張波，李先鵬，許豐，姜玉華，吳益峰，陳穎

遠端上游元件結(jié)合蛋白1（FUBP1）是近期發(fā)現(xiàn)的一種DNA結(jié)合蛋白，通過與遠端上游元件FUSE結(jié)合調(diào)控c-myc基因轉(zhuǎn)錄表達，影響其介導的細胞生長、增殖、分化及凋亡，進而導致多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)FUBP1在70%的肝癌患者中高表達，與存活率呈顯著負相關(guān)。體外研究確認FUBP1能誘導肝癌細胞增殖，可作為肝癌治療的潛在靶點[3-4]。長鏈非編碼RNA（lncRNAs）是近年來生命科學研究領(lǐng)域中最重要的調(diào)控因子之一，在機體發(fā)育和疾病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著復雜而精確的調(diào)控功能[5-6]，但其具體機制尚未闡明。本研究通過lncRNA芯片技術(shù)，檢測了三種不同的肝癌細胞系中過表達FUBP1后差異表達的lncRNAs，并利用生物信息學的方法對這些lncRNA進行了功能分析?，F(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 主要試劑 肝癌細胞系（MHCC97H、MHCC97L和Huh7）為寧波市鄞州人民醫(yī)院實驗室凍存株。胎牛血清、細胞培養(yǎng)液、胰酶和抗生素為美國Gibco公司產(chǎn)品。RNA提取試劑為美國Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品。lncRNAs芯片為Affymetrix公司產(chǎn)品。RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和定量PCR試劑均為日本Takara公司產(chǎn)品。

1.2 慢病毒感染細胞 FUBP1過表達慢病毒的構(gòu)建、包裝、滴度測定由上海吉凱生物技術(shù)公司負責完成。將細胞接種于12孔細胞培養(yǎng)板，根據(jù)滴度將慢病毒適當稀釋后感染細胞，12 h后更換為無病毒培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)，經(jīng)含puromycin抗生素的培養(yǎng)液篩選培養(yǎng)1周，并用于下一步實驗。對照組為不含F(xiàn)UBP1的慢病毒。

1.3 lncRNAs芯片分析 各組細胞總RNA經(jīng)質(zhì)檢合格后，反轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA，再進一步合成cRNA，接著對cRNA進行第二輪反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，片段化并與生物素標記后與芯片雜交，洗脫和染色后利用Affymetrix Scanner 3000掃描得到原始圖像。再經(jīng)Affymetrix GeneChip Command Console軟件處理提取原始數(shù)據(jù)，利用Expression Console軟件進行g(shù)enelevel和exonlevel的標準化處理。后續(xù)進行基因表達分析和共表達網(wǎng)絡(luò)分析。

1.4 定量PCR 以提取總RNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。反應(yīng)程序為37℃，15min；85℃，5s。將適當稀釋后的cDNA作為模板，進行SYBR Green法定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)程序為95℃，5 s；60℃，30 s。共40個循環(huán)。通過公式2-△△Ct分析相對表達水平。以GAPDH基因作為內(nèi)參基因。

1.5 統(tǒng)計方法 采用SPSS23.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料采用均數(shù)±標準差表示，采用 檢驗。＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒感染效率的鑒定 PCR結(jié)果顯示，以對照組中 FUBP1的表達量為 1，慢病毒感染的MHCC97H、MHCC97L和 Huh7肝癌細胞株中FUBP1的mRNA水平分別為3.28±0.15、2.75±0.26和4.25±0.35，明顯高于對照組（=22.129、10.934、14.954，均＜0.01）。封三彩圖1。

2.2 過表達FUBP1后lncRNAs的表達變化 芯片結(jié)果顯示，過表達FUBP1的MHCC97H、MHCC97L和Huh7肝癌細胞株中分別有565個、1143個和755個 lncRNAs出現(xiàn)明顯的表達變化。合并分析顯示12個 lncRNA在3種細胞株中具有一致的表達變化，包括3個上調(diào)和9個下調(diào)，見表1。

2.3 差異表達 lncRNAs結(jié)果的驗證 隨機選擇6個一致表達變化的lncRNAs進行定量PCR驗證。結(jié)果顯示，lnc-KIAA1614-3、lnc-POU4F3-4和lnc-ARF6-3在3種細胞株均表達下調(diào)，lnc-ARF6-3的表達變化最明顯，為對照組的（26.8±5.0）%。lnc-BCAS2-1、lnc-LYZ-2和lnc-EIF2AK4-7在3種細胞株均表達上調(diào)，lnc-BCAS2-1的表達變化最明顯，為對照組的2.85±0.23倍（封三彩圖2）。

2.4 差異表達lncRNAs與mRNAs的共表達分析將差異表達的lncRNAs與mRNAs進行共表達分析，共有19個mRNAs在3種細胞株種具有一致的表達變化。結(jié)果顯示lnc-BCAS2-1、lnc-USP9X-3、lnc-LYZ-2和lnc-C14orf135-3與FUBP1具有共表達網(wǎng)絡(luò)（封三彩圖3）。

