楊 玲 ，歐陽富龍 ，袁旭鵬 ，李 佳 ，趙玉蓉 ，賀建華 *

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙 410128；2.湖南鑫廣安農(nóng)牧股份有限公司，湖南長沙 410128；3.湖南畜禽安全生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南長沙 410128；4.廣東大澤農(nóng)生物科技股份有限公司，廣東珠海 519031）

在畜禽養(yǎng)殖中濫用抗生素會導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性增加，動物產(chǎn)品中抗生素殘留以及環(huán)境、正常微生物群落的不平衡等諸多副作用（董曉麗等，2013）。益生菌制劑是目前使用最普遍的一種飼用抗生素替代品，益生菌是定植于動物腸道和生殖系統(tǒng)內(nèi)，能夠產(chǎn)生確切健康功效的活性有益微生物的總稱，在動物體內(nèi)發(fā)揮著極其重要的作用 （高侃，2013）。其中丁酸梭菌具有益生菌制劑所具有的特征及功能，但又有其特有的特征與功能，能夠很好的抑制有害菌的生長，分泌淀粉酶、糖苷酶及降解飼料的果膠酶和葡聚糖酶，在消化道中幫助其成為消化道優(yōu)勢菌群，對機(jī)體產(chǎn)生各種益生作用，具有廣闊的應(yīng)用前景 （謝麗靜等，2017；易中華等，2012）。曹廣添等（2012）在體外將丁酸梭菌分別與大腸桿菌、沙門氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌按不同的比例混合后進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其對大腸桿菌、沙門氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等致病菌有明顯的抑制作用，對乳酸桿菌和雙歧桿菌等有益菌的生長具有一定的促進(jìn)作用。肖宏德等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，用復(fù)合益生菌制劑部分或全部替代斷奶仔豬飼糧中的抗生素，可以改善仔豬的生長性能，顯著降低仔豬的腹瀉率，但很少有關(guān)丁酸梭菌等復(fù)合而成的益生菌替代抗生素的效果研究。本試驗(yàn)選用分離鑒定的具有良好安全性能的丁酸梭菌等益生菌制成的復(fù)合益生菌制劑，研究其替代抗生素對斷奶仔豬生長性能、糞便微生物和血清生化指標(biāo)的影響，旨在為該類復(fù)合益生菌制劑作為抗生素替代品在斷奶仔豬的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計 試驗(yàn)選取日齡基本一致、體重（8.5±0.5）kg、經(jīng)過免疫的健康PIC斷奶仔豬224頭，隨機(jī)分為4組，每組4個重復(fù)，每個重復(fù)14頭豬，A組為對照組，飼喂無抗飼糧（不添加任何抗生素和具有抗菌功能的產(chǎn)品）；B組為0%替代組（抗生素組），即在對照組的基礎(chǔ)上添加抗生素（金霉素75 mg/kg+桿菌肽鋅40 mg/kg+吉他霉素50 mg/kg）；C組為50%替代組，即無抗飼糧+減半抗生素 （金霉素37.5 mg/kg+桿菌肽鋅20 mg/kg+吉他霉素25 mg/kg）+復(fù)合益生菌0.75 kg；D組為100%替代組，即無抗飼糧+復(fù)合益生菌1 kg。試驗(yàn)預(yù)飼期4 d，正式期25 d。試驗(yàn)豬自由采食，充足飲水，按正常免疫程序進(jìn)行免疫接種。試驗(yàn)飼糧按照NRC中10～20 kg生長豬的營養(yǎng)需要配制，基礎(chǔ)試驗(yàn)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.2 試驗(yàn)材料 本試驗(yàn)所用復(fù)合益生菌制劑，包含丁酸梭菌（≥5×108cfu/g）、地衣芽孢桿菌（≥1.5×1010cfu/g）、枯草芽孢桿菌（≥1×1010cfu/g）、嗜酸乳桿菌（≥1×108cfu/g）。試驗(yàn)動物由鑫廣安鵬揚(yáng)原種豬場提供健康PIC斷奶仔豬，飼養(yǎng)試驗(yàn)于湘潭鵬揚(yáng)原種豬場進(jìn)行。

