胡 林，南良康，張 敏，許蘇童，楊了寒，李帥峰，王 凱，劉正飛，張淑君*(.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，農(nóng)業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070；.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070)

偽狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)是α皰疹病毒亞科的重要成員，病毒粒子由囊膜蛋白、二十面體衣殼蛋白和線性雙鏈DNA組成，具有嗜神經(jīng)性和潛伏感染的特點(diǎn)[1-2]。自然宿主有豬、羊和犬等。

細(xì)胞自噬可看作是一種特殊的細(xì)胞程序性死亡，以自噬體和自噬溶酶體的聚集為特征[3]。細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡過程均由細(xì)胞內(nèi)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)精確調(diào)節(jié)。其中，Bcl-2和Bcl-xL不僅能夠與BAX/BAK樣蛋白結(jié)合調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，也可以與高度保守的自噬相關(guān)蛋白Beclin1互作而調(diào)控細(xì)胞自噬[4-5]。此外，Bcl-2能負(fù)調(diào)控PI3K/AKT信號和正調(diào)控mTOR信號通路從而抑制細(xì)胞自噬[6]，JNK信號通路通過誘導(dǎo)Bcl-2多個位點(diǎn)(Thr69、Ser70和Ser87)的磷酸化同時調(diào)控細(xì)胞自噬和凋亡[7]。研究表明，Beclin1能被Caspases切割，切割后的Beclin1喪失誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的功能，但獲得促凋亡作用[8]。還原形式的HMGB1[9]、氧化形式的HMGB1[9]、ATG5[10]、被Caspase-3剪切的ATG4D[11]和Flice抑制蛋白[12]等都參與了細(xì)胞自噬或凋亡過程的調(diào)節(jié)。

細(xì)胞自噬是機(jī)體維持穩(wěn)態(tài)和參與宿主對病原體反應(yīng)的重要內(nèi)在機(jī)制。研究表明,豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)感染MARC145會引起細(xì)胞自噬和凋亡，當(dāng)自噬被抑制時病毒復(fù)制減弱，而凋亡被抑制時病毒復(fù)制加強(qiáng)[13]；PRRSV誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，并且抑制自噬體和溶酶體的融合，從而有利于自身的復(fù)制[14]。進(jìn)一步的研究結(jié)果表明，細(xì)胞自噬可以通過形成BAD/Beclin1復(fù)合物而推遲凋亡，促進(jìn)PRRSV復(fù)制[15]。人巨細(xì)胞病毒(HCMV)感染人胚肺成纖維細(xì)胞MRC5后，早期細(xì)胞自噬被激活，后期病毒抑制細(xì)胞自噬，病毒蛋白TRS1和IRS1能與Beclin1 互作調(diào)控細(xì)胞自噬，當(dāng)細(xì)胞自噬增強(qiáng)時有利于病毒復(fù)制，相反抑制細(xì)胞自噬可減少病毒感染[16]，此外，HCMV感染人胚胎成纖維細(xì)胞后可通過激活mTOR信號通路顯著抑制自噬體的形成，以阻止感染期間誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬的發(fā)生[17]。日本腦炎病毒(JEV)在病毒感染早期誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，并且將病毒粒子轉(zhuǎn)運(yùn)到自噬體用于病毒感染后續(xù)階段[18]?？谔阋卟《?FMDV)能誘導(dǎo)細(xì)胞自噬從而促進(jìn)自身的增殖[19]。細(xì)胞自噬可以降解細(xì)胞質(zhì)成分并對水皰性口炎病毒(VSV)起到直接的抗病毒作用，且該抗病毒反應(yīng)由PI3K/AKT信號通路控制[20]。單純皰疹病毒1型(HSV1)感染髓細(xì)胞BM-DCs可激活I(lǐng)FN基因誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，偽狂犬病病毒(PRV)感染BM-DCs同樣可以激活BM-DCs自噬[21]。

