王建文，李林玲，王鏡力，孟 軍，曾亞琦，姚新奎*，辛雅莉(.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052； 2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)馬產(chǎn)業(yè)研究院，烏魯木齊 830052)

輔肌動蛋白(ACTN)是近年來在細(xì)胞骨架與細(xì)胞運(yùn)動研究中的熱點(diǎn)蛋白。目前的研究結(jié)果表明，在哺乳動物中主要存在4種不同類型的輔肌動蛋白，其中輔肌動蛋白-2(ACTN2)和輔肌動蛋白-3(ACTN3)為骨骼肌Z線的主要組成部分，且這兩種蛋白具有高度的相似性(81%序列一致)[1-3]。ACTN3基因僅在骨骼肌快肌纖維中表達(dá)，且其多態(tài)性與肌肉力量有關(guān)，可能依賴于其對纖維類型比例的控制功能，與纖維分布和肌肉力量有顯著關(guān)聯(lián)，在ACTN3基因敲除小鼠中三羧酸循環(huán)、線粒體電子信號傳遞鏈和脂肪酸氧化代謝途徑中的關(guān)鍵酶一直較高[4-5]。與此同時，ACTN3蛋白缺乏對骨骼肌結(jié)構(gòu)[6]、新陳代謝[7]及鈣通路[8]等均會產(chǎn)生一定的影響。Gu等[9]通過對純血馬進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，ACTN3基因在純血馬中有4個突變位點(diǎn)。Mata等[10]通過對法國騎乘馬的研究表明，ACTN3基因的cDNA有8個突變位點(diǎn)，其中6個 外顯子突變位點(diǎn)均為同義突變。Thomas等[11]的研究結(jié)果表明，5個 澳大利亞品種馬中共發(fā)現(xiàn)34個突變位點(diǎn)，其中啟動子g.1104G>A突變后，純血馬中未發(fā)現(xiàn)AA基因型，重挽型品種(夏爾馬和克萊茲代爾馬)中未發(fā)現(xiàn)GG基因型，其中純血馬為優(yōu)秀的速度型運(yùn)動馬，而夏爾馬和克萊茲代爾馬則為挽用型，趙啟南等[12]通過對蒙古馬進(jìn)行調(diào)教訓(xùn)練的研究也顯示，ACTN3基因的表達(dá)上調(diào)，這些研究在一定程度上顯示，ACTN3基因可能會對運(yùn)動性能具有重要的意義。

伊犁馬是我國知名運(yùn)動馬品種，其以哈薩克馬為母本，通過與奧爾洛夫馬、頓河馬、阿哈捷金馬等輕型馬品種進(jìn)行雜交培育而成，并與純血馬、新吉爾吉斯馬等品種進(jìn)行雜交改良[13]，現(xiàn)為我國優(yōu)良的國產(chǎn)騎乘馬品種[14]，具有良好的運(yùn)動性能?，F(xiàn)對伊犁馬運(yùn)動性能的研究主要集中在調(diào)教訓(xùn)練、血液生化等方面，對分子標(biāo)記研究相對較少。因此，針對ACTN3基因的結(jié)構(gòu)與功能，并將其運(yùn)用于實(shí)際生產(chǎn)具有重大意義。

本研究以伊犁馬為試驗(yàn)動物，通過測序法對ACTN3基因多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行篩選，并進(jìn)行連鎖不平衡及生物信息學(xué)分析，探究伊犁馬ACTN3基因多態(tài)性，為伊犁馬的早期運(yùn)動選材及分子選育等提供相關(guān)理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以38匹健康伊犁馬為研究對象，其中公馬16匹，母馬22匹，均為2016年伊犁馬常態(tài)化賽事參賽馬匹。通過枸櫞酸鈉采血管采集靜脈血樣5 mL，混勻后，置于-20℃保存。