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 生長性能 每天記錄仔豬采食量及腹瀉率，試驗(yàn)前后對斷奶仔進(jìn)行稱重并計算平均日增重、平均采食量、平均料肉比以及腹瀉率。試驗(yàn)中出現(xiàn)死亡情況，按死淘豬處理方式處理。

腹瀉率=總腹瀉頭次數(shù)/試驗(yàn)天數(shù)/試驗(yàn)豬數(shù)。

1.3.2 糞便微生物 試驗(yàn)第5、15、25天在每個重復(fù)中分別隨機(jī)收取3頭小豬的糞便進(jìn)行微生物的檢測，微生物檢測主要檢測大腸桿菌、沙門氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌，糞樣采取方法：在規(guī)定的時間里分別從處理組的每個平行中的不同地點(diǎn)采取部分糞便，糞樣放入裝有冰塊的保溫盒里迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，然后將處理組所有平行中采取的糞樣混合均勻成一個樣品進(jìn)行待檢。所有樣品在采樣后48 h內(nèi)進(jìn)行微生物培養(yǎng)測定。大腸桿菌用麥康凱培養(yǎng)基，沙門氏菌用亞硫酸鉍（BS）瓊脂培養(yǎng)基，產(chǎn)氣莢膜梭菌用胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸（TSC）瓊脂培養(yǎng)基。

微生物分析在湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤與肥力研究所完成，將對照組和試驗(yàn)組的冷藏保存糞樣品取出，每份糞樣取3 g加入27 mL無菌水，置于25℃、180 r/min的搖床中振蕩30 min，作為10-1稀釋液，然后在無菌條件下從10-1稀釋液取1 mL加入9 mL無菌水，制得10-2稀釋液，以此類推制成10-3、10-4、10-5稀釋液。在超凈工作臺內(nèi)酒精燈旁，取 10-4、10-5稀釋液各1 mL，分別加到滅菌平皿內(nèi)，平皿內(nèi)倒入適量溫?zé)崤囵B(yǎng)基混合均勻，每個稀釋度作三個平行。先正置放15～20 min，然后倒置于37℃恒溫箱培養(yǎng)，24 h后進(jìn)行菌落計數(shù)。

每克豬糞的菌落數(shù)/g＝同一稀釋度3次重復(fù)的菌落平均數(shù)×稀釋度；

以上操作均嚴(yán)格按試劑說明書嚴(yán)格執(zhí)行。

1.3.3 血液生化指標(biāo) 于試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天，每個重復(fù)隨機(jī)選取 1頭試驗(yàn)豬前腔靜脈采血 10 mL，靜置2 h，采用臺式自動平衡離心機(jī)KC-50X，轉(zhuǎn)速為 3000 r/min，離心 10 min，分離血清，取上清液，-20℃保存?zhèn)溆?。試?yàn)采用全自動生化分析儀 BS-400 測定血清總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、尿素氮（UREA）、堿性磷酸酶（ALP）活性和血清免疫球蛋白 G（IgG）、免疫球蛋白 M（IgM）、補(bǔ)體C3的含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 先用Excel處理數(shù)據(jù)，再用SPSS19.0單因素方差分析，并用Duncan氏進(jìn)行多重比較，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著，P＞0.05為差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)合益生菌對斷奶仔豬生長性能的影響 由表2可知，各組斷奶仔豬生產(chǎn)性能無顯著差異（P＞0.05）。4組淘汰率以A組最高，分別比B、C、D組高出2.99、1.5倍及 2.9倍，但均無顯著差異 （P＞0.05）。D組腹瀉率與A組存在顯著差異 （P＜0.05），與B、C組存在差異趨勢。4組隨著復(fù)合益生菌的替代比例增加，腹瀉率呈線性降低（P=0.04）。

