孟志鵬，劉靜，胡四平，童飛，龔浩杰

內(nèi)毒素（LPS）導(dǎo)致的膿毒血癥是全身炎癥反應(yīng)綜合癥，肺臟是膿毒癥時最先受到攻擊的靶器官，發(fā)生率高達(dá)83%～100%，可引起急性肺損傷（ALI）/急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）甚至多器官功能障礙綜合征（MODS）[1]。目前ALI的研究證明炎性反應(yīng)失衡是ALI的根本原因之一，臨床最基本的治療方法也以控制感染為主，抗感染治療和臟器保護(hù)方面都已經(jīng)取得巨大的進(jìn)步，但迄今為止ALI/ARDS病死率仍高達(dá)30%～40%[2]。右美托咪定（DEX）是一種高選擇性-2腎上腺素受體激動劑，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、催眠又不抑制呼吸等特殊優(yōu)勢，特別是在膿毒癥患者急性肺損傷呼吸機(jī)支持治療時[3]。DEX還具有獨(dú)特的抗炎、抗氧化和肺保護(hù)作用[4-5]，能減輕呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷[6]。鹽酸戊乙奎醚（PHC）是新型莨菪堿類抗膽堿藥[7]，國內(nèi)已有研究表明鹽酸戊乙奎醚作用于M1、M3受體，降低膽堿能神經(jīng)的張力，使支氣管平滑肌松弛，支氣管擴(kuò)張，減少分泌物，降低氣道阻力和增加呼吸流量，改善氣道壓力，增加肺順應(yīng)性減緩急性肺損傷的進(jìn)展[8-9]，對各種類型的肺損傷具有一定的保護(hù)作用。本研究旨在比較PHC及DEX對LPS致大鼠ALI的保護(hù)性作用，以期為臨床ALI的治療提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 成年清潔健康雄性SD大鼠40只，8周齡，體質(zhì)量250～300g，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物實驗中心提供 [動物使用許可證號：SYXK(浙)2014-0001]，于室溫22～24℃、分組分籠安靜環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng)，每籠 3～4只，模擬晝夜交替12 h，可自由飲食飲水，適應(yīng)環(huán)境1周。

1.2 模型制備與分組 大鼠禁食12 h，自由飲水。腹腔注射10%水合氯醛400 mg/kg麻醉后稱重，仰臥位固定于墊有保溫毯的操作臺上，待其體痛反射消失后用0.7 mm穿刺針（蘇州BD醫(yī)療器械公司）行右股靜脈、右頸內(nèi)動脈置管。大鼠術(shù)中自主呼吸保留。按隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為4組，每組10只：0.9%氯化鈉注射液組（對照組），經(jīng)右股靜脈給予等量0.9%氯化鈉注射液；LPS處理組（LPS組），右股靜脈按6mg/kg注射LPS（美國Sigma公司）；DEX治療組（L+D組），右股靜脈注射等量LPS0.5h后2min內(nèi)同樣通過右股靜脈注射DEX 50g/kg（江蘇恒瑞醫(yī)藥公司，批號：16060132），隨后以 5g·kg－1·h－1微量注射泵泵入；PHC治療組（L+P組），右股靜脈注射等量LPS 0.5 h后2 min內(nèi)同樣通過右股靜脈注射PHC1mg/kg（成都力思特制藥股份有限公司，批號：H20080606），隨后以1g·kg－1·h－1微量注射泵泵入。

1.3 標(biāo)本采集與檢測 大鼠注射0.9%氯化鈉注射液或LPS 6 h后實驗結(jié)束，右頸動脈采血2 ml后放血處死，血液經(jīng)肝素抗凝后，4℃下以2 000 r/min離心10 min，離心半徑為13.5 cm，用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法測定腫瘤壞死因子-（TNF-）水平，試劑盒購自杭州聯(lián)科生物公司（批號：70-EK3822/2）；測定包細(xì)胞介素-1（IL-1）、包細(xì)胞介素-6（IL-6）含量，試劑盒購自杭州聯(lián)科生物公司（批號：70-EK3062/2）。胸部備皮消毒后置于無菌操作臺上,嚴(yán)格無菌操作，依解剖結(jié)構(gòu)打開胸腔，充分暴露心臟，經(jīng)右心室插管至肺動脈，用0.9%氯化鈉注射液快速沖洗后取右肺上葉4mm×4mm組織，將其置于4℃4%甲醛溶液固定48 h，石蠟包埋，切片（厚度5m），HE染色，光鏡下行肺組織病理學(xué)檢查，并從中性粒細(xì)胞浸潤、肺泡間隔增寬、肺泡腔內(nèi)出血及肺泡腔滲出四方面按嚴(yán)重程度行彌漫性肺泡損傷標(biāo)準(zhǔn)（DAD）評分（正常：0分；輕度：1分；中度：2分；重度：3分）[10]；取右肺中葉組織，濾紙吸盡表面水分，用電子分析天平稱濕重（W），然后置80℃電熱干燥箱內(nèi)烘烤24 h左右，待質(zhì)量恒定后稱干重（D），計算肺組織濕/干重比值（W/D）。分離氣管，夾閉右支氣管，分3次用4℃0.9%氯化鈉注射液按20ml/kg行左支氣管肺泡灌洗，并回收左支氣管肺泡灌洗液（BALF），并于4℃下以1 200 r/min離心10 min，離心半徑為13.5 cm，用ELISA法測定BALF的TNF-、IL-6含量，用蛋白定量法（BCA）測定總蛋白含量（TP），試劑盒購自碧云天生物研究所（批號：P0012）。

