孫海彥，尹慧祥，陳惠琴，王 琪，Marilyn Roossinck，Regina S Redman，Rusty Rodriguez，包曉東*

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術(shù)研究所，海南海口 571011；2.海南省熱帶微生物資源重點實驗室，海南?？?571011；3.賓夕法尼亞州立大學，美國 16802；4.華盛頓大學，美國 98195)

耐鹽微生物是一種重要的微生物資源，不僅在生命起源、進化和生物適應(yīng)極端環(huán)境等多方面具有重要的理論意義，而且在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、食品加工和環(huán)境污染治理等多個領(lǐng)域具有一定的應(yīng)用價值。例如耐鹽微生物菌可改良鹽堿地，用于加工傳統(tǒng)腌制食品和醬油，同時利用含耐鹽微生物的活性污泥處理高鹽廢水會大幅度提高處理效率。

海南省西部地區(qū)氣候干濕分明，夏季日照充足，蒸發(fā)量大，降雨少，適合鹽田生產(chǎn)。除了歷史上的洋浦千年古鹽田，目前還有鶯歌海鹽場、東方鹽場和榆亞鹽場等大型日曬鹽生產(chǎn)基地。鹽場內(nèi)的高鹽環(huán)境，有利于形成獨特的微生物區(qū)系[1]，筆者對前期從鹽場分離出的植物內(nèi)生真菌進行篩選，并對一株在8%鹽濃度下生長較好的真菌進行分析和鑒定。

1 材料與方法

1.1真菌菌株研究所用真菌內(nèi)生菌株分離于海南省鹽生生境中采集的活體植株。植物樣本于2014—2015年從樂東市鶯歌海鹽場(18.52°N，108.75°E)及東方市東方鹽場(19.23°N，108.64°E)采集獲得。菌株經(jīng)PDA分離純化后置于甘油管中于-80 ℃保藏備用。

1.2嗜鹽內(nèi)生真菌的篩選將供試菌株從甘油管中取出后，在0.2倍濃度的葡萄糖馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(含有50 μg/mL 氨芐青霉素、50 μg/mL 鏈霉素及 25 μg/mL四環(huán)素)上于室溫下活化培養(yǎng)3～7 d，對新長出的真菌菌落，經(jīng)顯微鏡檢測與原菌株形態(tài)一致后，從平板上菌絲活躍生長的部位，取直徑為6 mm的圓形瓊脂塊，分別接種于含0%、2%、4%、8%NaCl的PDA上室溫培養(yǎng)，接種后連續(xù)5 d每24 h測量平板上的菌落直徑。

1.3基因組DNA的提取、PCR擴增及序列分析將純化后的菌株接種入葡萄糖馬鈴薯水培養(yǎng)基中，在室溫下?lián)u床培養(yǎng)數(shù)天后收集菌絲，冷凍干燥后在液氮中研磨凍干菌絲直至粉末狀，稱取50～100 mg，使用CTAB法提取總DNA[2]。使用Biometra TProfessional 梯度PCR儀(Analytik Jena，德國)擴增ITS片段，所用引物為ITS 5(5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’)和ITS 4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)，50 μL 反應(yīng)體系中包含20 ng 模板DNA，5 μL 10×PCR 緩沖液，0.2 mmol/L dNTPs，ITS5及ITS4引物0.4 μmol/L，1 U TaKaRaTaq?DNA 聚合酶(TaKaRa，日本)；反應(yīng)條件為95 ℃ 1 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s 及72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過1.5%瓊脂糖電泳驗證后直接送至華大基因廣州分公司進行測序。測序序列通過BioEdit[3]拼接后，在GenBank中使用Blast進行同源性搜索，隨后下載同源性最高物種及其親緣種ITS序列10條，與測序序列一并使用ClustalW進行比對，再通過jModelTest[4]選擇核苷酸替換模型，導入PAUP[5]中以Maximum Likelihood方法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，并使用Bootstrap方法計算可靠性；另外使用MrBayes[6]獨立分析進化樹及后驗概率，并與PAUP中的結(jié)果相互驗證。

1.4菌液發(fā)酵及色譜分析取活化后的菌株接種于PDB液體培養(yǎng)基中，室溫下振蕩培養(yǎng)3 d作為種子液，分別接種于鹽濃度為0%、2%、4%、8%的大米固體培養(yǎng)基中，在室溫下靜置培養(yǎng)50 d。發(fā)酵結(jié)束后按前述方法進行提取和分離[7]。HPLC條件：Kromasil-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 mm)，流動相乙腈-水(體積比40∶60)，分析時間30 min，流速1.0 mL/min，進樣量 20 mL，檢測波長254 nm，柱溫為25 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1形態(tài)學特征在受試的38株真菌中，以菌落直徑為指標，4株真菌在不添加NaCl的培養(yǎng)基上生長最好，25株真菌在2%NaCl濃度下生長速度最快，6株真菌在4%NaCl濃度下生長速度最快，2株真菌在8%NaCl濃度下生長速度最快，1株在各濃度NaCl下生長無明顯差別(圖1)。在4%和8%NaCl濃度條件下生長最好的8株真菌中，6株菌生長速度、菌落及菌絲形態(tài)接近，表現(xiàn)為生長速度緩慢，菌落正面呈灰黑色至黑色，菌落背面呈青黑色至黑色，顯微鏡下菌絲有分隔，呈淡灰至褐色，末端有深色芽生孢子，孢子大小為[5.2～10.5(15.3)]μm×(2.8～4.5)μm，其中尤以Lyc29菌株在8%NaCl濃度下生長速度最快，但菌落顏色較淺，菌絲疏松，提示NaCl濃度可能誘導其生理變化(圖1、2)。

