.然而,傳統(tǒng)育種技術(shù)獲得目標(biāo)性狀的同時(shí),勢必會(huì)引入大量不利突變,導(dǎo)致菌體生長變慢、抗逆性差和遺傳操作困難等.因此,筆者認(rèn)為現(xiàn)階段傳統(tǒng)育種技術(shù)的重要貢獻(xiàn)在于獲得目標(biāo)性狀,然后通過反向代謝工程手段解析有用突變,并在出發(fā)菌株中重構(gòu)得到高產(chǎn)菌株.本研究室通過應(yīng)用上述在枯草芽孢桿菌中獲得的氨甲酰磷酸合成酶突變體,并結(jié)合系統(tǒng)代謝工程手段構(gòu)建了一株高產(chǎn)尿苷的重組大腸桿菌(未發(fā)表).Ohnishi等[8]通過對(duì)一株誘變獲得的賴氨酸高產(chǎn)菌株CorynebacteriumglutamicumB-6進(jìn)行測序,成功解析了3個(gè)關(guān)鍵突變位點(diǎn)homVal59Val,lysCThr311Ile和pycPro458Ser,并在標(biāo)準(zhǔn)菌株C.glutamicum13032中重構(gòu)途徑,工程菌株發(fā)酵27 h賴氨酸產(chǎn)量達(dá)到80 g/L,與誘變菌株產(chǎn)量相當(dāng),但發(fā)酵周期縮短一半[8-9].

3 代謝工程育種技術(shù)

代謝工程育種技術(shù)是通過基因工程手段理性改造宿主細(xì)胞的基因組,獲得高產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物的菌株.目前常用的代謝工程(常規(guī)代謝工程)研究圍繞產(chǎn)物合成途徑開展,也可以叫途徑工程.其核心育種策略可以歸納為五個(gè)字:進(jìn)、通、節(jié)、堵、出,簡單描述就是促進(jìn)底物吸收、打通合成途徑、消弱支路代謝、阻斷產(chǎn)物降解、促進(jìn)產(chǎn)物排出,對(duì)其詳細(xì)的闡述參見文獻(xiàn)[10].

常規(guī)代謝工程往往通過試錯(cuò)的辦法,一次只改造一個(gè)或幾個(gè)基因,通過發(fā)酵測試保留有益操作擯棄負(fù)面操作,然后進(jìn)行下一輪的基因工程改造.圍繞產(chǎn)物合成途徑的基因操作沒有考慮到細(xì)胞整體生理平衡,單個(gè)基因改造其實(shí)是對(duì)細(xì)胞造成了一個(gè)擾動(dòng),可能會(huì)對(duì)菌體生長和產(chǎn)量積累造成負(fù)面影響.在此情況下,即便一些非常關(guān)鍵的基因位點(diǎn)也會(huì)被認(rèn)為是無效的,因而嚴(yán)重阻礙了代謝工程育種進(jìn)程.現(xiàn)階段,隨著氨基酸生產(chǎn)菌種大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌各類組學(xué)數(shù)據(jù)的爆發(fā),以組學(xué)為基礎(chǔ)的建模已經(jīng)得到了很好的發(fā)展.由于模型綜合考慮了細(xì)胞的整體代謝水平,不但能夠給出系統(tǒng)的產(chǎn)物合成途徑基因的操作指導(dǎo),還可以預(yù)測出一些途徑無關(guān)的改造位點(diǎn).在全局模型指導(dǎo)下,可以快速構(gòu)建出氨基酸及衍生物高產(chǎn)菌株,該方法被稱作系統(tǒng)代謝工程[11].比較典型的案例有大腸桿菌蘇氨酸高產(chǎn)菌株[12]和谷氨酸棒桿菌賴氨酸高產(chǎn)菌株[13]的構(gòu)建.

