余 瑛，劉志云，余 磊，魯秀敏

(重慶理工大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院， 重慶 400054)

蛋白質(zhì)是現(xiàn)代分子生物學(xué)中最重要的研究對(duì)象之一。蛋白質(zhì)研究過(guò)程中通常需要通過(guò)紫外分析、同位素標(biāo)記、酶標(biāo)記等方法進(jìn)行跟蹤檢測(cè)，過(guò)程繁瑣。熒光蛋白由于檢測(cè)方便且不影響蛋白質(zhì)生物學(xué)活性，在分子生物學(xué)領(lǐng)域得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用，如在基因功能鑒定中用于基因定位[1-2]、基因調(diào)節(jié)[3-4]、蛋白質(zhì)相互作用[5]研究等，在醫(yī)藥研發(fā)中用于腫瘤檢測(cè)[6-8]、藥物篩選[9-10]等。熒光蛋白通常需要特定波長(zhǎng)的光源激發(fā)才能發(fā)出熒光，檢測(cè)過(guò)程仍需要依賴昂貴的儀器。

mRuby2由斯坦福大學(xué)的Lin等[11]設(shè)計(jì)，是最明亮的單體紅色熒光蛋白之一。在雙熒光報(bào)告系統(tǒng)中利用Clover 和mRuby2替換CFP和YFP，可顯著提高檢測(cè)的靈敏性[11-12]。mRuby2作為熒光標(biāo)記還用于觀察真核活細(xì)胞遷移過(guò)程以及蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的分布、轉(zhuǎn)移等現(xiàn)象[13]。

最近研究發(fā)現(xiàn)，熒光蛋白mRuby2能在原核系統(tǒng)中高效表達(dá)，產(chǎn)生穿透力極強(qiáng)的紅色熒光。這種熒光蛋白在活細(xì)胞中的表達(dá)及體外純化過(guò)程都能在日光下直觀地呈現(xiàn)，方便隨時(shí)對(duì)目的蛋白進(jìn)行跟蹤檢測(cè)。本研究構(gòu)建了mRuby2的原核表達(dá)菌株，觀察了該基因在大腸桿菌中隨誘導(dǎo)時(shí)間表達(dá)水平發(fā)生變化的過(guò)程，采用Ni親和層析對(duì)mRuby2編碼的重組紅色熒光蛋白進(jìn)行了純化。mRuby2編碼的紅色熒光蛋白在表達(dá)及純化過(guò)程中均呈現(xiàn)出極好的可視性和指示性，特別適合作為生化、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)和蛋白標(biāo)記的候選基因。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株及質(zhì)粒

菌株DH5α、BL21(DE3)，質(zhì)粒pET30a(+)、pcDNA3-mRuby2由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶BamHI、EcoRI，T4 DNA 連接酶、LA Taq DNA聚合酶、DNA 分子量marker 100 bp Ladder、DL2000購(gòu)自TaKaRa 公司；蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；DNA片段瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、IPTG 等購(gòu)自 Omega生物技術(shù)有限公司。Ni親和層析預(yù)裝柱購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。

