張博，肖世娣，李藝凡，趙璐，薛逸軒，王菁，張惠玲，*

（1.寧夏大學(xué)寧夏食品微生物應(yīng)用技術(shù)與安全控制重點實驗室，寧夏銀川750021；2.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川750021）

馬鈴薯是我國當(dāng)前最具發(fā)展前景的高產(chǎn)糧食作物之一[1]。國家提倡加大馬鈴薯深加工產(chǎn)品，提高附加值[2-3]。寧夏是我國重要的馬鈴薯生產(chǎn)地之一，馬鈴薯產(chǎn)業(yè)是寧夏優(yōu)勢特色農(nóng)產(chǎn)品加工產(chǎn)業(yè)中的重點支持產(chǎn)業(yè)，寧夏馬鈴薯具有品種優(yōu)良、加工風(fēng)味好、淀粉含量高等優(yōu)勢[4-7]。開展馬鈴薯深加工研究對帶動寧夏馬鈴薯產(chǎn)業(yè)具有重要意義。

本文以寧夏固原產(chǎn)地的馬鈴薯為主要原料開發(fā)馬鈴薯格瓦斯產(chǎn)品，并對其發(fā)酵工藝進(jìn)行研究，為寧夏馬鈴薯資源深加工提供一條新思路。

1 材料和方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料

青薯9號馬鈴薯：寧夏固原；Vinozym牌果膠酶（7500PGNU/g）、淀粉酶（α-淀粉酶，活性酶蛋白＜5%）、糖化酶（活性酶蛋白20%～30%）：諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司；纖維素酶（酶活≥7000 U/g）：寧夏夏盛實業(yè)集團有限公司；蛋白酶（酸性蛋白酶，活性50000 U/g以上）：Beijing Solarbio Science&Technology Co.，Ltd.；啤酒酵母（Pop）：法國諾盟集團有限公司；乳酸菌（Lactobacillusbulgaricus，Streptococcusthermophilus）：北京川秀科技有限公司1.0L型。

1.1.2 儀器設(shè)備

HHS型電熱恒溫水浴鍋：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；LRH-150B型恒溫培養(yǎng)箱：廣東泰宏君科學(xué)儀器股份有限公司；RZ-988T型打漿機：深圳五聯(lián)通達(dá)科技有限公司；TL90T型手持折光儀：上海天壘儀器儀表有限公司；雷諾PHSJ-3F型實驗室pH計、INESAL5型紫外可見光檢測器：上海儀電分析儀器有限公司；AL204型分析天平：梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司；錐形瓶；25 mL密度瓶；20 mL頂空瓶。

1.2 檢測方法

酒精的測量：密度瓶法（GB/T 4928-2008《啤酒分析方法》）。

可溶性固形物的測量：折射儀法測量（NY/T2637-2014《水果和蔬菜可溶性固形物含量的測定折射儀法》）。

pH值測量：pH計測定（GB 5009.237-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品pH值的測定》）。

菌落總數(shù)的測定：平板計數(shù)法（GB 4789.2-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》）。

大腸菌群的測定：MPN計數(shù)法（GB 4789.3-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗大腸菌群計數(shù)》）。

吸光度值（Abs）測量：紫外可見光檢測器于450 nm波長下，以蒸餾水做參比，測定樣品的吸光度值。

酸度（以乳酸計）測量采用酚酞指示劑法：吸取5 mL樣液，加入50 mL煮沸并冷卻至室溫的蒸餾水，加入2～3滴酚酞指示劑，以0.1 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至微紅色，30 s不褪色為終點，記下消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù)A，計算酸度（以乳酸計）[8]。

酸度（以乳酸計）/%=[（0.1×A×0.09）/5]×100

還原糖測定：DNS法（3，5-二硝基水楊酸法）[9]。

1.3 感官品評方法

感官評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory scoring criteria

2 方法

2.1 工藝流程

2.2 操作要點

2.2.1 原料預(yù)處理

2.2.1.1 料水比的確定

選取無霉?fàn)€、無發(fā)芽、無病蟲害的鮮馬鈴薯去皮切丁，在含有0.2%的檸檬酸水溶液中95℃熱燙5 min護(hù)色后取出。分別采用 1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1 ∶6（g/mL）的料水比[10-11]制汁，并煮沸15 min～20 min，分別取樣測定可溶性固形物含量及還原糖含量，確定最佳料水比。