PRV宿主較多、病毒株易重組和變異等特點(diǎn)給有效預(yù)防病毒的傳播和根除該病帶來了困難。細(xì)胞自噬對抵抗病毒侵襲或促進(jìn)病毒增殖具有重要的調(diào)控作用，而其調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜。目前對人單皰疹病毒1型(HSV1)感染與細(xì)胞自噬相互作用機(jī)制的研究[22]較多，而對同樣屬于皰疹病毒科的PRV的相關(guān)研究較少。鑒于此，本研究以豬偽狂犬病毒(PRV)為對象，以宿主豬細(xì)胞PK-15為研究材料，研究PRV感染在宿主細(xì)胞自噬和凋亡中的作用，探討PRV感染過程中PRV誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬和凋亡水平變化以及調(diào)控的途徑，分析Beclin1與豬宿主凋亡家族基因的相互作用、PRV誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的可能性機(jī)制，以期闡明豬Beclin1基因在細(xì)胞自噬和凋亡中的調(diào)節(jié)作用，為相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 病毒與細(xì)胞

偽狂犬病毒鄂a株(PRV-Ea)由農(nóng)業(yè)微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室劉正飛老師提供。豬腎上皮細(xì)胞(porcine kidney-15 cell line，PK-15)為本實(shí)驗(yàn)室保存。PK-15細(xì)胞呈貼壁生長，為梭形上皮細(xì)胞系，細(xì)胞間連接緊密，生長迅速，培養(yǎng)于37 ℃，5% CO2條件下；細(xì)胞培養(yǎng)基為高糖DMEM，添加10%胎牛血清。

1.2 主要試劑與儀器

細(xì)胞裂解液RIPA、苯甲基磺酰氟PMSF、Cocktail、磷酸酶抑制劑、SDS-PAGE蛋白質(zhì)緩沖液(5×)和Protein A+G Agarose均購于碧云天生物技術(shù)公司。LC3A (NO4599P)、SQSTM1/P62(P0068)、Beclin1 (NO4122S)、Cleaved Caspase-9 (NO9509) 、Cleaved Caspase-8 (NO9496) 、Bcl-2 (NO4223) 和Bcl-xL (NO2764) 單克隆抗體購于CST公司。偽狂犬病病毒的衣殼蛋白抗體VP26由農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備和饋贈。細(xì)胞凋亡檢測試劑盒AnnexinV-FITC購于凱基生物(KGA106)。

CFX96實(shí)時熒光定量PCR儀購于BioRad公司。蛋白免疫印跡轉(zhuǎn)移電泳儀JY-ZY5購于北京君意華鑫科技有限公司。ImageQuant LAS 4000化學(xué)發(fā)光成像分析儀購于通用醫(yī)療集團(tuán)生命科學(xué)部。

1.3 熒光定量PCR

利用Thermo反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，最后保存在-20 ℃。利用合成好的cDNA進(jìn)行熒光定量PCR。在熒光定量PCR中，內(nèi)參基因常被用來作為數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化的對照，用來校正模板cDNA存在的數(shù)量差異。良好的內(nèi)參基因應(yīng)該在不同實(shí)驗(yàn)條件下或不同時間點(diǎn)上，在各個樣品中的表達(dá)都無差異，本試驗(yàn)選擇GAPDH作為內(nèi)參基因，定量引物及內(nèi)參基因序列見表1。引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司和擎科生物合成。

表1基因qPCR引物

Table1PrimersofgenesforqPCR

基因Gene引物名稱Primername引物序列(5′→3′)Primersequences退火溫度/℃Tm擴(kuò)增產(chǎn)物長度/bpSizeGAPDHF1GAAAGCCTGCCGGTGACTAA60274R1TGGAATTTGCCATGGGTGGABeclin1F1GGCGGCTCCTATTCCATCAA60108R1TGAGGACACCCAAGCAAGACBcl?2F1ATCAAGTGTTCCGCGTGACT60138R1GGGTACCAACAGCACCTCTCBcl?xLF1TGACCACCTAGAGCCTTGGA60174R1TTCCGACTGAAGAGCGAACC

利用熒光定量PCR儀反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后分析數(shù)據(jù)。每個PCR反應(yīng)設(shè)置3個重復(fù)，候選基因表達(dá)量按2-ΔΔCt計算方法對以上相關(guān)基因的表達(dá)水平進(jìn)行相對定量分析?；虮磉_(dá)量數(shù)據(jù)由SPSS 16.0軟件進(jìn)行方差和顯著性檢驗(yàn)并作圖。