1.4 統(tǒng)計方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用 檢驗；計數(shù)資料采用2檢驗。＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

組血漿TNF-、IL-1及IL-6均高于對照組（19.3，均＜0.05）；L+D組、L+P組血漿TNF-、IL-1、IL-6均低于ALI組（22.3，均P＜ 0.05）；L+P 組與L+D組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（=0.05＞ 0.05）。見表1。

2.2 病理學(xué)觀察 光鏡下，對照組無明顯肺損傷，結(jié)構(gòu)未見明顯異常，中性粒細(xì)胞浸潤少見；ALI組肺泡結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，結(jié)構(gòu)紊亂，大量中性粒細(xì)胞浸潤，肺泡間隔明顯增寬，肺泡腔滲出伴有明顯出血；L+D組、D+L組組也有肺損傷，但較LPS組輕，肺泡結(jié)構(gòu)破壞、間質(zhì)中性粒細(xì)胞浸潤、肺泡間隔增寬、肺泡腔滲出、出血程度均較LPS組輕；D+L組各項指標(biāo)較L+D組程度輕。見封四彩圖3。

2.3 DAD評分和W/D比較 3個實驗組DAD評分均高于對照組（13.598，均＜0.05）；L+D組與L+P組DAD評分均低于ALI組（≥50.596，均＜0.05）；L+P組與L+D組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（=0.17，＞ 0.05）。3個實驗組 W/D均高于對照組（28.461，均＜0.05）；L+D組、L+P組W/D均低于ALI組（8.433，均＜0.05）；L+P組與L+D組差異無統(tǒng)計學(xué)（=0.88＞0.05）。見表2。

3 討論

LPS作用于肺內(nèi)的內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等，激活I(lǐng)L、TNF-和其他炎癥介質(zhì)大量表達(dá)，促使中性粒細(xì)胞在肺組織內(nèi)活化和聚集，產(chǎn)生大量氧自由基，引起肺毛細(xì)血管內(nèi)皮損傷，完整性破壞，毛細(xì)血管屏障受損、滲漏，血管通透性增加，富含蛋白的液體滲入到肺泡腔，促使肺組織炎性滲出和肺泡損傷[11-12]。該試驗選擇股靜脈注射6mg/kg LPS制備大鼠ALI模型，出現(xiàn)特征性肺組織病理學(xué)改變，與對照組比較，實驗組大鼠病理學(xué)切片示肺組織損傷、大量中性粒細(xì)胞浸潤、肺泡腔內(nèi)滲出、出血、肺泡間隔增寬，肺W/D值升高，DAD評分升高，表明成功制備了大鼠ALI模型。

表1 各組血清TNF-和IL-6水平比較 pg/ml

表2 各組DAD評分和肺組織W/D值比較

表3 各組肺泡灌洗液中TNF-、IL-6和TP比較

DEX是一種新型高選擇性-2腎上腺素受體激動劑，與-2受體結(jié)合后具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、催眠、不抑制呼吸等優(yōu)點(diǎn)在臨床得到廣泛使用[13]；PHC是一種新型抗膽堿藥，其抗膽堿能作用可減少腺體分泌和氣道阻力，增加肺順應(yīng)性，緩肺毛細(xì)血管和支氣管平滑肌痙攣，改善局部微循環(huán)、減輕水腫，改善肺功能。還能穩(wěn)定細(xì)胞膜及溶酶體、線粒體等細(xì)胞器的膜結(jié)構(gòu)，抑制 TNF-、IL-6等促炎因子釋放，減輕炎癥反應(yīng)[14-15]。

