姜辰龍，嚴秀文，張日騰，李 勇，姜 平，白 娟*(. 南京農業(yè)大學生命科學學院，南京 0095；. 南京農業(yè)大學動物醫(yī)學院農業(yè)部動物細菌學重點實驗室，南京 0095)

豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus, PCV)屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬成員。該病毒有兩個血清型，即PCV1和PCV2[1]。通常認為，PCV1不具有致病性，偶見其引發(fā)的繁殖障礙，但其在豬群中廣泛感染。PCV2感染可引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(post-weaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)、豬皮炎腎病綜合征(porcine dermatitis nephropathy syndrome, PDNS)、豬呼吸道綜合征(porcine respiratory disease complex, PRDC)、母豬繁殖障礙綜合征、腹瀉及先天性震顫等多種臨床疾病，給全球養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經濟損失，引起各國養(yǎng)豬業(yè)的高度重視[2-3]。近年來，美國學者Phan、Palinski等首先發(fā)現繁殖障礙母豬、PDNS、豬心肌炎和多系統(tǒng)炎癥病變組織中存在一種新的豬圓環(huán)病毒，其Cap基因序列與PCV2的相似性僅24%～26%，命名為PCV3[4-5]。我國學者采用PCR方法從臨床發(fā)病豬肺和淋巴結組織樣品中檢出PCV3，證明我國也存在該病毒[6-7]。

環(huán)介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)具有經濟實用、高效、快速和簡便等特點，已經用于多種豬病原檢測，如豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征和豬偽狂犬病毒等[8-9]，但尚無PCV3 LAMP檢測方法報道。本研究根據PCV3基因序列，設計特異引物，成功建立了一種PCV3 LAMP檢測方法，56 ℃恒溫條件下35 min內即可直接通過肉眼判定，并具有較高特異性和敏感性。

1 材料和方法

1.1 病毒、重組質粒和病料

病毒：PCV3、PCV1、PCV2a、PCV2b、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)等均由本實驗室分離保存。

重組質粒：pMD19-T-Cap，含PCV3 ORF2基因，濃度為1.89×10-7ng·μL-1，基因拷貝數為5.22×1010copies·μL-1，由南京金思瑞生物技術有限公司構建并提供。

豬臨床樣品：來源于2016—2017年江蘇、山東、浙江和福建省38個豬場，臨床上表現呼吸道癥狀，淋巴結和肺組織樣品68份。-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 病毒核酸提取

按照DNA提取試劑盒說明書進行抽提，采用TRIZOL試劑說明書方法提取病毒核酸，置-20 ℃保存。

1.3 LAMP引物設計與合成

根據PCV3 MO毒株(NCBI登錄號:KX778720.1)Cap基因保守序列，運用在線生物軟件(https://primere explorer.jp/)設計特異性引物，引物序列見表1，包括一對外引物F3和B3、一對內引物FIP和BIP以及一對環(huán)引物LoopF和LoopB，引物由Invitrogen公司合成。

表1LAMP擴增引物

Table1PrimersusedinLAMPamplification

名稱Name引物序列(5′→3′)Primersequence位置/bpLocationF3TCCAGTTTTTTCCGGGACAT43?258B3AACACTTGGCTCCAAGACGFIPCTTTTTCTCCAGACCCACCCCA?AAAGCAGTGCTCCCCATTGBIPTTCCCGCCAGAATTGGTTTCGG?GCGGAAAGTTCCACTCGTAALFACACATATGACCCCACCGTLBGGTGAAGTAACGGCTGTGTTT

1.4 LAMP反應體系

LAMP反應體系25 μL，含10×Thermopol Buffer(NEB公司)2.5 μL、MgSO4(100 mmol·L-1)(NEB公司)1.5 μL、dNTP(10 mmol·L-1)(NEB公司)3.5 μL，內引物FIP/BIP(40 μmol·L-1)各為1 μL，外引物F3/B3(5 μmol·L-1)各1 μL，環(huán)引物LoopF/LoopB(10 μmol·L-1)各為1 μL，Bst DNA聚合酶(8 000 U·mL-1)(NEB公司)1.5 μL，甜菜堿(Betaine)(Sigma公司)2.0 μL，滅菌ddH2O 6.5 μL，模板DNA 1.5 μL。

1.5 LAMP反應體系和條件優(yōu)化

按下列成分的濃度進行反應體系優(yōu)化：dNTP濃度梯度4、6、8、10和12 mmol·L-1；Mg2+濃度120、100、80、60和40 mmol·L-1；甜菜堿量4.0、3.0、2.0、1.0和0 μL；內、外引物(μmol·L-1)比12∶1、10∶1、8∶1、6∶1和4∶1。

反應溫度優(yōu)化：溫度設置(67、65、63、61、59和57 ℃)；反應時間設置為(40、38、36、34和32 min)5個梯度，反應結束后取5 μL反應產物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定結果，根據條帶擴增效果確定最佳反應條件。

