田 力，陳欣欣，孫 淼，滕偉禹*

0 引言

腦出血(Intracerebral hemorrhage，ICH)是指非外傷性的腦實質(zhì)內(nèi)出血，發(fā)病率為 3%～14%，急性期致死率高達40%，致殘率70%以上，多數(shù)幸存者遺留較為嚴重的神經(jīng)功能缺損[1-2]。系統(tǒng)性炎癥反應是ICH后腦損傷的重要因素，炎性細胞活化、黏附、聚集于血管內(nèi)皮，釋放大量炎性細胞因子及黏附分子，加重了ICH后損傷[3]。研究表明，ICH后患者體內(nèi)單核細胞處于活化狀態(tài)，具有較強的促進炎性細胞因子分泌的功能，并通過影響適應性免疫應答參與機體的炎癥反應[4]。單核細胞分為3個亞群：經(jīng)典型(CD14highCD16-)、中間型(CD14highCD16+)和非經(jīng)典型(CD14lowCD16++)，不同亞群在表型、功能及炎癥活化潛能方面存在明顯差異[5]。中間型單核細胞活化后能產(chǎn)生大量促炎細胞因子，抗原提呈能力增強，促進T細胞活化、增殖，并表達促血管生成的相關(guān)因子。因此，中間型單核細胞亞群具有較高的活化炎癥反應潛能[6]。本研究擬在外周血水平檢測患者單核細胞亞型比例的變化及其在ICH后炎性損傷過程中的作用，探討外周血單核細胞亞型改變在腦出血進展中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選擇2015年3月至2017年12月中國醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科、中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院老年病科的ICH患者(ICH組)，以及中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院體檢中心進行健康檢查的同年齡健康老年人(對照組)，年齡均≥60歲。ICH組39例，男20例，女19例，年齡59～85歲，平均(64.75±14.76)歲。對照組男12例，女14例，年齡62～85歲，平均(66.23±12.79)歲，排除既往心腦血管等方面疾病。兩組在年齡、性別構(gòu)成等方面差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

外周血標本采集及單核細胞分選納入標準：①符合第4屆全國腦血管病學術(shù)會議修訂的腦出血診斷標準，并經(jīng)顱腦CT掃描證實；②起病后24 h內(nèi)入院。排除標準：①非血管性腦卒中、腦動脈瘤或血管畸形破裂、腦腫瘤、創(chuàng)傷或血管夾層造成的腦血管破裂出血、炎癥、自身免疫性疾病以及出血或凝血機制異常導致的腦出血；②患有其他腦血管病及神經(jīng)變性疾?。虎酆喜乐匦?、肺、肝臟疾病、痛風、感染性疾病或惡性腫瘤。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，征得參加者知情同意。

1.2 研究方法 分別于ICH后1、3、7 d清晨空腹抽取外周靜脈血3 ml，肝素鈉抗凝，24 h內(nèi)完成流式細胞技術(shù)檢測。

1.3 主要試劑 異硫氰酸熒光素鼠抗人-CD14、葉綠素蛋白偶聯(lián)物(PerCP-cy5.5)鼠抗人-CD16單克隆抗體及同型對照、莫能霉素、紅細胞裂解液、破膜/固定劑、緩沖液等試劑(BD)；佛波酯和離子霉素(Sigma)；TNF-α、IL-6抗體(Bio-Rad)；常規(guī)試劑均購自沈陽化學試劑采購供應站。

1.4 流式細胞技術(shù)檢測外周血中間型單核細胞亞群 按照說明書方法采用每100 μl外周血加入10 μl異硫氰酸熒光素鼠抗人-CD14+、10 μl葉綠素蛋白偶聯(lián)物鼠抗人-CD16+單克隆抗體，室溫避光孵育30 min，紅細胞裂解液破壞紅細胞后，磷酸鹽緩沖液洗滌，500×g離心6 min，棄上清，400 μl磷酸鹽緩沖液重懸細胞。用FACS Canto流式細胞儀檢測，采用前向散射光和側(cè)向散射光區(qū)別單核細胞，以單核細胞設門，讀取單核細胞分型比例。

1.5 流式細胞技術(shù)檢測外周血單核細胞亞群細胞因子平均熒光強度 按照說明書方法，每100 μl外周血加入50 ng/ml佛波酯、1 μg/ml離子霉素和2.0 μmol/L莫能霉素，刺激培養(yǎng)4 h，經(jīng)紅細胞裂解液破壞紅細胞后，磷酸鹽緩沖液洗滌，500×g離心6 min,棄上清，100 μl磷酸鹽緩沖液重懸細胞。加入10 μl異硫氰酸熒光素鼠抗人-CD14+、10 μl葉綠素蛋白偶聯(lián)物鼠抗人-CD16+，室溫避光孵育30 min，磷酸鹽緩沖液洗滌，加入500 μl破膜/固定劑，室溫避光孵育20 min，緩沖液洗滌并重懸，100 μl細胞懸液中加入10 μl藻紅蛋白-鼠抗人TNF-α或 IL-6抗體，室溫避光孵育30 min。磷酸鹽緩沖液洗滌，400 μl磷酸鹽緩沖液重懸細胞。以中間型單核細胞設門，讀取TNF-α和IL-6的平均熒光強度。