1.4 細(xì)胞免疫共沉淀

蛋白樣品的準(zhǔn)備。對于100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中的貼壁細(xì)胞，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗滌一次，然后加入1 mL RIPA裂解細(xì)胞；去除非特異性結(jié)合。取0.2～1 mL蛋白樣品，加入約1 μg和免疫沉淀使用的IgG種屬相同的普通IgG和20 μL充分重懸的Protein A+G Agarose，4 ℃緩慢搖動0.5～2 h。2 500 r·min-1離心5 min，取上清液用于免疫沉淀試驗(yàn)；免疫沉淀。向上一步獲得的上清中加入0.2～2 μg用于免疫沉淀的第一抗體，4 ℃緩慢搖動過夜；再加入20 μL充分重懸的Protein A+G Agarose，4 ℃緩慢搖動1～3 h；2 500 r·min-1離心5 min，小心吸除上清；用PBS洗滌沉淀5次，加入20～40 μL 1×SDS-PAGE蛋白質(zhì)緩沖液重懸沉淀，瞬時高速離心，將樣品離心于管底。沸水處理5 min，用于SDS-PAGE電泳。

1.5 免疫印跡

按20 μg的蛋白上樣量進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，100 V恒壓轉(zhuǎn)膜1 h，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入“1.2”所列的單克隆抗體， β-actin單克隆抗體(1∶3 000)，4 ℃孵育過夜，洗膜后加入抗兔或抗鼠的HPR標(biāo)記二抗(1∶3 000)，室溫孵育2 h，洗膜后加入ECL顯色液，利用化學(xué)發(fā)光成像分析儀成像，并用ImageJ圖像分析軟件分析灰度值。

1.6 細(xì)胞凋亡檢測

收集細(xì)胞懸液，220 g離心后用含2%胎牛血清的1×PBS將細(xì)胞重懸，220 g離心10 min收集細(xì)胞，重復(fù)2次，每管中細(xì)胞量為5×105·mL-1；加500 μL Binding buffer 懸浮細(xì)胞；加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，室溫避光孵育5～15 min；在1 h 內(nèi)，進(jìn)行流式細(xì)胞儀的檢測激發(fā)波長Ex為488 nm；發(fā)射波長Em為530 nm的Annexin V-FITC綠色熒光通過FITC通道(FL1)檢測；PI紅色熒光通過PI通道(FL2或FL3)檢測，建議使用FL3；熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)：使用未經(jīng)處理的正常細(xì)胞，作為對照進(jìn)行熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)去除光譜重疊和設(shè)計十字門的位置；每次使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，必須使用未經(jīng)凋亡試劑處理的正常細(xì)胞進(jìn)行熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)，加入Annexin V-FITC單獨(dú)染色的正常細(xì)胞，加入PI染色的正常細(xì)胞與加入Annexin V-FITC和PI雙染的正常細(xì)胞作為對照進(jìn)行檢測。

1.7 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié) 果

2.1 PRV感染誘導(dǎo)LC3-Ⅱ表達(dá)上升、P62表達(dá)下降

細(xì)胞自噬過程中會伴隨著胞漿型LC3被酶切成LC3-Ⅰ，其與磷脂酰乙醇胺(PE)結(jié)合轉(zhuǎn)變?yōu)長C3-Ⅱ，因此LC3-Ⅱ表達(dá)水平的明顯增加是細(xì)胞自噬發(fā)生的標(biāo)志。試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著PRV感染進(jìn)程的推移，PRV衣殼蛋白VP26的表達(dá)量顯著升高，LC3-Ⅱ的表達(dá)水平明顯增加(圖1)。

***.P<0.001

圖1 PRV感染中PK-15細(xì)胞的自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ和病毒衣殼蛋白VP26的表達(dá)變化Fig.1 LC3-Ⅱand VP26 expression in PK-15 cells during PRV infection

自噬的標(biāo)記蛋白除了LC3，SQSTM1/P62蛋白也同樣可以作為標(biāo)記蛋白。SQSTM1/P62是一種涉及自噬的泛素化結(jié)合蛋白(P62)。偶聯(lián)于LC3的P62能夠在細(xì)胞自噬中晚期被自噬體降解[17]。在自噬過程中，P62表達(dá)水平與細(xì)胞自噬正相關(guān)；相反，自噬抑制劑可以穩(wěn)定P62的水平。試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著PRV感染進(jìn)程的推移，PRV衣殼蛋白VP26的表達(dá)量顯著升高，P62的表達(dá)量明顯的減少(圖2)。