1.6 LAMP敏感性試驗

將重組質粒pMD19-T-Cap陽性質粒標準品稀釋至106copies·μL-1，按10倍倍比稀釋至100.1copies·μL-1，用優(yōu)化好的PCV3-LAMP方法和常規(guī)RT-PCR方法同步進行敏感性比較。并對以上結果分別用SYBR Green Ⅰ染料進行顯色，篩選最佳染料。

1.7 LAMP特異性試驗

取PRRSV、PRV、PCV1、PCV2和豬瘟病毒樣品，提取病毒基因組，用LAMP方法檢測，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

用Olige軟件分析LAMP目的片段中的酶切位點，篩選單一的HaeⅡ(識別GCGC)，進行酶切反應。20 μL酶切反應體系包括：HaeⅡ(TaKaRa公司) 1.5 μL，LAMP產物1 μL，10×Buffer 2 μL，15.5 μL ddH2O。37 ℃反應2 h，取15 μL的酶切產物在1.5%瓊脂糖凝膠進行鑒定，酶切產物大小應為184 bp。

1.8 PCR方法檢測PCV3

按Palinski等[5]方法進行。PCR反應體系為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性20 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，進行40個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。引物為5′-CCACAGAAGGCGCTATGTC-3′和5′-CCGCATAAGGGTCGTCTTG-3′，PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察。

2 結 果

2.1 LAMP反應體系和條件優(yōu)化

采用LAMP體系內不同濃度組分，進行反應條件優(yōu)化，結果見圖1，確定25 μL最佳反應體系成分為：10×Thermopol Buffer 2.5 μL，MgSO4(100 mmol·L-1)1.5 μL，dNTP(10 mmol·L-1)3.5 μL，外引物F3/B3(4 μmol·L-1)各1 μL，內引物FIP/BIP(40 μmol·L-1)各為1 μL，環(huán)引物LF/LB(10 μmol·L-1)各為 1 μL，Bst DNA聚合酶(8 000 U·mL-1)1.5 μL，甜菜堿(Betaine)2 μL，滅菌ddH2O 6.5 μL，模板cDNA 1.5 μL。最佳反應溫度為59 ℃，最短反應時間為36 min。

A. dNTP濃度優(yōu)化; B.Mg2+優(yōu)化；C.甜菜堿優(yōu)化；D.內外引物濃度比優(yōu)化；E.溫度優(yōu)化；F.時間優(yōu)化；M.DNA相對分子質量標準；N.陰性對照A. Optimization of dNTP concentration; B. Mg2+ concentration; C. Betaine concentration; D. Ratio of forward and reverse primers concentration; E. Temperature; F. Reaction time; M. DNA marker DL2000；N. Negative control

圖1 PCV3 LAMP反應體系和條件優(yōu)化結果Fig.1 Optimization of the reaction system and conditions of LAMP for detection of PCV3

反應產物用SYBR Green Ⅰ(Invitrogen公司)染料進行顯色比較。

2.2 可視性結果觀察

LAMP反應過程中，dNTP析出的焦磷酸根離子與反應溶液中的Mg2+結合，產生焦磷酸鎂白色沉淀(圖2A)。SYBR Green Ⅰ則通過結合到雙鏈DNA的小溝產生綠色熒光，而陰性呈現黃色(圖2B)。

2.3 LAMP敏感性試驗

取PCV3重組質粒pMD19-T-Cap(濃度為1.89×10-7ng·μL-1，基因拷貝數為5.22×1010copies·μL-1)，用蒸餾水做10倍梯度稀釋，采用LAMP和PCR檢測PCV3，結果為：常規(guī)PCR方法可檢測102copies·μL-1濃度的質粒，LAMP反應可檢測到10拷貝·μL-1濃度的質粒，比常規(guī)PCR方法敏感10倍。

A.不加染料觀察；B. SYBR Green Ⅰ顯色結果A. LAMP positive products without stain components; B. LAMP positive products by adding SYBR Green Ⅰ

圖2 LAMP兩種染料可視化效果比較Fig.2 Observation of LAMP amplification products by adding 2 staining components

A.LAMP電泳結果; B.RT-PCR; C.LAMP-SYBR Green Ⅰ顯色。1～9. 107 ～100.01 基因拷貝·μL-1; 10. 陰性對照；M. DL2000 DNA相對分子質量標準A. LAMP results; B. RT-PCR; C. Visual of SYBR Green Ⅰ. 1-9. 107 ～100.01 copies·μL-1; 10. Negative control; M. DL2000 DNA marker

圖3 LAMP反應敏感性試驗Fig.3 Sensitivity of LAMP

2.4 LAMP特異性試驗

取PCV3、PRRSV、PRV、PCV1、PCV2和豬瘟病毒樣品進行PCV3 LAMP檢測，結果顯示，PCV3樣品LAMP擴增可見梯形條帶，其他病原檢測均未見條帶(圖4A)。