1.2 引物設(shè)計與PCR擴(kuò)增

通過DNA提取試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取血液DNA。根據(jù)NCBI公布的純血馬ACTN3序列(HQ005425)采用Primer-BLAST對所有外顯子進(jìn)行引物設(shè)計，當(dāng)相鄰兩個外顯子之間間隔較小(小于350 bp)時，兩個外顯子通過同一對引物進(jìn)行擴(kuò)增(表1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行合成。通過降落PCR進(jìn)行擴(kuò)增，PCR體系(25 μL)：上下游引物各0.5 μL，dNTP(10 mmol·L-1)0.5 μL，Taq Buffer 2.5 μL，Taq酶(5 U·μL-1)0.2 μL，ddH2O加至25 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，63 ℃退火45 s，共計10個循環(huán)，每個循環(huán)降低0.5 ℃，72 ℃延伸1 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火45 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)，72 ℃修復(fù)延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%TAE瓊脂糖電泳進(jìn)行檢測。

1.3 擴(kuò)增產(chǎn)物測序和BLAST分析

將所有擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序，并利用DNAStar軟件對所測得結(jié)果進(jìn)行校正，與馬ACTN3基因序列進(jìn)行對比(HQ005425)，通過BLAST分析并確定突變位點(diǎn)。

1.4 伊犁馬群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

通過haploview 4.2軟件根據(jù)測序情況計算雜合度、有效等位基因數(shù)、多態(tài)信息含量、基因(型)頻率及檢測Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(當(dāng)P>0.05時判定處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài))。

1.5 連鎖不平衡及單倍型分析

通過HaploView 4.2軟件對所測外顯子區(qū)域突變位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡分析及單倍型構(gòu)建。

1.6 生物信息學(xué)分析

利用 NCBI 中的 ORF find確定尋找馬ACTN3基因的編碼區(qū)，并進(jìn)行氨基酸的翻譯，利用BioXM 2.6對突變位點(diǎn)編碼的氨基酸序列進(jìn)行比對，通過在線軟件RNAfold預(yù)測不同單倍體mRNA二級結(jié)構(gòu)(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi)及最小自由能，運(yùn)用在線軟件sopm預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)。

表1擴(kuò)增引物信息

Table1PCRprimerinformation

上游引物序列(5′→3′)Forwardprimersequence下游引物序列(5′→3′)Reverseprimersequence片段長度/bpLength所擴(kuò)增外顯子AmplifiedexonTTCCAGTGCCCCCAGATTCTCAGAGGACGGATGGGCAGA4971CCTCATCCAAACTGGGACCTGTGGTCCCTACACTCCCTCCTG7322、3CTGAACCCGTGAAGCTGGACTGTTCAACATTGACTCAGTCCTCCTA6254、5TGGCGCAAGTCTGGTAATGAAGAAGGATTCTGACCAGGGAGTG5276、7AGTGGCTGTGACTAAATGTCTCTGGGGTGAAGATGGCAGGAGAAG7538、9TACTGGTCCCTGGACTCAGAAATCATCACGGTTCACCCATTGTA53710TCCAGCTCTGCCGATGTTCCAGACACTGTGGCCCAAAGACG42711AGGGTAGACTGGGCAGGTGTGGAGACAGGGTTACGGGAGGAG47912CCTATCTACCCTGGCTGTCTCATTCCCGTCCCCATTCCTCAG56113、14AGTGCTGGGCTGGGAGACAGCAGACTCCAGATCCGAAGGT45115AGGTTGAATAACTTGCCCAGGAGTCACTTCCACTTGCTAGGTCTC70116、17ATCATCAAACTTTAAGGCAGGGAGGCGTGATGAGGAGGAAGTG59518、19GACGGTCTATGGAGAAAGGAAGTAAGCACTTGGCTGGTCATTCT65020、21