表2 復(fù)合益生菌對斷奶仔豬生長性能的影響

2.2 復(fù)合益生菌對斷奶仔豬血液生化指標(biāo)的影響 由表 3可知，A組ALP高于其他三組，D組TP低于其他三組，但兩者組間差異均未達(dá)到顯著水平 （P＞ 0.05）。 其他血清生化指標(biāo)，ALB、C3、IgM、IgG不同組間差異不顯著 （P＞0.05），D組UREA與其他組存在顯著差異（P＜0.05），其比最低組C組高出61.09%。

表3 復(fù)合益生菌對斷奶仔豬血液生化指標(biāo)的影響

2.3 復(fù)合益生菌對斷奶仔豬糞便微生物的影響由表4可知，在試驗(yàn)第5、15、25天，各組糞便中大腸桿菌數(shù)、沙門氏菌數(shù)和產(chǎn)氣莢膜梭菌均存在極顯著差異 （P＜0.01）。在試驗(yàn)第15天左右時，B、C、D組的大腸桿菌分別比無抗組降低82.37%、87.48%、52.56%（P ＜ 0.01）；C 組沙門氏菌分別比無抗組降低 70.63%、53.15%（P＜0.01）；試驗(yàn)第25天，A組大腸桿菌數(shù)量仍與試驗(yàn)處理組有顯著差異（P ＜ 0.01），分別比 B、C、D組高出 23.68%、25.3%、11.4%；B、C、D 組沙門氏菌分別比A組降低42.53%、92.42%、79.11%（P＜0.01），產(chǎn)氣莢膜梭菌比無抗組降低66.10%、94.29%、77.64%（P ＜ 0.01）。

表4 復(fù)合益生菌對斷奶仔豬糞便微生物菌群的影響

同時，除A組的產(chǎn)氣莢膜梭菌外無顯著差異外（P＞0.05），4處理組大腸桿菌數(shù)隨著試驗(yàn)周期的推移而變動，差異極顯著（P＜0.01）且變化趨勢不一。在第5、15天及25天時，A組的大腸桿菌數(shù)和沙門氏菌數(shù)、B組的大腸桿菌、沙門氏菌以及產(chǎn)氣莢膜梭菌、C組的大腸桿菌均呈先上升后下降但總體下降的趨勢；而C、D組的沙門氏菌、產(chǎn)期莢膜梭菌以及D組的大腸桿菌則均隨時間的推移而持續(xù)下降，且差異極顯著（P＜0.01）。

3 討論

3.1 復(fù)合益生菌對斷奶仔豬生長性能及腹瀉率的影響 近年來在畜禽生產(chǎn)上，復(fù)合益生菌在替代抗生素方面得到了廣泛的實(shí)踐與應(yīng)用，特別是丁酸梭菌的應(yīng)用效果顯著（華均超等，2011），其提高生長性能的作用類似于抗生素所具有的抑制致病菌繁殖生長的作用。肖雪梅等（2013）發(fā)現(xiàn)，在斷奶仔豬的日糧中添加丁酸梭菌可以提高仔豬的日增重，增加采食量，降低腹瀉率。Hooper等（2012）和Tremaroli等（2012）研究表明，復(fù)合益生菌進(jìn)入腸道后，各種益生菌與腸道微生物之間可以產(chǎn)生協(xié)同互補(bǔ)作用，調(diào)節(jié)豬的腸道菌群，促進(jìn)豬的生長。Liao等（2015）分別用添加不同濃度的丁酸梭菌日糧飼喂肉雞，可以改善肉雞的生長性能，結(jié)果表明其促生長的機(jī)制是通過一個健康的微生態(tài)環(huán)境，增加消化酶活性和短鏈脂肪酸的濃度，可以有效替代抗生素。本研究以丁酸梭菌復(fù)合益生菌替代飼糧中的抗生素，生長性能結(jié)果顯示，飼糧中抗生素被復(fù)合益生菌替代，均能達(dá)到與抗生素持平的促生長效果，且完全添加丁酸梭菌復(fù)合益生菌的促生長效果有超過抗生素的趨勢。復(fù)合益生菌中的丁酸梭菌在代謝過程中可以產(chǎn)生淀粉酶、葉酸、B族維生素等多種維生素，這些益生物質(zhì)能夠維護(hù)動物腸道健康，提高動物生長性能。