2.2.1.2 酶最適添加量的確定

在1∶4（g/mL）料水比的馬鈴薯汁的條件下，分5組分別設(shè)計添加不同量[10]的淀粉酶、糖化酶、果膠酶、蛋白酶、纖維素酶的試驗，測定還原糖含量或吸光度值以確定酶的最適添加量。

2.2.1.3 馬鈴薯汁成分調(diào)整

根據(jù)產(chǎn)品的要求，酒精度達(dá)到0.8%vol，殘?zhí)沁_(dá)到192 mg/L；因此將按照2.2.1.2中的酶解條件處理好的馬鈴薯汁的糖度調(diào)整為300 mg/L；過濾，并用食用級檸檬酸調(diào)整pH值為5.3[12]，然后采用121℃，高壓蒸氣滅菌20 min，待冷。

2.2.2 發(fā)酵

取冷卻后的馬鈴薯汁接種混合菌0.3%，在28℃下發(fā)酵，采取間歇式密閉發(fā)酵，使發(fā)酵液壓力保持在30 kPa，保證CO2含量大于0.26%。以殘?zhí)沁_(dá)到192 mg/L，酒精度達(dá)到0.8%vol左右時為終止發(fā)酵條件，巴氏滅菌終止發(fā)酵。

取以上發(fā)酵好的馬鈴薯格瓦斯，在30 kPa～40 kPa[12]的壓力下，對發(fā)酵液進(jìn)行過濾并灌裝，然后立即進(jìn)行巴氏殺菌。

2.3 發(fā)酵條件的單因素試驗

2.3.1 接種比例的確定

乳酸菌可以使馬鈴薯格瓦斯風(fēng)味更好，香氣濃郁[13]，為了增加馬鈴薯格瓦斯風(fēng)味，采取酵母菌和乳酸菌混合發(fā)酵。采用1∶4的料水比，糖度為300 mg/L，pH值為5.3、接種量為0.3%，在28℃下發(fā)酵，制備馬鈴薯汁 5份，分別按照酵母菌和乳酸菌 1 ∶1、1 ∶1.5、1∶2、1 ∶2.5、1 ∶3 的質(zhì)量比接種混合菌[8，14-15]，當(dāng)達(dá)到終止發(fā)酵條件時終止發(fā)酵，測定酒精和乳酸含量，確定最佳比例。

2.3.2 混合菌接種量的確定

采用 1∶4（g/mL）的料水比，糖度為 300 mg/L，pH 值為5.3的條件下，制備馬鈴薯汁5份，分別按照0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%[16]的接種量接種質(zhì)量比為1∶2的酵母菌和乳酸菌，在28℃的溫度下發(fā)酵，當(dāng)達(dá)到終止發(fā)酵條件時終止發(fā)酵，測定酒精含量、乳酸含量和感官品質(zhì)。

2.3.3 發(fā)酵溫度的確定

在1∶4（g/mL）的料水比下制備馬鈴薯汁5份，糖度為300 mg/L，pH值為5.3，滅菌冷卻后按照酵母菌和乳酸菌1∶2的質(zhì)量比接種，接種量0.5%進(jìn)行發(fā)酵，分別在24、27、30、33、36 ℃的溫度[17]下發(fā)酵。當(dāng)達(dá)到終止發(fā)酵條件時終止發(fā)酵，測定發(fā)酵液的酒精含量、乳酸含量、還原糖含量和感官品質(zhì)。

2.3.4 發(fā)酵時間的確定

在1∶4的料水比糖度為300 mg/L，pH值為5.3，滅菌冷卻后按照酵母菌和乳酸菌1∶2的質(zhì)量比接種，接種量 0.5%，28 ℃下進(jìn)行發(fā)酵，在 0、12、16、20、24、28、32、36 h 時[18]取樣測定，當(dāng)酒精度達(dá)到 0.8%vol左右，殘?zhí)沁_(dá)到192 mg/L時，確定為最佳終止發(fā)酵時間。

2.4 發(fā)酵條件優(yōu)化試驗

在以上單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上綜合分析，設(shè)計發(fā)酵菌種接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間和添加比例，四因素三水平的正交試驗L9（34），進(jìn)一步確定最佳發(fā)酵工藝參數(shù)。綜合以上單因素試驗的試驗結(jié)果進(jìn)行分析，正交試驗因素水平表見表2。