2 結(jié) 果

2.1 伊犁馬ACTN3基因測序及SNP鑒定

所測序列與馬ACTN3基因序列(HQ005425)具有高度同源性，可以確定PCR產(chǎn)物為馬ACTN3的基因序列。通過對測序結(jié)果進(jìn)行比對分析，結(jié)果顯示，在本試驗(yàn)中ACTN3基因共發(fā)現(xiàn)有8個外顯子突變位點(diǎn)，各突變位點(diǎn)的具體信息如表2所示。其中位于第15外顯子的T9059G突變?yōu)殄e義突變，突變使得ACTN3蛋白質(zhì)的第594個氨基酸由甘氨酸變?yōu)榘腚装彼幔溆喔魍蛔兾稽c(diǎn)均為同義突變。

表2ACTN3基因外顯子突變位點(diǎn)信息

Table2TheinformationofSNPsofACTN3geneexon

位點(diǎn)Site分布DistributionEquCab2．0位置EquCab2．0position參考位置ReferencepositionSNP突變類型Substitutiontype氨基酸位置AminoacidpositionSNP1外顯子4265165343334G/A同義突變129SNP2外顯子10265194066206A/G同義突變366SNP3外顯子14265218088608A/G同義突變534SNP4外顯子15265222599059T/G錯義突變594SNP5外顯子15265222919091C/G同義突變604SNP6外顯子192652386010660C/T同義突變778SNP7外顯子202652450411304C/T同義突變814SNP8外顯子212652471711517A/G同義突變858

2.2 伊犁馬ACTN3突變位點(diǎn)的遺傳學(xué)分析

對檢測出的突變位點(diǎn)的基因(型)頻率及多態(tài)信息含量等參數(shù)進(jìn)行計算，如表3所示。在伊犁馬中G3334A、A8608G、T9059G、C9091G和C11304T 5個 突變位點(diǎn)均只檢測到兩種基因型，其余3個突變位點(diǎn)檢測到3種基因型。G3334A、A6206G和A11517G的優(yōu)勢等位基因?yàn)镚，G3334A的優(yōu)勢基因型為GG，A6206G和A11517G的優(yōu)勢基因型為AG。A8608G的優(yōu)勢等位基因?yàn)锳，優(yōu)勢基因型為AA。T9059G的優(yōu)勢等位基因?yàn)門，優(yōu)勢基因型為TT。C9091G、C10660T和 C11304T的優(yōu)勢等位基因?yàn)镃，優(yōu)勢基因型為CC。根據(jù)多態(tài)信息含量(PIC)的分類，A6206G和 A11517G屬于中度多態(tài)(0.250.05)。

表3伊犁馬ACTN3突變位點(diǎn)分析

Table3SNPsanalysisofACTN3inYilihorse

位點(diǎn)Site基因型頻率/%Genotypefrequency等位基因頻率/%Allelefrequency雜合度He有效等位基因數(shù)Ne多態(tài)信息含量PICH?EP值PvalueG3334AGGAGAAGA72．97(27)27．03(10)0．00(0)86．4913．510．23371．30510．20640．9930A6206GAAAGGGAG7．89(3)52．64(20)39．47(15)34．2165．790．45011．81860．34880．5514A8608GAAAGGGAG97．37(37)2．63(1)0．00(0)98．681．320．02601．02670．02561．0000T9059GTTTGGGTG94．74(36)5．26(2)0．00(0)97．372．630．05121．05400．04991．0000C9091GCCCGGGCG97．37(37)2．63(1)0．00(0)98．681．320．02601．02670．02561．0000C10660TCCCTTTCT86．84(33)10．53(4)2．63(1)92．117．890．14541．17010．13490．3836C11304TCCCTTTCT76．32(29)23．68(9)0．00(0)88．1611．840．20881．26390．18701．0000A11517GAAAGGGAG15．79(6)63．16(24)21．05(8)47．3752．630．49861．99440．37430．2128

