李翔，史志霞，李先鵬，許豐，金永軍

結(jié)腸癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，近年來(lái)發(fā)病率和病死率呈上升趨勢(shì)[1-2]。目前治療以手術(shù)切除、放化療和生物治療等綜合治療為主，但預(yù)后比較差，術(shù)后5年生存率50%[3-4]。結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移受到表觀遺傳、DNA損傷修復(fù)及癌基因表達(dá)調(diào)控等多水平多層次的復(fù)雜調(diào)控。從基因水平研究結(jié)腸癌的發(fā)病和轉(zhuǎn)移機(jī)制，探索靶向治療藥物，是提高結(jié)腸癌患者生存和預(yù)后的重要途徑。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類新近發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞內(nèi)源性的RNA分子，其轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200nt，通過(guò)基因印記、染色質(zhì)重塑、剪接調(diào)控及mRNA降解和翻譯調(diào)控等多種作用方式在不同水平進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控，參與病理生理過(guò)程的調(diào)節(jié)[5]。AFAP1-AS1位于人的 4號(hào)染色體肌動(dòng)蛋白絲相關(guān)蛋白 1（AFAP1）基因反義鏈上，全長(zhǎng)6 810 bp。研究顯示AFAP1-AS1的表達(dá)水平與消化系統(tǒng)腫瘤（膽囊癌、食管癌、結(jié)直腸癌等）的發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可能參與其發(fā)病過(guò)程，但其調(diào)控機(jī)制尚未闡明[6-8]。本研究擬探索 AFAP1-AS1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲的調(diào)控作用及其分子機(jī)制，為結(jié)腸癌的診治方向提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取杭州市紅十字會(huì)醫(yī)院2012年1—12月手術(shù)切除并經(jīng)病理學(xué)診斷為結(jié)腸癌的組織標(biāo)本56例，同時(shí)選取癌旁組織36例（距離腫瘤組織1.5 cm以上），作為對(duì)照組。收集所有結(jié)腸癌患者的臨床及病理資料，病理學(xué)分級(jí)及臨床分期參照WHO分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。所有患者術(shù)前均未接受放化療，術(shù)后隨訪截止于2016年12月，失訪1例。

1.2 試劑 結(jié)腸癌細(xì)胞系為本科室凍存細(xì)胞株。胎牛血清、細(xì)胞培養(yǎng)液、胰酶和抗生素為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品；Trizol試劑為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和定量PCR試劑均為日本Takara公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 RNA提取 將液氮凍存的結(jié)腸癌組織塊（約100 g）置于1ml trizol試劑中，勻漿后12000r/min離心5 min；將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入200l的氯仿，劇烈震蕩后靜置5 min；4℃，12000r/min離心15min；吸取500l上清液后加入等體積異丙醇；混勻后于－20℃靜置2 h；4℃，12 000轉(zhuǎn)/min離心15min；棄上清，加入500l預(yù)冷的75%乙醇清洗沉淀；加入50l去酶水溶解后在紫外分光光度計(jì)下檢測(cè)RNA質(zhì)量。

1.3.2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 以提取總RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。反應(yīng)體系（10l）為 RNA（100 ng/l）2l；5×Prime Script Buffer 2l；Prime Script RT Enzyme Mix I 0.5l；Random 6 mer（s100mol/L）0.5l；Oligo dT Prime（r50mol/L）0.5l；除酶去離子水，4.5l。反應(yīng)程序?yàn)?37℃，15 min；85℃，5 s。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在PCR儀（BioRad公司）完成。

1.3.3 實(shí)時(shí)定量PCR 將適當(dāng)稀釋后的cDNA作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，檢測(cè)基因相對(duì)表達(dá)變化。反應(yīng)體系為RT反應(yīng)液（5倍稀釋）2l；2×SYBRPremix Ex Taq II10l；PCRForward Prime（r10mol/L）0.8l；PCRReverse Prime（r10mol/L）0.8l；滅菌去離子水6l。反應(yīng)程序?yàn)?95℃，5s；60℃，30 s，設(shè)置 40 個(gè)循環(huán)，PCR反應(yīng)在定量PCR儀（Roche公司）完成；以軟件系統(tǒng)設(shè)定閾值獲取Ct值，并通過(guò)公式2-△Ct分析相對(duì)表達(dá)水平。AFAP1-AS1引物序列為：F(5’-3’)：AGCCTTGGTGAGCAATAGGT；R(5’-3’)：GGTATGAAGGGTGTGGGTGA。AFAP1引物序列為：F(5’-3’)：CGTCCAGAGCAAGGAACAG；R(5’-3’)：GGCCACTACAACCACTGTAGG。 -actin引物序列為：F(5’-3’)：TGGCATCCACGAAACTACCT；R(5’-3’)：CGTACAGGTCTTTGCGGATG。