表1 FUBP1誘導的lncRNAs差異表達 個

3 討論

原發(fā)性肝癌是全球常見的惡性腫瘤，其中肝細胞癌是肝癌最常見的病理組織學類型，約占肝癌的90%以上[7]。目前的研究表明，肝癌的發(fā)生是個多因素多步驟的長期而復雜的過程，致癌因素和肝臟各機制之間相互作用最終導致肝癌發(fā)生，但其具體調(diào)控機制目前尚無完全闡明[8-9]。本研究以目前研究熱點之一—lncRNAs為目標，通過芯片的方法檢測了受FUBP1誘導的lncRNAs，旨在為深入理解lncRNA在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用及調(diào)控機制，為肝癌的診斷治療及預(yù)后提供新的方法和研究方向。

FUBP1是近期發(fā)現(xiàn)的一種DNA結(jié)合蛋白，通過與遠端上游元件FUSE結(jié)合調(diào)控c-myc基因轉(zhuǎn)錄表達，影響其介導的細胞生長、增殖、分化及凋亡，進而導致多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展。從分子結(jié)構(gòu)分析，F(xiàn)UBP1是由氨基酸末端結(jié)構(gòu)域、含有4個KH基序的中央結(jié)構(gòu)域及羧基末端結(jié)構(gòu)域三部分構(gòu)成，三個高度保守結(jié)構(gòu)域是由可變的連接區(qū)域連接。其中通過KH結(jié)構(gòu)域與配體位點的結(jié)合而起到對c-myc的調(diào)控作用[2,10]。肝癌細胞中過表達FUBP1引起差異表達的lncRNA可能也與c-myc的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用密切相關(guān)。

目前研究發(fā)現(xiàn)FUBP1在肝中分化及低分化細胞中均過表達，Western blot證實了肝癌組織中c-myc水平也同時升高，表明肝細胞癌形成過程中，F(xiàn)UBP1上調(diào)是引起c-myc表達增加的原因之一[11-12]。深入研究發(fā)現(xiàn)FUBP1主要誘導腫瘤細胞增殖，而FUBP2主要維持不同肝癌細胞系的擴散，且降低FUBP2水平會使FUBP1表達增加。同時肝癌組織中FUBP1的表達與stathmin的表達相關(guān)，F(xiàn)UBP1通過stathmin在肝細胞癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了一定的作用[3-4]。本研究的結(jié)果提示FUBP1對肝癌發(fā)生發(fā)展的作用也可能是由其誘導的lncRNA差異表達實現(xiàn)的。

IncRNAs與肝癌發(fā)生發(fā)展的研究是肝癌發(fā)病機制研究的當前熱點之一[13]。在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中，肝癌細胞中非編碼RNA的表達出現(xiàn)異常，并與癌細胞自噬密切相關(guān)[14-15]。多項研究結(jié)果說明lncRNA在肝癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[16-18]。本研究以受FUBP1誘導表達的lncRNA為方向，發(fā)現(xiàn)了12個在不同肝癌細胞株中具有一致表達變化的12個 lncRNAs，深入研究這些 FUBP1及這些lncRNAs對肝癌發(fā)生發(fā)展的調(diào)控作用和分子機制對肝癌的診斷和防治都具有重要的意義。

lncRNA在肝癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，但其對病理過程的調(diào)控機制目前尚未闡明。Wang等[19]發(fā)現(xiàn)lincGET與FUBP1形成RNA-蛋白復合物，促進長末端重復序列的順式調(diào)節(jié)活性，并通過下調(diào)FUBP1蛋白水平，抑制RNA的可變剪切。Guo等[20]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA PVT1的表達水平與FUBP1、cmyc的水平明顯相關(guān)，提示其可能受到 FUBP1/cmyc的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。Lnc-BCAS2-1基因坐落于人的1號染色體上，全長206 bp，但其作用和分子機制都尚未報道。筆者研究發(fā)現(xiàn) FUBP1過表達后 lnc-BCAS2-1的表達變化最明顯，并與其有共表達網(wǎng)絡(luò)，提示其可能參與FUBP1調(diào)控肝癌發(fā)生的作用網(wǎng)絡(luò)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了不同類型的肝癌細胞株中過表達的FUBP1，利用芯片技術(shù)檢測了差異表達的 lncRNAs，篩選了可能受 FUBP1調(diào)控的lncRNAs，并分析了lncRNAs與mRNA的共表達網(wǎng)絡(luò)。研究結(jié)果提示FUBP1-lncRNAs的表達網(wǎng)絡(luò)可能與肝癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，深入探索其調(diào)控機制將為肝癌靶向治療研究提供新的方向。

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