1.1.3 主要溶液

① LB液體培養(yǎng)基:NaCl 5 g/L,酵母提取物5 g/L,胰蛋白胨 10 g/L，滅菌備用。

② LB固體培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基中加入1.5%瓊脂，滅菌備用。

③ 卡拉霉素溶液：30 mg/mL，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌。

④ 細(xì)胞裂解液:50 mmol/L Tris-HCl (pH值為8.0)，0.1mol/L NaCl，0.1 mmol/L PMSF。

⑤ 平衡溶液:50 mmol/L Tris-HCl (pH值為8.0)，0.1 mol/L NaCl。

⑥ 50 mmol/L咪唑溶液:50 mmol/L Tris-HCl (pH值為8.0)，0.1 mol/L NaCl,50 mmol/L咪唑。

⑦ 200 mmol/L咪唑溶液:50 mmol/L Tris-HCl (pH值為8.0)，0.1 mol/L NaCl，200 mmol/L咪唑。

1.1.4 主要設(shè)備

PCR儀、電泳儀、蛋白純化儀。

1.2 方法

1.2.1大腸桿菌DH5α，BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞的制備

采用CaCl2法[14]制備DH5α，BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。

1.2.2pET30a(+)-mRuby2原核表達(dá)載體的構(gòu)建

1) 引物設(shè)計(jì)和合成

根據(jù)載體pcDNA3-mRuby2序列和pET30a(+)多克隆位點(diǎn)信息，利用Primer5.0設(shè)計(jì)了一對(duì)特異引物F1、R1，兩條引物上下游分別帶有BamHI或EcoRI識(shí)別的酶切位點(diǎn)，引物序列見(jiàn)表1。

表1 PCR引物

2) mRuby2基因片段的獲得

mRuby2基因片段采用PCR方法獲得，擴(kuò)增反應(yīng)體系如下：引物F1(10 μmol/L) 2 μL，R1(10 μmol/L) 2 μL，LA DNA polymerase 1u，10×LA Reaction Buffer 5 μL，dNTP(2.5 μmol/L)2 μL，pcDNA3-mRuby2(2 ng/μL)1 μL，加超純水至50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s,57 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min。反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒純化目的基因片段。

3) pET30a(+)與 mRuby2的酶切處理

質(zhì)粒pET30a(+)及回收后的mRuby2分別用BamHI和EcoRI進(jìn)行雙酶切處理，然后回收純化。酶切體系為：pET30a(+) 4 μg (或全部回收后的mRuby2)，EcoRI(15 U/μL)0.5 μL，BamHI(15 U/μL)0.5 μL，10×H buffer 2 μL，加超純水至20 μL。37 ℃，1 h孵育后，在1.5%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，用膠回收試劑盒回收酶切片段。

4) 連接與轉(zhuǎn)化

經(jīng)酶切、回收處理后的pET30a(+)、mRuby2按以下體系進(jìn)行連接：pET30a(+)(60 ng/μL) 1μL，mRuby2 (20 ng/μL) 1 μL，T4DNA ligase (350 u/μL) 1 μL，10×T4DNA ligase buffer 1 μL，加超純水至10 μL。16 ℃連接1 h，然后用CaCl2法轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化液涂布含有卡拉霉素的LB平板，37 ℃倒置培養(yǎng)。

1.2.3 pET30a(+)-mRuby2重組子的鑒定

1) 菌落PCR鑒定

從轉(zhuǎn)化平板上挑取轉(zhuǎn)化子，制成菌懸液作為PCR反應(yīng)模板。按本文1.2.2節(jié)PCR反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增完成后，進(jìn)行電泳檢測(cè)。

2) 酶切鑒定

取PCR結(jié)果呈陽(yáng)性的克隆接種于含有卡拉霉素的LB液體培養(yǎng)基，200 r/min，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切。酶切體系為：質(zhì)粒DNA 2 μg，EcoRI(15 U/μL)0.5 μL，BamHI(15 U/μL)0.5 μL，10×H buffer 2 μL，加超純水至20 μL。37℃，1 h孵育，電泳，觀察酶切結(jié)果。

1.2.4 mRuby2蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

取PCR及酶切驗(yàn)證均為陽(yáng)性的質(zhì)粒測(cè)序。測(cè)序正確的pET30a(+)-mRuby2質(zhì)粒以CaCl2法轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。次日，挑取轉(zhuǎn)化子接種含有卡拉霉素的LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD600=0.8時(shí)加入終濃度為1 mmol/L的IPTG進(jìn)行表達(dá)誘導(dǎo)，間隔1 h收集菌液，比較觀察不同誘導(dǎo)時(shí)間菌液顏色的變化。并于熒光顯微鏡下觀測(cè)mRuby2熒光蛋白表達(dá)情況。用SDS-PAGE電泳[14]分析不同誘導(dǎo)時(shí)間目的蛋白表達(dá)的情況。