注：Hortaea werneckii各菌株用粗虛線表示，其他菌株用連續(xù)線表示Note：The strains of Hortaea werneckii are represented by a thick dotted line，other strains are represented by continuous lines圖1 受試真菌在不同NaCl濃度下的生長速度Fig.1 The growth speed of tested fungal isolate against different concentrations of NaCl

2.2聚類學分析將Lyc29和其他5株近似菌的ITS rDNA擴增片段通過Blast在GenBank中進行分析，發(fā)現(xiàn)與已知Hortaeawerneckii的序列相似度最高，因此通過數(shù)據(jù)庫下載H.werneckii、H.thailandica、H.acidophila及Teratosphaeriahortaea的ITS序列共10條，合并測序序列后，以T.hortaea及H.acidophila為外群構(gòu)建進化樹，發(fā)現(xiàn)Lyc29及其他5株此次分離的菌株(Fmq5、Fmq15、Fmq25、Fmq26、Fmq28)在進化樹上與其他H.werneckii都位于同一高可靠性的分枝內(nèi)(圖3)。綜合考慮形態(tài)學證據(jù)，Lyc29等菌株的分類學地位應(yīng)屬于H.werneckii。

2.3發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC圖譜利用HPLC指紋圖譜分析不同NaCl濃度下Lyc29的發(fā)酵產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)NaCl濃度對H.werneckii的代謝產(chǎn)物具有較大影響，而當NaCl濃度達4%以后，代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生類型趨于穩(wěn)定，其中最具代表性的如圖4所示，t=12.1 min的峰只在2%NaCl濃度發(fā)酵中產(chǎn)生，t=13.4 min的峰只在4%NaCl濃度及更高濃度的發(fā)酵中產(chǎn)生。

注：a.平板菌落正面；b.平板菌落反面；c.不同NaCl濃度下的菌落；d.菌絲顯微形態(tài)Note：a.The front of plate colonies；b.The back of plate colonies；c.The colony under different NaCl concentrations；d.Hyphae microscopic morphology圖2 Lyc29菌株在PDA上的形態(tài)Fig.2 The morphology of isolate Lyc29 on PDA

圖3 菌株Lyc29的系統(tǒng)進化樹Fig.3 A phylogenic tree with isolate Lyc29

圖4 菌株Lyc29的HPLC指紋圖譜分析(254 nm檢測)Fig.4 The HPLC finger printings from isolate Lyc29 (wavelength 254 nm)

3 結(jié)論與討論

該研究通過對前期在鹽場分離的內(nèi)生真菌進行耐鹽篩選，發(fā)現(xiàn)了以菌株Lyc29為代表的一組在4%～8%NaCl濃度下生長較好的真菌，HPLC指紋圖譜分析表明在該NaCl濃度下，Lyc29產(chǎn)生了與低鹽條件下不同的代謝產(chǎn)物。經(jīng)過形態(tài)學和以ITS序列為基礎(chǔ)的進化樹聚類分析，該株真菌的分類學地位應(yīng)屬于H.werneckii[8]。

目前有部分資料將H.werneckii錯誤地等同為威尼克外瓶霉(Exophialawerneckii)，可能是由于該菌形態(tài)上與外瓶霉屬真菌接近，但H.werneckii混合產(chǎn)生合軸孢子和環(huán)痕孢子，而外瓶霉僅產(chǎn)生環(huán)痕孢子[9]。Hortaea屬目前從屬于座囊菌綱煤炱目，而Exophiala屬從屬于刺盾炱綱刺盾炱目，兩者在rDNA序列上有較大的差異。因此該研究使用中國海洋微生物菌種保藏管理中心的中文譯名，即威尼克何德霉。

H.werneckii屬于一類在細胞內(nèi)積累黑色素的酵母狀真菌，也稱黑酵母。黑酵母在生長過程中除了產(chǎn)生酵母類細胞，還可以產(chǎn)生真菌絲、假菌絲、念珠狀菌絲等不同結(jié)構(gòu)，在較強的滲透脅迫下，還可能形成可吸附酵母狀細胞[10]。H.werneckii是黑酵母中研究較多的一種真菌，除了作為人類和動物病原菌外，也常在鹽場等高鹽環(huán)境下被發(fā)現(xiàn)，在10%NaCl濃度范圍以下，其生長速度和甘油積累隨鹽濃度提高而提高[11]。隨鹽脅迫的增強，H.werneckii細胞內(nèi)不飽和脂肪酸、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺等代謝產(chǎn)物積累亦會增加[12]。

Chen等[13]曾報道了1株自海南紅樹林植物桐花樹上分離的H.werneckii內(nèi)生真菌，發(fā)現(xiàn)其最適生長NaCl濃度為5%。該研究中的6株H.werneckii真菌，4株在4%NaCl濃度生長最快，2株在8%NaCl濃度下生長更好，與Chen等的結(jié)果接近。黑酵母在鹽田中廣泛存在，與酵母相比具有較獨特的耐鹽機制。H.werneckii作為研究微生物耐鹽機制的模式物種，在國外已有少量研究基礎(chǔ)，國內(nèi)對黑酵母的研究非常有限，該研究將有利于此領(lǐng)域后續(xù)工作的開展。

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