表2 正交試驗因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal test

3 結(jié)果與分析

3.1 原料預(yù)處理條件確定

3.1.1 料水比的確定

料水比對馬鈴薯汁的影響見表3。

表3 料水比對馬鈴薯汁的影響Table 3 Effect of ratio of material to water on potato juice the

由表3看出，料水比為1∶4（g/mL）時對馬鈴薯汁的可溶性固形物和還原糖含量適中，而且容易過濾。

3.1.2 酶最適添加量確定

3.1.2.1 淀粉酶

不同淀粉酶添加量下馬鈴薯汁的顯色反應(yīng)見表4。

表4 不同淀粉酶添加量下馬鈴薯汁的顯色反應(yīng)Table 4 Color reaction of potato juice with different amylase adding amount

當(dāng)?shù)矸勖傅奶砑恿吭?.10%時，馬鈴薯汁的淀粉顯色反應(yīng)出現(xiàn)碘液本身的淺棕色，說明此時馬鈴薯汁中淀粉已全部被淀粉酶分解，故淀粉酶的添加量應(yīng)為0.075%。

3.1.2.2 糖化酶

不同糖化酶添加量對馬鈴薯汁還原糖的影響見表5，不同糖化酶添加量對馬鈴薯汁可溶性固形物的影響見圖1。

表5 不同糖化酶添加量對馬鈴薯汁還原糖的影響Table 5 Effects of different glucoamylase adding amount on reducing sugar in potato juice

圖1 不同糖化酶添加量對馬鈴薯汁可溶性固形物的影響Fig.1 Effect of different glucoamylase adding amount on soluble solids content in potato juice

綜合表5和圖1可知，糖化酶添加量從0.10%起還原糖含量為290 mg/L且不再發(fā)生變化，故糖化酶添加量選擇0.10%。

3.1.2.3 果膠酶

果膠酶的添加量對馬鈴薯汁吸光度值的影響見圖2。

由圖2看出，隨著果膠酶添加量的增加，在60 mg/L時吸光度值趨于平穩(wěn)，因此選擇60 mg/L為果膠酶的最適添加量。

3.1.2.4 蛋白酶

蛋白酶的添加量對馬鈴薯汁吸光度值的影響見圖3。

由圖3看出，隨著蛋白酶添加量的增加，曲線在蛋白酶添加量為110 mg/L時出現(xiàn)拐點后趨于平穩(wěn)，因此選擇110 mg/L為蛋白酶的最適添加量。

圖2 果膠酶的添加量對馬鈴薯汁吸光度值的影響Fig.2 Effect of pectinase adding amount on absorbance value of potato juice

圖3 蛋白酶的添加量對馬鈴薯汁吸光度值的影響Fig.3 Effect of protease adding amount on absorbance value of potato juice

3.1.2.5 纖維素酶

纖維素酶的添加量對馬鈴薯汁吸光度值的影響見圖4。

圖4 纖維素酶的添加量對馬鈴薯汁吸光度值的影響Fig.4 Effect of cellulase adding amount on absorbance value of potato juice

由圖4看出，當(dāng)纖維素酶添加量在50 mg/L時，吸光度值達(dá)到最低，再增大酶的添加量，使過多的纖維素酶顆粒存在，出現(xiàn)吸光度升高的現(xiàn)象，表明吸光度值在最低點時纖維素酶添加量最佳。

3.2 單因素試驗結(jié)果

3.2.1 最佳接種比例

接種比例對馬鈴薯格瓦斯發(fā)酵的影響見表6。

表6 接種比例對馬鈴薯格瓦斯發(fā)酵的影響Table 6 Effect of inoculation proportion on potato kvass fermentation

按照產(chǎn)品要求，當(dāng)殘?zhí)沁_(dá)到192 mg/L時終止發(fā)酵。由表6看出，酵母菌和乳酸菌接種比例在1∶2時，乙醇和乳酸含量適中，口味協(xié)調(diào)，酸甜適中，香氣柔和，殺口感好。

3.2.2 最佳接種量

菌種接種量對馬鈴薯格瓦斯發(fā)酵的影響見表7。

表7 菌種接種量對馬鈴薯格瓦斯發(fā)酵的影響Table 7 Effect of inoculation amount of bacteria on potato kvass fermentation

從表7可以看出，發(fā)酵終止時，接種量在0.3%時，乳酸、酒精、殘?zhí)呛窟_(dá)到了一個協(xié)調(diào)值，香氣和口感都達(dá)到一個最佳平衡狀態(tài)，且具有較好的CO2殺口感。