2.3 伊犁馬ACTN3各位點(diǎn)連鎖不平衡分析與單倍型構(gòu)建

通過haploview 4.2軟件構(gòu)建伊犁馬ACTN3外顯子的連鎖不平衡圖譜，并進(jìn)行連鎖不平衡分析，如圖1和表4所示。在各突變位點(diǎn)中存在不同程度的連鎖，其中A6206G和A11517G間存在強(qiáng)的連鎖不平衡(D’>0.75， r2>0.33)，其余各突變位點(diǎn)間連鎖關(guān)系相對較弱。通過haploview 4.2軟件對各突變位點(diǎn)進(jìn)行單倍型構(gòu)建，結(jié)果如表5所示，在伊犁馬ACTN3基因外顯子中共構(gòu)建14個單倍型，各單倍型頻率為0.012～0.477，其中優(yōu)勢單倍型為H1(GGATCCCG)。

2.4 伊犁馬ACTN3 mRNA和蛋白的生物信息學(xué)分析

通過RNAfold對所構(gòu)建14種單倍型的mRNA二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，如圖2所示。在所構(gòu)建的單倍型中，各二級結(jié)構(gòu)間存在一定程度的改變，且其最小自由能也存在一定的差異，最小自由能為-4 719.22 ～-4 694.56 kJ·mol-1，其中單倍型H9(GAAGCCCA)的二級結(jié)構(gòu)最小自由能最大，單倍型H13(GGGTCCTA)的二級結(jié)構(gòu)最小自由能最小。

圖1 ACTN3各位點(diǎn)連鎖不平衡分析Fig.1 Linkage disequilibrium analysis of ACTN3 SNPs

表4ACTN3基因多態(tài)位點(diǎn)配對連鎖不平衡分析

Table4AnalysisofpairwiselinkagedisequilibriumofACTN3geneSNPs

位點(diǎn)SiteG3334AA6206GA8608GT9059GC9091GC10660TC11304TA11517GG3334A0．4481．0000．3231．0000．1811．0000．332A6206G0．0161．0001．0001．0001．0001．0000．909A8608G0．0020．0261．0001．0001．0001．0001．000T9059G0．0190．0520．0001．0000．4141．0001．000C9091G0．0020．0260．0000．0001．0001．0001．000C10660T0．0180．0450．0010．0540．1561．0001．000C11304T0．0220．2580．0990．0040．0020．0121．000A11517G0．0190．4770．0150．0300．0150．0950．149

對角線右上方為D’，左下方為r2

D’ data are above the diagonal for SNPs, r2data are below the diagonal for SNPs

表5ACTN3基因單倍型頻率分析

Table5HaplotypefrequenciesofACTN3gene

項目Item單倍型HaplotypeH1H2H3H4H5H6H7序列SequenceGGATCCCGGAATCCCAGAATCCTAGGATCTCAAGATCCCAAGATCCCGAAATCCCA頻率Frequency0．4770．1890．0920．0390．0380．0360．034H8H9H10H11H12H13H14序列SequenceGGATCCCAGAAGCCCAAGATCTCAGAATCCTGGGATGTCAGGGTCCTAAGAGCTCA頻率Frequency0．0150．0140．0140．0140．0130．0130．012

通過sopm對不同基因型所編碼ACTN3蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果如表6所示。結(jié)果表明，T9059G為錯義突變，由于氨基酸的變化使得ACTN3蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。β折疊由5.65%變?yōu)?.88%；α螺旋由64.63%變?yōu)?4.19%；無規(guī)卷曲度由19.29%變?yōu)?9.40%；伸展度由10.42%變?yōu)?0.53%。

3 討 論

ACTN3蛋白的主要功能之一是維持細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)[15-16]，在人基因中定位于11q13.1染色體，小鼠基因中定位于194.12 cM，且對人和小鼠的相關(guān)研究結(jié)果表明其對運(yùn)動性能有著顯著影響[17-21]。ACTN蛋白最重要的作用是結(jié)合肌動蛋白并使其鏈接成束[16]，維持不同細(xì)胞特定的形態(tài)，并賦予細(xì)胞一定的韌性與強(qiáng)度。同時還能結(jié)合如胞質(zhì)蛋白、膜受體和信號分子等蛋白分子，參與細(xì)胞活動，對肌動蛋白絲的形成與定位具有重要作用。Ebashi等[22]首次從兔肉中提取出α-輔肌動蛋白，并認(rèn)定其為肌動蛋白和肌球蛋白體外結(jié)合的必需蛋白。