丁酸梭菌在代謝過程中會產(chǎn)生丁酸梭菌素等抗菌物質(zhì)，丁酸梭菌素能抑制和殺滅某些梭狀芽孢桿菌，具有一定的殺菌作用，改善腸道菌群紊亂，增強(qiáng)腸道屏障功能，降低腹瀉 （桂國弘，2016）。Hayakawa等（2016）研究表明，由 STa+ETEC 感染引起的斷奶后腹瀉可能由小腸中的IgA分泌誘導(dǎo)，通過添加一定量的益生菌制劑可以改善其在腸道上的拓?fù)洚惓?，降低腹瀉率。肖宏德等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，用復(fù)合益生菌制劑代替飼糧中的抗生素，可以達(dá)到降低腹瀉率、促生長的效果。凌欣華等（2016）研究報道，在斷奶仔豬飼糧中添加低濃度的復(fù)合丁酸梭菌制劑與添加高濃度的復(fù)合丁酸梭菌制劑相比，其腹瀉率下降幅度大，說明適宜的丁酸梭菌制劑添加量對預(yù)防仔豬腹瀉有明顯的效果。本試驗(yàn)結(jié)果表明，丁酸梭菌復(fù)合益生菌，能夠顯著降低腹瀉率，防控仔豬腹瀉的效果明顯優(yōu)于其他組，可以替代抗生素的使用。丁酸梭菌的代謝產(chǎn)物丁酸可以降低腸道pH，抑制有害菌的生長，對畜禽腸炎引起的腹瀉有一定的抵御作用。復(fù)合益生菌可以促進(jìn)仔豬腸道中有益菌群的繁殖，建立良性的微生態(tài)環(huán)境，可以減少腹瀉次數(shù)，降低腹瀉率。

3.2 復(fù)合益生菌對斷奶仔豬糞便微生物的影響復(fù)合益生菌可改善腸道微生態(tài)環(huán)境，抑制有害微生物的增殖，利于有益微生物的定植。丁酸梭菌在代謝過程中所產(chǎn)生的丁酸、乙酸等短鏈脂肪酸可以修復(fù)腸道黏膜，降低腸道pH，較低的腸道pH適合益生菌的生長，抑制有害菌的附著（張曉陽，2012）。 Servin 等（2004）研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合益生菌可以降低腸道pH，抑制大腸桿菌、沙門氏菌等的生長。腸道微生物菌群組成一個動態(tài)微生態(tài)平衡系統(tǒng)。當(dāng)該系統(tǒng)被破壞時，外界的致病菌就會侵入體內(nèi)，與體內(nèi)的有益菌競爭營養(yǎng)成分，有益菌則通過分泌抗菌物質(zhì)，增加腸黏膜分泌，優(yōu)化腸道環(huán)境（韓金鳳等，2017）。 李玉鵬等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，在飼糧中添加丁酸梭菌可以改善斷奶仔豬的腸黏膜屏障功能，顯著降低大腸桿菌的數(shù)量，使益生菌成為優(yōu)勢菌群。許多研究表明，畜禽糞便普遍存在抗生素耐藥細(xì)菌（Yang等，2014）。一方面因?yàn)榧S便中殘留的抗生素對微生物群落進(jìn)行篩選，多數(shù)的敏感菌株被殺滅，耐藥菌株大量繁殖，使細(xì)菌對某種藥物的耐藥率不斷升高，產(chǎn)生耐藥性；另一方面，動物在飼喂抗生素的過程中，腸道微生物在抗生素的選擇壓力下突變產(chǎn)生了耐藥性（Holger等，2011）。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在整個試驗(yàn)期，試驗(yàn)處理對各組均有顯著影響，但到了后期，添加了抗生素組微生物有上升的趨勢，與上述結(jié)論一致。添加復(fù)合益生菌，其大腸桿菌、沙門氏菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌的數(shù)量顯著減少，其抑制致病菌的生長增殖，維護(hù)腸道生態(tài)平衡的效果更加明顯，避免細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，可替代抗生素的使用。丁酸梭菌在生長后期能夠產(chǎn)生芽孢，除了可以抵抗高溫外，對人工胃、腸液也具有較好的耐受能力，對大多數(shù)抗生素具有很強(qiáng)的耐藥性（李玉鵬等，2017）。范磊等（2014）發(fā)現(xiàn)，在肉雞飼糧中添加1%丁酸梭菌，可以顯著減少盲腸內(nèi)大腸桿菌等有害菌的數(shù)量，促進(jìn)腸道內(nèi)有益菌的增殖。Hossain等（2016）用丁酸梭菌等制成的復(fù)合益生菌飼喂肉雞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與其他處理組相比，添加復(fù)合益生菌能夠顯著降低大腸桿菌和梭狀芽孢桿菌的數(shù)量，飼喂益生菌對致病菌的抑制效果比飼喂抗生素好。