取PCV3 LAMP擴增產物，采用HaeⅡ酶切，1.5%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，出現約184 bp條帶和126 bp(圖4B)，與預期計算結果相符，證明擴增正確。

2.5 臨床樣品檢測

取68份臨床發(fā)病豬組織樣品，采用LAMP顯色法與常規(guī)PCR同時檢測，結果見表2，表明LAMP檢測PCV3陽性檢出率為30.9%(21/68)，常規(guī)PCR陽性率為26.5%(18/68)，LAMP方法檢出率高于常規(guī)PCR檢測結果，LAMP與常規(guī)PCR符合率為95.6%(65/68)。

A.不同病原的LAMP檢測結果；B. LAMP反應產物鑒定結果；1. 陰性對照；2. 豬瘟病毒； 3. 豬流行性腹瀉病毒；4. 豬圓環(huán)病毒1型；5. 豬圓環(huán)病毒2a和2b型；6. 豬偽狂犬病毒；7. 豬圓環(huán)病毒3型；8. 豬繁殖與呼吸綜合征；9. Hae Ⅱ酶切LAMP產物結果；M. DL2000 DNA 相對分子質量標準A. LAMP detection of different pathogens results; B. Identification results of LAMP reaction products; 1. Negative control; 2. CSFV; 3. PEDV; 4. PCV1; 5. PCV2a+2b; 6. PRV; 7.PCV3; 8.PRRSV; 9. LAMP products digested with Hae Ⅱ; M. DL2000 DNA marker

圖4 LAMP特異性試驗結果Fig.4 Spicificity assay of LAMP

表2LAMP與PCR檢測臨床樣品PCV3結果的比較

Table2ComparisonofLAMPwithPCRresultsforPCV3inclinicalsamples

檢測方法DetectionmethodLAMP陽性數/份Positivenumber陰性數/份Negativenumber總數/份TotalRT?PCR陽性數/份Positivenumber18018陰性數/份Negativenumber34750總數/份Total214768

3 討 論

在2003年以前PCV2a為主要流行毒株，而近年來PCV2b感染較為普遍。豬圓環(huán)病毒3型(PCV3)是一種新的病原，2016年10月，Palinski等[5]報道了從流產胎豬中檢測到高拷貝的PCV3基因組。國外報道該病毒感染可能與豬皮炎和母豬繁殖障礙相關，但其致病性還不十分清楚。該病毒的檢測方法主要有PCR方法、real-time PCR方法和核酸探針方法[10-12]。PCR方法具有靈敏性和特異性高的特點。我國學者采用PCR方法進行了大量樣品檢測[12]，但需要價格昂貴的PCR檢測儀器。Real-time PCR及核酸探針方法條件要求更高，很難普及推廣。

環(huán)介導的恒溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，是Notomi等[13]于2000年發(fā)明的一種體外恒溫核酸擴增技術，不需要昂貴的儀器設備，在等溫條件下就能快速完成反應[14-15]。目前該項技術已被廣泛用于細菌、病毒、寄生蟲和動物胚胎鑒定等檢測。本研究所建立LAMP檢測方法只需在恒溫59 ℃條件下反應36 min即可完成擴增，通過在反應管中加入染料經顏色變化判定結果，達到快速檢測的目的。在篩選熒光染料、提高檢測結果靈敏度的研究結果上發(fā)現，SYBR Green Ⅰ比HNB顯色效果更直觀，敏感性也更佳。該方法同樣具備較好的特異性，靈敏度與real-time PCR相當。臨床樣品檢測結果顯示，LAMP與傳統(tǒng)的PCR有較高的符合率，與龐笑語等[16]報道的結果相符。這表明PCV3已經普遍存在于我國豬群體內，因此加強該病流行病學監(jiān)測顯得至關重要。本研究建立的針對PCV3的LAMP檢測方法快速簡便，可用于PCV3臨床檢測，具有較好的應用前景。

由于該技術具備極高的靈敏度，故在檢測過程中會不可避免出現假陽性污染問題。因此LAMP的檢測環(huán)境需要嚴格分區(qū)，操作規(guī)程一定要嚴謹，多通風。針對此類問題，我們在以后的研究中也會繼續(xù)尋找改進的措施。

4 結 論

根據PCV3 ORF2基因保守序列，設計特異性引物并優(yōu)化反應條件，建立了PCV3 LAMP檢測方法，該方法最低檢測限為1.0×101copies·μL-1，與PRRSV、PRV、CSFV、PCV1和PCV2等均無交叉反應。臨床樣品檢測發(fā)現，PCV3陽性率占30.9%，與PCR檢測結果符合率為95.6%(65/68)。提示相對傳統(tǒng)PCR方法而言，該方法敏感特異，簡便快速，可用于PCV3檢測和臨床診斷。

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