1.3.4 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 在transwell上室中鋪上Martrige（l25g），下室中加有含血清趨化劑的培養(yǎng)液。將重懸的結(jié)腸癌細(xì)胞加入上室，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；用棉簽拭去上室上表面細(xì)胞，乙醇固定后經(jīng)HE染色，光鏡下觀察穿過(guò)Martrigel的細(xì)胞數(shù)。

1.3.5 蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn) 將結(jié)腸癌細(xì)胞用裂解液于冰上裂解30 min。離心5 min去除細(xì)胞碎片，收集上清液用BCA法測(cè)量蛋白濃度；取30g蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸10min使蛋白變性，進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳并將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上；室溫下用5%脫脂奶粉封閉1h，隨后加入一抗（AFAP1，1∶1 000；-actin，1∶2 000），4℃孵育過(guò)夜；次日沖洗后與HRP標(biāo)記的二抗（1∶1 000）室溫孵育1 h。按 ECL法進(jìn)行顯影，收集、通過(guò)Image J軟件分析灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用student-檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用2檢驗(yàn)；Kaplan-Meier法和Logrank檢驗(yàn)法進(jìn)行生存分析檢驗(yàn)。＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AFAP1-AS1表達(dá)與臨床病理和預(yù)后生存期的分析 AFAP1-AS1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織（＜0.01）（封三彩圖4A）；AFAP1-AS1的表達(dá)與患者年齡、性別和腫瘤分化均無(wú)相關(guān)性（均＞0.05），而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期相關(guān)（均＜0.05），見(jiàn)表1；AFAP1-AS1高表達(dá)的結(jié)腸癌患者總生存期和無(wú)瘤生存率均低于低表達(dá)患者（均＜0.05）（封三彩圖 4B）。

2.2 AFAP1-AS1重組腺病毒的構(gòu)建和過(guò)表達(dá)效率鑒定 熒光顯微鏡觀察顯示，感染AFAP1-AS1重組腺病毒48 h后，85%以上的SW480細(xì)胞均顯示綠色熒光；實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，結(jié)腸癌細(xì)胞APAFAS1的表達(dá)明顯升高（＜0.01）。封三彩圖5。

2.3 AFAP1-AS1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲的作用AFAP1-AS1在不同結(jié)腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平不盡相同，SW620、LoVo和HTC116細(xì)胞系中AFAP1-AS1的表達(dá)明顯高于SW480細(xì)胞系（＜ 0.01）；過(guò)表達(dá) AFAP1-AS1的結(jié)腸癌細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)明顯增多。封四彩圖1。

2.4 AFAP1-AS1對(duì)AFAP1mRNA穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)過(guò)表達(dá) AFAP1-AS1顯著降低AFAP1 mRNA的水平；AFAP1-AS1與AFAP1 mRNA存在3個(gè)區(qū)域的互補(bǔ)，片段大小分別為191 bp、165 bp和115 bp，這些可能是維持AFAP1 mRNA穩(wěn)定性的重要區(qū)域。封四彩圖1。

3 討論

結(jié)腸癌是由腸黏膜上皮發(fā)生、易發(fā)生轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤，早期診斷困難，術(shù)后復(fù)發(fā)率高。結(jié)腸癌的發(fā)病和轉(zhuǎn)移是與多因素相關(guān)的復(fù)雜過(guò)程，可能與生活方式、遺傳、炎癥等因素有關(guān)，但具體機(jī)制尚未明確[9-10]。研究表明結(jié)腸癌的發(fā)生主要涉及一系列原癌基因的異常激活以及抑癌基因的突變等，從而引起信號(hào)通路發(fā)生傳導(dǎo)異常[11]。