3.3 復(fù)合益生菌對斷奶仔豬血液生化指標(biāo)的影響復(fù)合益生菌在動物體內(nèi)無污染或殘留，其不會導(dǎo)致耐藥性，可降低飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，增強(qiáng)機(jī)體免疫力（Zhou等，2015）。動物機(jī)體血液中的許多生化參數(shù)受機(jī)體內(nèi)外環(huán)境的影響，通過血清生化指標(biāo)的變化可以體現(xiàn)出動物機(jī)體營養(yǎng)物質(zhì)的變化或者機(jī)體病理變化（Wang等，2009）。丁酸梭菌的產(chǎn)物丁酸可以刺激腸道黏膜免疫活性、調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞因子的免疫調(diào)節(jié)作用，促進(jìn)機(jī)體的免疫（張曉陽等，2012）。 Yang 等（2012）研究表明，飼糧中添加2×107cfu/kg或3×107cfu/kg丁酸梭菌可提高肉仔雞血清中的IgM、IgG、IgA，改善肉仔雞血清生化指標(biāo)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，添加丁酸梭菌復(fù)合益生菌對機(jī)體的免疫指標(biāo)并無顯著影響，造成差異不顯著的原因可能是丁酸梭菌的添加量還不足以表現(xiàn)出可以改善機(jī)體血液生化指標(biāo)的作用；也有可能是因?yàn)槎∷崴缶鷽]能在豬的腸道中定植，未能充分發(fā)揮其應(yīng)有的作用，另外，其他原因如益生菌的菌株、制備技術(shù)、飲食結(jié)構(gòu)、自身的健康狀況和飼養(yǎng)管理?xiàng)l件等也可能造成試驗(yàn)結(jié)果不顯著。尿素（UREA）是衡量動物體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝和氨基酸平衡的一個重要指標(biāo)，一般而言，血清UREA含量升高說明蛋白質(zhì)的沉積率下降。賈聰慧等（2016）研究表明，在肉雞飼糧中添加丁酸梭菌，可在結(jié)腸中形成化學(xué)屏障，減少腸道有害氨和胺的產(chǎn)生，血氨含量顯著降低。郭軍蕊等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，蛋雞飼糧中添加枯草芽孢桿菌提高了蛋白質(zhì)的沉積，減少了UREA在腎臟的積累，顯著降低了血清UREA含量。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，在斷奶仔豬的飼糧中添加適宜的復(fù)合益生菌，可以提高動物體內(nèi)蛋白質(zhì)的吸收利用，促進(jìn)生長。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，丁酸梭菌的復(fù)合益生菌替代50%的抗生素能有效降低料肉比，減少腸道有害菌數(shù)量，但可能增加腎負(fù)擔(dān)，降低蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化。另外，利用丁酸梭菌的復(fù)合益生菌100%替代抗生素，仔豬生長性能與抗生素組效果相當(dāng)，而且能降低腹瀉率。

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