***.P<0.001

圖2 PRV感染中PK-15細(xì)胞的自噬標(biāo)志蛋白P62的表達(dá)變化Fig.2 P62 expression in PK-15 cells during PRV infection

2.2 PRV感染誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬可能依賴于PI3K-Ⅰ/AKT通路

調(diào)控自噬的通路具體包括mTOR、AMPK、PI3K-Ⅰ/AKT和MAPK等通路。mTOR上游的PI3K-Ⅰ/AKT信號通路，可以激活mTOR。 AKT是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。研究表明，細(xì)胞自噬受PI3K/AKT的控制，此途徑的激活能促進(jìn)mTOR[20]。本試驗(yàn)利用WB檢測了感染PRV后AKT和p-AKT(Ser473)蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，AKT蛋白表達(dá)水平無明顯變化(圖3A),而p-AKT的表達(dá)水平隨時間的延長而極顯著地下降(圖3B)。由此推測當(dāng)PRV感染PK-15細(xì)胞后，通過下調(diào)p-AKT蛋白水平的表達(dá)，從而減少對mTOR的促進(jìn)作用，從而誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。這些結(jié)果表明PRV感染誘導(dǎo)自噬可能依賴于PI3K-Ⅰ/AKT通路。

A. WB檢測PRV刺激后PK-15細(xì)胞AKT表達(dá)不變；B. WB 檢測PRV刺激后PK-15細(xì)胞p-AKT表達(dá)下降； ***.P<0.001A. WB analysis of AKT expression in PK-15 cells unchanged before and after treatment PRV; B. WB analysis of p-AKT expression in PK-15 cells decreased after treatment PRV; ***. P<0.001

圖3 PRV感染PK-15細(xì)胞AKT和p-AKT蛋白表達(dá)水平Fig.3 AKT and p-AKT expression in PK-15 cells during PRV infection

2.3 PRV感染誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

Annexin V用來檢測細(xì)胞的早期凋亡水平。PI是一種利用細(xì)胞通透性區(qū)分早期和晚期凋亡的熒光染料。PRV處理12和24 h的凋亡情況相對于對照組，凋亡水平極顯著上升；處理24 h相對于12 h，早期凋亡相較于晚期凋亡明顯增加(圖4)。

2.4 PRV感染誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡同時激活Caspase-9和Caspase-8蛋白

Pro-Caspase-9能被細(xì)胞質(zhì)中APAF1和Caspase-9的結(jié)合激活，進(jìn)而活化Caspase-3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生。死亡受體途經(jīng)主要通過Cleaved Caspase-8調(diào)控，其不僅可以活化下游的效應(yīng)Caspase-3，也可以通過剪切BID蛋白從而抑制BAK/BAX樣蛋白。WB檢測結(jié)果顯示，感染PRV的試驗(yàn)組相較于對照組Cleaved Caspase-9的蛋白水平極顯著上升，在感染6 h時達(dá)到頂峰(圖5A)；同樣，Cleaved Caspase-8的蛋白水平也極顯著上升，在感染24 h時達(dá)到頂峰(圖5B)。

2.5 PRV感染抑制Beclin1和Bcl-2、Bcl-xL結(jié)合進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞自噬

Beclin1可以與VPS34、p150/VPS15、紫外線照射抗性相關(guān)基因(UVRAG)、ATG14樣蛋白(ATG 14L)和Rubicon蛋白結(jié)合，形成一個大的蛋白復(fù)合體。首先，檢測了Beclin1的mRNA和蛋白質(zhì)水平，結(jié)果顯示PRV感染能夠刺激Beclin1的mRNA水平逐步上升，感染24 h前顯著上升(圖6A)，然后再下降。同時，12、24 h Beclin1在蛋白表達(dá)水平顯著增加(圖6B和C)。

本研究檢測了Bcl-2的mRNA和蛋白水平，結(jié)果顯示PRV感染能夠刺激Bcl-2的mRNA水平先上升后下降，感染6 h顯著上升然后逐漸下降，在36 h極顯著下降(圖7A)。同時，24 h前Bcl-2在蛋白水平上的表達(dá)隨著時間的改變極顯著上升(圖7B和C)。