1.2.5 鎳螯合親和層析法純化mRuby2蛋白

1) 細(xì)胞裂解液的制備

將1 L誘導(dǎo)后的菌液離心，收集菌體。按細(xì)菌濕重∶細(xì)胞裂解液(g/g)=1∶5加入裂解液，重懸細(xì)胞。用超聲法破碎細(xì)胞，條件為：功率400 W，超聲3 s，間隔2 s，重復(fù)180次；4 ℃，16 000 r/min， 15 min離心收集裂解上清；裂解上清用微孔濾膜過(guò)濾，冰上放置。

2) Ni親和層析純化目的蛋白

用5倍介質(zhì)體積的平衡溶液平衡層析柱上樣，使細(xì)胞裂解液隨流動(dòng)相進(jìn)入層析柱；用5倍介質(zhì)體積的平衡溶液平衡層析柱，洗去未與介質(zhì)結(jié)合的雜質(zhì)；用5倍介質(zhì)體積的50 mmol/L咪唑溶液洗柱去除非特異結(jié)合的雜蛋白；用10倍介質(zhì)體積的200 mmol/L咪唑洗脫目標(biāo)蛋白，按每管 1 mL收集所有流出液，保存?zhèn)溆?。純化過(guò)程流速為15 mL/h。用SDS-PAGE檢測(cè)mRuby2蛋白純化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 pET30a(+)-mRuby2重組質(zhì)粒的構(gòu)建

采用PCR方法以pcDNA3-mRuby2質(zhì)粒為模板成功擴(kuò)增出了mRuby2基因片段(見(jiàn)圖1)，其相對(duì)分子質(zhì)量大小為730 bp。分別將mRuby2與pET30a(+)用BamHI和EcoRI進(jìn)行酶切，然后連接、轉(zhuǎn)化，在轉(zhuǎn)化平板上挑取5個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR鑒定，1#、2#、5#克隆呈陽(yáng)性(圖2(a)，選取1#、2#克隆培養(yǎng)提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切，產(chǎn)物中均含有大小為730 bp的目的條帶(圖2(b))，結(jié)果顯示1#、2#均呈陽(yáng)性。

1.PCR擴(kuò)增的mRuby2片段; M.DL2000

1～5.轉(zhuǎn)化子的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； M.DL2000(a) 菌落PCR鑒定結(jié)果

1～2.BamHI、EcoRI雙酶切處理重組質(zhì)粒； M.DL2000(b) pET30a(+)-mRuby2重組質(zhì)粒的酶切

2.2 pET30a(+)-mRuby2/BL21DE3的培養(yǎng)與mRuby2蛋白的表達(dá)

用1#克隆的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21DE3，獲得pET30a(+)-mRuby2/BL21DE3菌株。培養(yǎng)pET30a(+)-mRuby2/BL21DE3至OD600達(dá)到0.8時(shí)加入IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，間隔1 h收集菌液。觀察發(fā)現(xiàn)隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，發(fā)酵液的顏色逐漸轉(zhuǎn)紅、加深(圖3(a))。誘導(dǎo)后的菌液離心獲得的菌體呈較深的粉紅色(圖3(b))，在熒光顯微鏡下觀察可見(jiàn)菌體整體出現(xiàn)極強(qiáng)的紅色熒光(圖3(c))，提示mRuby2基因在BL21DE3中得到成功表達(dá)。

取不同誘導(dǎo)時(shí)間發(fā)酵菌液的裂解上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果提示目的蛋白濃度隨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)量增加，誘導(dǎo)4～6 h表達(dá)水平達(dá)到峰值，與發(fā)酵液的顏色變化一致(見(jiàn)圖4)。

2.3 mRuby2蛋白的純化

將1 L誘導(dǎo)6 h的發(fā)酵液進(jìn)行離心，收集mRuby2/BL21DE3菌體，經(jīng)超聲裂解、離心、微孔過(guò)濾獲得裂解上清。因mRuby2插入pET30a(+)后帶有his-tag，可以用Ni親和層析方法純化目的蛋白。目的蛋白吸附到Ni親和柱上使介質(zhì)由藍(lán)綠色(圖4(a1))轉(zhuǎn)變?yōu)樽霞t色(圖4(a2))，隨著咪唑溶液對(duì)目的蛋白洗脫，含有目的蛋白的紅色洗脫液流出，親和柱中的介質(zhì)又重新恢復(fù)呈藍(lán)綠色。