前面提到的實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性進(jìn)化雖然比自然進(jìn)化效率要高,但還是具有操作周期長、定向性差等缺點(diǎn).近年來,也出現(xiàn)了一些代謝工程輔助的進(jìn)化策略,可以命名為進(jìn)化代謝工程.第一類為全局轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)化工程,其工作原理是對(duì)全局轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行突變建庫,在培養(yǎng)過程中篩選目標(biāo)性狀.Wang等[14]通過全局轉(zhuǎn)錄因子改造顯著提高了大腸桿菌半纖維素水解液的耐性.第二類為生物傳感進(jìn)化工程,是構(gòu)建某種底物、產(chǎn)物或中間代謝物的生物傳感系統(tǒng),應(yīng)用于進(jìn)化工程的高通量篩選中.Fang等[15]通過構(gòu)建色氨酸生物傳感儀,采用“推”和“拉”兩階段策略構(gòu)建了脫氧紫色桿菌素生產(chǎn)菌株.第三類為代謝逆境進(jìn)化工程,是首先利用代謝工程手段設(shè)置微生物生長的逆境條件,然后通過適應(yīng)性進(jìn)化獲得需要的表型.最近,Schwentner等[16]敲除谷氨酸棒桿菌丙酮酸和PEP羧化酶建立選擇壓力,然后以葡萄糖為底物對(duì)菌株進(jìn)行馴化,獲得生長速率達(dá)到野生菌80%的突變柱,通過基因組測序比對(duì)后發(fā)現(xiàn)進(jìn)化菌株異檸檬酸脫氫酶ICD發(fā)生突變,導(dǎo)致乙醛酸循環(huán)增強(qiáng)為細(xì)胞生長補(bǔ)充草酰乙酸,進(jìn)一步在野生菌中重構(gòu)這些突變,同時(shí)過表達(dá)纈氨酸合成基因,構(gòu)建了纈氨酸生產(chǎn)菌株.由于丙酮酸是纈氨酸合成的前體物,該菌株丙酮酸和PEP羧化途徑的阻斷,非常有利于目標(biāo)產(chǎn)物纈氨酸的積累.

4 基因組編輯技術(shù)

工業(yè)化氨基酸生產(chǎn)菌株需要具有良好的生產(chǎn)性能、良好的遺傳穩(wěn)定性和對(duì)抗生素敏感.因此,目前質(zhì)粒過表達(dá)的方式通常用于基因功能研究,真正構(gòu)建工業(yè)生產(chǎn)菌株均在基因組上直接操作.這就要求非常高效的基因組編輯技術(shù),包括基因敲除、插入和替換,以及點(diǎn)突變.自2000年問世以來,λ-Red重組技術(shù)就廣泛應(yīng)用于大腸桿菌的基因組編輯[17].近年來,CRISPR基因組編輯技術(shù)帶來了基因工程領(lǐng)域的革命性變革,CRISPR/Cas9技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于大腸桿菌的基因組編輯[18].

對(duì)于高GC含量的谷氨酸棒桿菌,目前代謝工程操作仍采用傳統(tǒng)的非復(fù)制型質(zhì)粒pK18mobsacB介導(dǎo)的基因組編輯方法,CRISPR技術(shù)雖然取得了很大進(jìn)展,但還不夠成熟.Cho等[19]利用CRISPR技術(shù)首次實(shí)現(xiàn)了谷氨酸棒桿菌的基因編輯,發(fā)現(xiàn)Cas9蛋白對(duì)谷氨酸棒桿菌細(xì)胞生長有抑制作用,通過多次嘗試發(fā)現(xiàn)一個(gè)針對(duì)放線菌密碼子優(yōu)化的基因可以正常表達(dá),然后通過優(yōu)化感受態(tài)制備方法實(shí)現(xiàn)了單鏈(ssDNA)介導(dǎo)的基因敲除,然而敲除效率極低(菌落數(shù)為個(gè)位數(shù)).Liu等[20]對(duì)Cas9表達(dá)的啟動(dòng)子進(jìn)行了優(yōu)化,采用質(zhì)粒攜帶同源片段的方法實(shí)現(xiàn)了基因敲除和替換/插入,然而獲得的轉(zhuǎn)化子還停留在個(gè)位數(shù),制約了實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性,但是其團(tuán)隊(duì)利用ssDNA實(shí)現(xiàn)了高效的單堿基突變編輯(90%).幾乎同時(shí),Peng等[21]報(bào)道了谷氨酸棒桿菌CRISPR/Cas9編輯方法,也取得了類似的結(jié)果.此外,Jiang等[21]報(bào)道了利用CRISPR/Cpf1對(duì)谷氨酸棒桿菌進(jìn)行基因組編輯,Cpf1表達(dá)對(duì)細(xì)胞沒有毒害作用,且其crRNA的設(shè)計(jì)相對(duì)簡單.他們實(shí)現(xiàn)了高效的單堿基突變,但由于Cpf1的剪切作用不嚴(yán)謹(jǐn),當(dāng)進(jìn)行基因敲除和插入時(shí),效率很低.最近,Wang等[22]利用dCas9攜帶胞苷脫氨酶的方式,實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)高通量谷氨酸棒桿菌單堿基突變體庫的構(gòu)建方法.綜上所述,目前利用CRISPR技術(shù)可以對(duì)谷氨酸棒桿菌進(jìn)行有效的單堿基突變,但由于谷氨酸棒桿菌內(nèi)源同源重組效率低和Cas9/Cpf1切割效率的不嚴(yán)謹(jǐn)性,致使進(jìn)行大片段基因敲除和插入時(shí)效率很低,所能獲得的菌落數(shù)極少,導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差,另外需要將模板片段連接到載體上也增加了操作的復(fù)雜性.