1.6 ELISA方法檢測血清細胞因子濃度 取外周血2 ml，500×g離心5 min，收集血清，-80 ℃冰箱凍存。按試劑說明書方法檢測TNF-α、IL-6濃度。

2 結(jié)果

2.1 ICH后患者外周血單核細胞向中間型極化 與對照組比較，ICH后1、3、7 d中間型及非經(jīng)典型單核細胞亞群比例均明顯增加(P<0.01)，3 d時增加更顯著；而經(jīng)典型單核細胞亞群比例在ICH后1、3、7 d顯著下降(P<0.01)。見表1。

2.2 ICH后患者外周血中間型單核細胞內(nèi)炎性因子含量比較 與對照組比較，ICH后3、7 d外周血中間型及非經(jīng)典型單核細胞胞內(nèi)TNF-α和IL-6 平均熒光強度升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

2.3 ICH后患者血清細胞炎性因子濃度比較及其與中間型單核細胞比例的相關(guān)性 ICH后3、7 d患者血清濃度高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。ICH后3、7 d患者中間型單核細胞亞群比例與血清 IL-6、TNF-α 呈正相關(guān)(r3d=0.397、0.325,r7d=0.308、0.362，P<0.05)。

3 討論

考慮到全血更能代表機體內(nèi)自然狀況，本研究采用全血細胞直接檢測，也避免了先分離單個核細胞過程中可能會導致細胞異常活化所產(chǎn)生的影響。研究結(jié)果顯示，與同年齡健康對照者相比，ICH組患者ICH后1、3、7 d中間型及非經(jīng)典型單核細胞亞群比例均有明顯升高，其中ICH后3 d時升高更顯著；同時經(jīng)典型單核細胞亞群比例在ICH后各時間點均有下降，這一結(jié)果符合目前關(guān)于系統(tǒng)免疫反應參與了腦卒中后損傷的觀點[7-9]。但中間型單核細胞在ICH后的活化情況及其與疾病進展的關(guān)系尚未見文獻報道。

外周血中間型單核細胞比例增加可能是自身免疫性和感染性疾病的普遍現(xiàn)象[10-12]，單核細胞在類風濕性關(guān)節(jié)炎、1型糖尿病、動脈粥樣硬化、阿爾茨海默病、帕金森病、多發(fā)性硬化及腦炎等多種自身免疫性疾病、神經(jīng)變性疾病及中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病的病理過程中發(fā)揮重要作用，其中單核細胞活化分型后異常分泌致炎因子是重要環(huán)節(jié)[13]。在中樞系統(tǒng)疾病中，單核細胞及淋巴細胞活化后更易于穿越血腦屏障進入腦實質(zhì)，從而更多地參與疾病進展，為疾病的治療提供了靶點，因此，探討ICH后炎性損傷機制，從而尋找能有效降低炎癥反應、減輕腦組織損傷的治療措施是本研究的目的。

本研究還顯示，與健康對照者相比，患者ICH后3、7 d外周血中間型及非經(jīng)典型單核細胞胞內(nèi)TNF-α、IL-6 平均熒光強度升高，表明單核細胞活性明顯增加分泌高濃度的促炎細胞因子[14]。同時患者ICH后3、7 d血清TNF-α、IL-6濃度高于對照組。TNF-α和IL-6均屬于致炎細胞因子，主要作用是通過參與機體炎癥的發(fā)生發(fā)展過程，啟動炎癥反應通路。病理情況下血清TNF-α、IL-6水平與心肌功能損害程度具有一定的相關(guān)性[15-16]；腦血管病患者急性期血清TNF-α、IL-6水平均明顯增高。TNF-α主要產(chǎn)生于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的神經(jīng)細胞、血管內(nèi)皮細胞、小膠質(zhì)細胞等，可將中性粒細胞、神經(jīng)細胞等有效激活，誘導IL-6、一氧化氮(NO)產(chǎn)生，導致人體血管內(nèi)皮細胞破壞、通透性增加，引發(fā)微循環(huán)障礙。進一步的研究顯示，患者ICH后3、7 d中間型單核細胞亞群比例與血清 IL-6、TNF-α 呈正相關(guān)，與目前研究結(jié)果基本一致[17]。

表1 兩組患者外周血單核細胞亞型變化[M(P25～P75)，%]

注：與對照組比較，*P<0.01

表2 兩組患者外周血中間型單核細胞內(nèi)IL-6、TNF-α平均熒光強度及血清濃度比較

注：與對照組比較，*P<0.01

綜上所述，本研究表明，ICH后急性期外周血中間型單核細胞比例升高，并分泌較多的促炎細胞因子(IL-6、TNF-α)，參與ICH后的炎性損傷過程。據(jù)此可以得出以下結(jié)論，調(diào)控ICH患者急性期單核細胞向中間型極化，或阻斷中間型單核細胞分泌致炎因子，可能成為抑制ICH后炎性損傷的新途經(jīng)，但患者ICH后中間型單核細胞活化的確切機制尚需進一步研究。本研究結(jié)果提示，外周血生物標本比較容易采集，根據(jù)患者外周血單核細胞亞型比例與炎性因子相關(guān)性變化可能作為疾病預后的評估指標之一，具有潛在的臨床意義。

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