本研究利用RT-qPCR檢測了Bcl-xL的mRNA水平，結(jié)果顯示PRV感染能夠刺激Bcl-xL的mRNA水平發(fā)生改變，24 h前極顯著上升，然后下降(圖8A)。同時，本研究利用WB檢測了Bcl-xL蛋白水平，24 h前Bcl-xL在蛋白水平上的表達(dá)呈現(xiàn)逐步上升的趨勢(圖8B和C)。

Bcl-2、Bcl-xL和Beclin1都含有BH3結(jié)構(gòu)域，結(jié)合形成的抗自噬復(fù)合體Beclin1/Bcl-2和Beclin1/Bcl-xL，從而抑制Beclin1的促自噬作用[23]。因此，本研究通過免疫共沉淀試驗(yàn)檢測感染PRV的PK-15 細(xì)胞中Beclin1與Bcl-2和Bcl-xL相互作用，結(jié)果顯示對照組和PRV處理組中Beclin1都能同Bcl-2和Bcl-xL結(jié)合，但是PRV感染試驗(yàn)組相較對照組Beclin1與Bcl-2和Bcl-xL結(jié)合量明顯減弱(圖9)。說明PRV感染PK-15細(xì)胞后Beclin1能夠與Bcl-2、Bcl-xL結(jié)合，但是結(jié)合量減少，從而可能促進(jìn)細(xì)胞自噬。

3 討 論

細(xì)胞自噬和凋亡是兩個進(jìn)化過程中高度保守的生理過程，二者對生長發(fā)育至關(guān)重要，兩者失調(diào)則會破壞機(jī)體穩(wěn)態(tài)。先前研究表明HSV1和PRV感染復(fù)數(shù)為3時感染BM-DCs早期(6 h)會導(dǎo)致細(xì)胞自噬[21]。English等[24]研究結(jié)果表明HSV1感染巨噬細(xì)胞細(xì)胞系誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬不依賴PKR/eIF2α信號通路。因此，本研究旨在揭示PRV感染PK-15晚期是否同樣能誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。

本研究首先揭示了PRV感染可以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。并利用細(xì)胞熒光觀察到細(xì)胞質(zhì)中彌散性LC3以獨(dú)特的斑點(diǎn)狀重新分布的現(xiàn)象進(jìn)一步說明PRV感染誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。通過LC3-Ⅱ和P62蛋白表達(dá)量在PRV感染后的變化情況可初步推斷PRV感染PK-15誘導(dǎo)細(xì)胞自噬相較于BM-DCs出現(xiàn)的時間明顯晚一些。隨后，通過檢測p-AKT表達(dá)水平隨時間變化表明PRV感染PK-15誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬可能依賴于PI3K/AKT信號通路。這與Shelly等[20]報道的VSV感染通過降低p-AKT磷酸化誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的結(jié)果相一致。

***.P<0.001

圖4 Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測的感染PRV的PK-15細(xì)胞凋亡水平上升Fig.4 Flow cytometry detection apoptosis of PK-15 cells enhanced by using Annexin V-FITC/PI staining

A. WB檢測PRV刺激的PK-15細(xì)胞不同時間Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)上升；B. WB檢測PRV刺激的PK-15細(xì)胞不同時間Cleaved Caspase-8蛋白表達(dá)上升；**.P<0.01；***.P<0.001A. WB analysis of Cleaved Caspase-9 expression in PK-15 cells increased after treatment PRV at all times investigated; B. WB analysis of Cleaved Capase-8 expression in PK-15 cells increased after treatment PRV at all times investigated; **.P<0.01；***.P<0.001

圖5 PRV感染的PK-15細(xì)胞Cleaved Caspase-9和Caspase-8蛋白表達(dá)水平上升Fig.5 Cleaved Caspase-9 and Cleaved Caspase-8 expression increased in PK-15 cells during PRV infection

A. RT-qPCR檢測PRV感染的PK-15細(xì)胞Beclin1的mRNA表達(dá)水平升高；B. WB檢測PRV感染的PK-15細(xì)胞Beclin1蛋白表達(dá)上升；C. Beclin1蛋白表達(dá)灰度分析結(jié)果；*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001A. RT-qPCR analysis of Beclin1 mRNA level increased in PK-15 cells during PRV infection; B. WB analysis of Beclin1 expression increased in PK-15 cells during PRV infection; C. The grayscale analysis of Beclin1 protein; *.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001