5 精確代謝調(diào)控技術(shù)

隨著對(duì)氨基酸生產(chǎn)菌株大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌代謝工程研究的不斷深入,科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)基因組水平直接操作帶來的菌株雖然遺傳穩(wěn)定,但難以照顧到菌體生長和產(chǎn)物合成之間的矛盾.目前代謝工程研究逐漸強(qiáng)調(diào)對(duì)代謝途徑進(jìn)行動(dòng)態(tài)調(diào)控,稱為精確代謝調(diào)控技術(shù).該技術(shù)包括兩方面的內(nèi)容:一是基因表達(dá)的誘導(dǎo),涉及的多為一些產(chǎn)物合成的關(guān)鍵基因;二是基因表達(dá)的關(guān)閉或弱化,可以在DNA,mRNA和蛋白質(zhì)多個(gè)層次進(jìn)行調(diào)控,被弱化基因可以催化支路代謝或產(chǎn)物降解途徑,也可能是中心代謝途徑的關(guān)鍵步驟,后者可以使菌體生長向產(chǎn)物合成切換,實(shí)現(xiàn)兩階段發(fā)酵工藝.誘導(dǎo)基因表達(dá)的因素有:1) 細(xì)胞所處的物理環(huán)境因素,包括pH、溫度、溶氧和滲透壓等;2) 化學(xué)小分子誘導(dǎo)物,如乳糖、木糖和抗生素等;3) 代謝途徑相關(guān)的誘導(dǎo),包括代謝產(chǎn)物自誘導(dǎo)和特定生長階段轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控.基因弱化方法有:1) 誘導(dǎo)關(guān)鍵蛋白的動(dòng)態(tài)降解;2) 誘導(dǎo)阻遏蛋白表達(dá);3) 基因組弱化方法,包括RNAi和CRISPRi等.

本研究室通過常規(guī)代謝工程手段構(gòu)建了一株高產(chǎn)四氫嘧啶的大腸桿菌工程菌株,關(guān)鍵合成基因ectABC為質(zhì)粒表達(dá)[23].為了提高菌株的穩(wěn)定性和發(fā)酵性能,將ectABC整合到基因組上,同時(shí)構(gòu)建了木糖誘導(dǎo)的基因表達(dá)模式.在發(fā)酵過程中先積累一定量的菌體后,添加木糖誘導(dǎo)促使代謝流向產(chǎn)物合成途徑.將該策略應(yīng)用于搖瓶發(fā)酵,四氫嘧啶產(chǎn)量由13.6 g/L提高到15.0 g/L.在此基礎(chǔ)上,筆者團(tuán)隊(duì)利用CRISPRi技術(shù)對(duì)磷酸戊糖途徑和TCA循環(huán)的關(guān)鍵基因進(jìn)行干擾,大幅提升了四氫嘧啶的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率(未發(fā)表).

6 結(jié) 論

氨基酸生產(chǎn)是我國發(fā)酵行業(yè)重要支柱產(chǎn)業(yè)之一,目前需要提升大宗氨基酸生產(chǎn)的技術(shù)水平,同時(shí)大力開發(fā)小品種氨基酸及衍生物.其中,菌株選育技術(shù)是關(guān)鍵,通過代謝工程構(gòu)建遺傳背景清楚、生產(chǎn)性能穩(wěn)定的工程菌株必將替代現(xiàn)有的傳統(tǒng)誘變菌株.未來氨基酸菌株構(gòu)建除了注重發(fā)酵指標(biāo),如產(chǎn)酸、轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)強(qiáng)度等,還需要進(jìn)行諸多方面的考慮.開發(fā)廉價(jià)的生物質(zhì)廢棄物發(fā)酵替代原料,不僅有利于降低發(fā)酵成本,而且具有重要的社會(huì)意義.提高生產(chǎn)菌株逆境脅迫能力,如耐酸、耐高溫、耐滲透壓能力,能夠極大地提升氨基酸發(fā)酵性能,同時(shí)可能變革發(fā)酵過程控制和產(chǎn)品分離提純工藝.

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