圖4 不同誘導(dǎo)時(shí)間mRuby2蛋白表達(dá)情況的檢測(cè)

圖5 Ni螯合親和層析純化目的蛋白

在進(jìn)行鎳螯合親和層析純化目的蛋白的過(guò)程中，用50 mmol/L咪唑洗脫時(shí)，收集到的溶液為淺紅色，用200 mmol/L咪唑洗脫時(shí)，初期流出液顏色呈較深的枚紅色，然后顏色逐漸變淺，最后至無(wú)色。SDS-PAGE電泳結(jié)果(圖4(b))顯示50 mmol/L咪唑洗脫的流出液中目的蛋白較少，200 mmol/L咪唑洗脫液中含有大量的目的蛋白，純度在80%以上。結(jié)果表明：純化過(guò)程中流出液顏色的變化與目的蛋白濃度變化一致，說(shuō)明mRuby2編碼的熒光蛋白其顏色艷麗、可視，對(duì)純化過(guò)程具有很好的指示作用。

3 討論

在高校生物化學(xué)、分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)中,基因的克隆、重組表達(dá)載體構(gòu)建、目的蛋白在宿主細(xì)胞中的表達(dá)及純化常常作為經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目開(kāi)設(shè)。在有限的課時(shí)內(nèi)，要達(dá)到較好的教學(xué)效果,就要求實(shí)驗(yàn)過(guò)程要易于操作、省時(shí)且結(jié)果直觀。

mRuby2是目前已知的發(fā)光強(qiáng)度最大的紅色熒光蛋白之一。在LB液體培養(yǎng)基中，接種大腸桿菌BL21(DE3)/pET30a(+)-mRuby2，37 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)后，發(fā)酵菌液呈橙紅色，離心沉淀的菌體在日光下就可以顯現(xiàn)為明顯的紅色，與轉(zhuǎn)入空載質(zhì)粒的BL21(DE3)/pET30a(+)比較有明顯差異。

在Ni親和層析實(shí)驗(yàn)中，超聲破碎、離心后得到的含有重組mRuby2蛋白的裂解液上清為粉紅色。當(dāng)帶有His-tag的重組mRuby2蛋白隨流動(dòng)相進(jìn)入固相時(shí)，能清晰地觀察到mRuby2重組蛋白吸附在固相上，使層析柱中的Ni親和介質(zhì)逐漸由藍(lán)綠色變?yōu)槊导t色，這一過(guò)程中流出的穿柱液顏色幾乎無(wú)色。隨著咪唑溶液的加入，流出液的顏色變?yōu)榧t色，目的蛋白得到洗脫。將收集的裂解液上清、穿柱液、洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，凝膠染色，觀察目的蛋白條帶的含量。結(jié)果提示層析過(guò)程中流動(dòng)相、固相顏色的變化規(guī)律與SDS-PAGE檢測(cè)的結(jié)果一致。因此，mRuby2蛋白不僅可以作為理想的原核表達(dá)報(bào)告基因，而且在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中能明確、直觀地顯示目的基因表達(dá)的情況。在課時(shí)有限時(shí)，可以直接根據(jù)發(fā)酵液或裂解液上清的顏色，判斷目的蛋白的存在，也可與菌落PCR鑒定，SDS-PAGE等常規(guī)方法配合使用，相互印證。

本文所建立的實(shí)驗(yàn)方案包括了完整的mRuby2基因克隆，重組子鑒定，目的蛋白表達(dá)、純化等過(guò)程，涉及PCR、酶切、連接、轉(zhuǎn)化、微生物培養(yǎng)、顯微觀察、超聲破碎、SDS-PAGE、親和層析等實(shí)驗(yàn)操作,目測(cè)顏色變化可以與常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法相互結(jié)合，使學(xué)生能直觀地觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果,便于對(duì)實(shí)驗(yàn)方法、原理進(jìn)行正確理解和掌握。本文建立的研究?jī)?nèi)容和方法為生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)等實(shí)踐教學(xué)提供了一個(gè)很好的教學(xué)參考方案。

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