圖6 PRV感染PK-15細(xì)胞Beclin1的mRNA和蛋白水平變化Fig.6 Transcription and translation level of Beclin1 in PK-15 cells during PRV infection

A. RT-qPCR檢測PRV感染的PK-15細(xì)胞Bcl-2的mRNA表達(dá)水平升高；B. WB檢測PRV感染的PK-15細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)上升；C. Bcl-2蛋白表達(dá)灰度分析結(jié)果；*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001A. RT-qPCR analysis of Bcl-2 mRNA level increased in PK-15 cells during PRV infection; B. WB analysis of Bcl-2 expression increased in PK-15 cells during PRV infection; C. The grayscale analysis of Bcl-2 protein; *.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001

圖7 PRV感染PK-15細(xì)胞Bcl-2的mRNA和蛋白水平變化Fig.7 Transcription and translation level of Bcl-2 in PK-15 cells during PRV infection

A. RT-qPCR檢測PRV感染的PK-15細(xì)胞Bcl-xL的mRNA表達(dá)水平升高；B. WB檢測PRV感染的PK-15細(xì)胞Bcl-xL蛋白表達(dá)上升；C. Bcl-xL蛋白表達(dá)灰度分析結(jié)果；***.P<0.001A. RT-qPCR analysis of Bcl-xL mRNA level increased in PK-15 cells during PRV infection; B. WB analysis of Bcl-xL expression increased in PK-15 cells during PRV infection; C. The grayscale analysis of Bcl-xL protein; ***. P<0.001

圖8 PRV感染PK-15細(xì)胞Bcl-xL的mRNA和蛋白水平變化Fig.8 Transcription and translation level of Bcl-xL in PK-15 cells during PRV infection

A. Beclin1與Bcl-2蛋白免疫共沉淀；B. Beclin1與Bcl-xL蛋白免疫共沉淀A. Co-IP analysis the interaction of Beclin1 and Bcl-2; B. Co-IP analysis the interaction of Beclin1 and Bcl-xL

圖9 PRV感染的PK-15細(xì)胞Beclin1與Bcl-2、Bcl-xL蛋白結(jié)合量減少Fig.9 Interaction of Beclin1/Bcl-2 and Beclin1/Bcl-xL decreased in PRV-infected PK-15

細(xì)胞自噬和凋亡雖然是兩種功能具有一定差異的生命活動，但二者卻存在著密切的關(guān)聯(lián)。用流式細(xì)胞術(shù)檢測了PRV感染PK-15細(xì)胞凋亡情況，說明感染PRV誘導(dǎo)PK-15細(xì)胞凋亡并且在感染12～24 h時間段內(nèi)細(xì)胞發(fā)生早期凋亡和晚期凋亡的比率明顯升高，從而推測細(xì)胞自噬可能早于細(xì)胞凋亡發(fā)生。這與Zhou等[15]報道的PRRSV感染誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬早于細(xì)胞凋亡的結(jié)果相似。同時，本研究還初步探討了PRV感染誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡依賴的細(xì)胞信號通路。常見的兩種細(xì)胞凋亡信號通路是涉及病毒復(fù)制并導(dǎo)致Caspase-9活化的細(xì)胞內(nèi)在途徑和依賴于細(xì)胞表面可溶性死亡效應(yīng)配體Caspase-8激活的細(xì)胞外途徑[25]。研究結(jié)果表明PRV感染誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡同時依賴于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外兩個凋亡信號通路，在感染的早期主要依賴于細(xì)胞內(nèi)途徑，在感染晚期主要依賴于細(xì)胞外途徑。推測PRV感染宿主細(xì)胞后集體為了抵抗病毒首先啟動的Bcl-2家族蛋白依賴的細(xì)胞凋亡通路，通過釋放細(xì)胞色素C活化Caspase-9；然后感染晚期，當(dāng)Bcl-2家族信號減弱時，通過死亡受體通路激活Caspase-8，促進(jìn)細(xì)胞凋亡釋放成熟的病毒粒子。

4 結(jié) 論

PRV感染誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬可能依賴于PI3K-Ⅰ/AKT信號通路，PRV感染可能同時激活了線粒體凋亡途經(jīng)和死亡受體途經(jīng)從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而PRV感染誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡可能通過抑制Beclin1和Bcl-2、Bcl-xL結(jié)合而相互關(guān)聯(lián)。

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