TNF-是應(yīng)激反應(yīng)中起核心作用的最早促炎因子，是ALI發(fā)生發(fā)展的始動因素，是引起ALI最重要細(xì)胞因子之一，且與IL-1、IL-6具有協(xié)同作用，促進(jìn)ALI發(fā)展。本研究靜脈注射LPS后，血清和BALF中上述炎癥因子的濃度都升高，提示LPS誘發(fā)大量炎癥因子生成和釋放，炎癥反應(yīng)失控，體內(nèi)的促炎和抗炎的動態(tài)平衡被打破，而肺組織是其攻擊的首要器官。給予DEX或PHC處理后，血清和BALF中炎癥因子濃度降低，且DEX或PHC治療效果無明顯差異，與對照組無差別水平，提示DEX或PHC可以抑制LPS致大鼠膿毒癥引起的炎癥因子的釋放，減輕LPS導(dǎo)致的肺組織炎性反應(yīng)。本研究結(jié)果還表明，大鼠ALI模型成功制備后，病理切片提示肺組織一定程度的損傷，肺組織DAD評分、W/D值及BALF中的總蛋白升高，給予DEX或PHC處理后，病理切片提示肺組織損傷情況較LPS模型有明顯改善，肺組織DAD評分、W/D值及BALF總蛋白顯著下降，表明DEX或PHC治療可以降低肺泡水腫的程度，對ALI具有一定的保護(hù)作用，且DEX或PHC治療效果無明顯差異。

綜上所述，DEX和PHC都可以對LPS致大鼠ALI有保護(hù)作用，且效果相當(dāng)。由于內(nèi)毒素致大鼠急性肺損傷發(fā)生機(jī)制尚未研究透徹，DEX或PHC對急性肺損傷詳細(xì)的保護(hù)作用機(jī)制、給予不同時機(jī)、不同劑量的效果仍需進(jìn)一步研究。

[1] Liou CJ, Huang YL, Huang WC, et al.Water extract of Helminthostachys zeylanica attenuates LPS-induced acute lung injury in mice by modulating NF- B and MAPK pathways[J].J Ethnopharmacol,2017,199(7)：30-38.

[2] Rush Barret, Robert C, Anthony CL, et al. Association between chronic exposure to air pollution and mortality in the acute respiratory distresssyndrome[J]. EnvironPollut,2017,224(2)：352-356.

[3] Riker RR, ShehabiY, Bokesch PM, et al. Dexmedetomidinevs midazolam for sedation of critically ill patients：a randomized trial[J].JAMA,2009,301(5)：489-499

[4] Kawasaki T, Kawasaki C, Ueki M, et al. Dexmedetomidine suppresses proinflammatory mediator production in human whole blood in vitro[J]. J Trauma Acute Care Surg, 2013, 74(5)：1370-1375.

[5] Kurt A, Ingec M, Isaoglu U, et al. An investigation about the inhibition of acute ischemia/reperfusion damage by dexmedetomidine in rat ovarian tissue[J]. GynecolEndocrinol, 2013, 29(3)：222-225.

[6] Yang CL, Chen CH, Tsai PS, et al. Protective effects of dexmedetomidine-ketamine combination against ventilator-induced lung injury in endotoxemia rats[J]. J Surg Res,2011,167 (2)：e273-e281.

[7]Kovacs-Kasa A,Gorshkov BA,Kim KM,etal.Theprotectiverole of MLCP-mediated ERM dephosphorylation in endotoxin-induced lung injury in vitro and in vivo[J].Sci Rep,2016,(5)6：39018 doi：10.1038/srep39018.

[8] 梁世偉.陳葉明.鹽酸戊乙奎醚或阿托品聯(lián)合新斯的明拮抗神經(jīng)肌肉阻滯對患者血流動力學(xué)的影響[J].第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2005,25(12)：1581-1582.

[9]Wu GM,Mou Min,Mo LQ,et al.Penehyclidine hydrochloride postconditioning on lipopolysaccharide-induced acute lung injury by inhibition of inflammatory factors in a rodent model[J].JSurg Res,2015,195(1)：219-227.

[10]Shmygalev S,Damm M,Knels L,et al.IgM-enriched solution BT086 improves host defense capacity and energy store preservation in arabbit model of endotoxemia[J].Acta Anaesthesiol Scand,2016,60(4)：502-512.

[11]楊毅,邱海波,周韶霞,等.吸入一氧化氮對急性肺損傷小鼠肺組織炎癥反應(yīng)的影響[J].中國危重病急救醫(yī)學(xué),2002,14(12)：723-727.

[12]Matthay MA,Ware LB,Zimmerman GA.Theacuterespiratory distress syndrome[J].JClin Invest,2012,122(8)：2731-2740.

[13]Taniguchi T,Kidani Y,Kanakura H,et al.Effectsof dexmedetomi-dineon mortality rat eandin flammat or yresponsestoen dotoxin induced shockin rats[J].CritCareMed,2004,32(6)：1322-1326.

[14]于金貴,馬虹,王東信,等.鹽酸戊乙奎醚用于圍術(shù)期氣道管理的專家共識[J].臨床麻醉學(xué)雜志,2015,31(6)：621-623.

[15]姜麗華,孫亞林,姚尚龍.鹽酸戊乙奎醚對正常人離體白細(xì)胞炎性介質(zhì)的影響[J].臨床麻醉學(xué)雜志,2011,27(1)：24-26.