3.2.3 最佳發(fā)酵溫度

發(fā)酵溫度對馬鈴薯格瓦斯發(fā)酵的影響見表8。

從表8可以看出，發(fā)酵溫度高時，有利于乳酸菌產(chǎn)生乳酸[19]；發(fā)酵溫度在27℃時有利于酵母產(chǎn)生乙醇，乳酸菌在此溫度下緩慢產(chǎn)生乳酸，當(dāng)達(dá)到發(fā)酵終止要求時，馬鈴薯格瓦斯酸甜適中，乙醇和乳酸含量合適，口感柔和且有殺口力。

表8 發(fā)酵溫度對馬鈴薯格瓦斯發(fā)酵的影響Table 8 Effect of fermentation temperature on potato kvass fermentation

3.2.4 最佳發(fā)酵時間

發(fā)酵時間對馬鈴薯格瓦斯發(fā)酵的影響見表9。

表9 發(fā)酵時間對馬鈴薯格瓦斯發(fā)酵的影響Table 9 Effect of fermentation time on potato kvass fermentation

當(dāng)發(fā)酵時間在16 h～20 h時，當(dāng)殘?zhí)沁_(dá)到192 mg/L，酒精也達(dá)到產(chǎn)品要求，而且整體感官評分較高，且與產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)中要求較為接近，確定為最佳發(fā)酵時間。

3.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果見表10、表11、表12。

以上4個指標(biāo)單獨分析出來的優(yōu)化水平不一致，對于因素A，其對還原糖含量和感官評分的影響都排在第二位，且此時都取A1，故A因素取A1；對于因素B，其對酒精含量、乳酸含量和感官評分的影響都排第一位，且此時都取B1，故B因素取B1；對于因素C，其對還原糖含量排在第一位，且此時取C3，故C因素取C3；對于D因素，其對酒精含量的影響排第二位，此時取D1，其對乳酸含量的影響排在第二位，此時取D2。趙曉指出，從格瓦斯的感官整體接受度來看，酵母菌∶乳酸菌達(dá)到1∶2時，格瓦斯的整體接受度較高[15，20]。故D因素取D2。綜上所述，馬鈴薯格瓦斯發(fā)酵過程中的最優(yōu)條件為A1B1C3D2，即最佳菌種接種量為0.3%，最佳發(fā)酵溫度為26℃，最佳發(fā)酵時間為20 h，最佳菌種接種比例酵母∶乳酸菌為1∶2。

表10 發(fā)酵條件四因素三水平正交發(fā)酵條件對馬鈴薯格瓦斯發(fā)酵的影響驗結(jié)果分析Table 10 Orthogonal experimental results analysis of four factors and three levels of fermentation conditions

表11 因素主次順序Table 11 The order of the primary and secondary factors

表12 優(yōu)化水平組合Table 12 Optimize level combinations

3.4 產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)

3.4.1 理化指標(biāo)

理化指標(biāo)見表13。

表13 馬鈴薯格瓦斯理化指標(biāo)Table 13 Physical and chemical indexes of potato kvass

3.4.2 感官指標(biāo)

外觀：橙黃色，澄清透亮，無明顯的懸浮物、沉淀物；口感：入口清新爽口，酸甜適中，有殺口感；滋氣味：具有典型的馬鈴薯香及協(xié)調(diào)的發(fā)酵香。

3.4.3 微生物指標(biāo)

細(xì)菌總數(shù)≤53CFU/mL；大腸菌群≤3 MPN/100 mL；致病菌：未檢出。

4 結(jié)論

馬鈴薯格瓦斯的發(fā)酵最佳工藝參數(shù)為馬鈴薯制汁的料水比為1∶4（g/mL），淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、果膠酶、纖維素酶的最佳添加量分別為0.075%、0.10%、110 mg/L、60 mg/L、50 mg/L。發(fā)酵最適條件為：發(fā)酵菌種接種量為0.30%，其中酵母菌和乳酸菌接種量比例為1∶2，發(fā)酵溫度為26℃，發(fā)酵時間為20 h。發(fā)酵期間采取間歇式密閉發(fā)酵，使發(fā)酵液壓力保持在30 kPa，保證CO2含量大于0.26%。根據(jù)以上最佳工藝參數(shù)，獲得了口感協(xié)調(diào)的馬鈴薯格瓦斯產(chǎn)品。

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