LncRNA是長(zhǎng)度＞ 200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，在表觀遺傳調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞分化調(diào)控等眾多生命活動(dòng)中具有重要作用，是目前遺傳學(xué)研究的熱點(diǎn)[12]。LncRNA一般具有mRNA樣結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄后可能有不同的剪接方式。大多數(shù)lncRNA在細(xì)胞分化、組織發(fā)育和腫瘤發(fā)生等過(guò)程中具有時(shí)空表達(dá)的特異性[13]。LncRNA在序列上保守性較低，人屬中僅有約12%的lncRNA可在其它物種中發(fā)現(xiàn)[14]。相較于其他非編碼RNA，lncRNA的作用方式更為廣泛，在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平都具有調(diào)節(jié)作用，提示其在機(jī)體生命活動(dòng)調(diào)節(jié)中的重要地位。LncRNA與編碼基因的染色體位置關(guān)系，可能與其功能和機(jī)制存在密切聯(lián)系。AFAP1-AS1位于AFAP1基因的反義鏈，與其有大比例的互補(bǔ)序列，推測(cè)其可能與AFAP1基因穩(wěn)定性有關(guān)。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)AFAP1-AS1與AFAP1mRNA存在3個(gè)區(qū)域的互補(bǔ)，這些可能是維持AFAP1mRNA穩(wěn)定性的關(guān)鍵序列。

近期研究發(fā)現(xiàn)AFAP1-AS1的表達(dá)水平與胃癌、膽管癌、卵巢癌等多種腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Wu等[15]首先在食管腺癌組織中發(fā)現(xiàn)AFAP1-AS1由于低甲基化而高表達(dá)，隨后發(fā)現(xiàn)AFAP1-AS1的高表達(dá)與鼻咽癌、非小細(xì)胞肺癌和胰腺癌的預(yù)后差密切相關(guān)[16-18]。Han等[8]在結(jié)直腸癌組織和HCT116和SW480細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)AFAP1-AS1高表達(dá)。本研究AFAP1-AS1在SW620、LoVo和HTC116細(xì)胞系中的表達(dá)明顯高于SW480細(xì)胞系，這可能與各細(xì)胞系的生物學(xué)功能（增殖、侵襲能力等）有關(guān)。

表1 結(jié)腸癌組織中AFAP1-AS1表達(dá)與臨床病理資料的關(guān)系 例

AFAP1作為肌動(dòng)蛋白與其它蛋白的連接分子，可被PKC磷酸化而激活，并活化Src蛋白，從而導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白纖維完整性的改變，影響細(xì)胞的吞噬、運(yùn)動(dòng)及腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[19-20]。AFAP1-AS1作為其反義鏈上的lncRNA，可能通過(guò)AFAP1表達(dá)參與生理病理進(jìn)程的調(diào)控。Han等[8]發(fā)現(xiàn)敲低AFAP1-AS1明顯抑制腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)和結(jié)直腸癌的肝轉(zhuǎn)移進(jìn)程。本研究顯示AFAP1-AS1過(guò)表達(dá)后，SW480細(xì)胞侵襲能力明顯增加；預(yù)后Kaplan-Meier曲線分析顯示，AFAP1-AS1高表達(dá)的結(jié)腸癌患者總生存期和無(wú)瘤生存率顯著少于低表達(dá)患者。這些結(jié)果說(shuō)明AFAP1-AS1可能是抑制結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的潛在靶點(diǎn)。

綜上所述，本研究從臨床水平發(fā)現(xiàn)AFAP1-AS1表達(dá)水平與結(jié)腸癌預(yù)后的相關(guān)性；細(xì)胞水平發(fā)現(xiàn)AFAP1-AS1提高結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲能力的作用，分子水平明確AFAP1-AS1對(duì)AFAP1mRNA穩(wěn)定性及蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果提示 AFAP1-AS1的表達(dá)水平與結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可能成為結(jié)腸癌治療的潛在靶點(diǎn)，深入探索其調(diào)控機(jī)制將為結(jié)腸癌靶向治療研究提供新的方向。

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