在ACTN3外顯子中共鑒定出8個突變位點(diǎn)，其中3個突變位點(diǎn)與前人的研究結(jié)果一致[10-11]，新發(fā)現(xiàn)5個多態(tài)位點(diǎn)(G3334A、A8608G、T9059G、C9091G和C10660T)。8個多態(tài)位點(diǎn)所對應(yīng)編碼的氨基酸分別處于ABD域、中心桿狀域(RLs域)和“EF”手型域，ABD域的主要生理作用是維持Z線完整性及肌纖維組織[23]，能與其它Z線蛋白[24]和磷脂、磷脂酰肌醇二磷酸[25-26]相交聯(lián)。RLs域由4個血影蛋白組成[27]，其二級結(jié)構(gòu)顯示為3個α螺旋[28]，主要通過與K相關(guān)蛋白質(zhì)相互作用影響糖酵解酶活性[29]，“EF”手型域結(jié)合Ca2+，對肌動蛋白[30]及其它蛋白的動力學(xué)進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而影響肌纖維類型[31]。這表明，以上突變位點(diǎn)可能會影響到馬ACTN3蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能，影響肌纖維結(jié)構(gòu)、信號傳導(dǎo)及氧化代謝等，從而影響馬匹的運(yùn)動性能。

多數(shù)情況下，基因?qū)π阅艿挠绊懯嵌鄠€突變共同作用的結(jié)果[32]。本研究通過對所檢測到的8個多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡分析表明，各突變之間存在一定程度的連鎖，并構(gòu)建出14種單倍型。通過對不同單倍型mRNA進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)分析顯示，各單倍型間二級結(jié)構(gòu)與最小自由能有一定的差異，其中單倍型H9(GAAGCCCA)的最小自由能最高，這表明單倍型H9(GAAGCCCA)的二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性最低，而單倍型H13(GGGTCCTA)的最小自由能最低，因此其mRNA的二級結(jié)構(gòu)最為穩(wěn)定。

圖2 ACTN3不同單倍型mRNA二級結(jié)構(gòu)圖Fig.2 mRNA secondary structure of different haplotypes of ACTN3

表6突變前后ACTN3蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析

Table6PredictionofACTN3proteinsecondarystructurebeforeandaftermutation

%

通過進(jìn)一步對各突變導(dǎo)致的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，所檢測到的8個多態(tài)位點(diǎn)中有7個 為同義突變，其氨基酸并未發(fā)生改變，其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能是否發(fā)生改變及其對運(yùn)動性能的影響還有待于進(jìn)一步的研究明確。而T9059G為錯義突變，通過在線軟件進(jìn)行預(yù)測分析，結(jié)果顯示，其mRNA最小自由能增大，穩(wěn)定性降低，在蛋白質(zhì)翻譯過程中會導(dǎo)致第594號氨基酸由甘氨酸變?yōu)榘腚装彼幔瑢Χ壗Y(jié)構(gòu)的預(yù)測分析結(jié)果顯示，其二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，這有可能會導(dǎo)致蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)改變，從而影響到氧化酶活性，使得馬匹的運(yùn)動性能受到影響。

4 結(jié) 論

在伊犁馬ACTN3基因中共發(fā)現(xiàn)8個多態(tài)位點(diǎn)，共可組成14種單倍型，其中單倍型H1(GGATCCCG)為優(yōu)勢單倍型，不同單倍型mRNA的二級結(jié)構(gòu)與最小自由能有一定的差異。在8個突變位點(diǎn)中， T9059G為錯義突變，使得編碼ACTN3蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，可能對馬ACTN3蛋白質(zhì)功能產(chǎn)生影響，從而影響馬匹的運(yùn)動性能，該突變位點(diǎn)可能是與馬匹運(yùn)動性能相關(guān)的重要功能位點(diǎn)。

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