李 成，張雨迪，黃小波，劉浩宇，劉志鵬，趙玉佳，曹三杰，文心田，文翼平，趙 勤，伍 銳(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院豬病研究中心，成都 611130)

豬丁型冠狀病毒(porcine deltacoronavirus，PDCoV)是近年新發(fā)現(xiàn)的一種豬腸道病毒，該病毒屬于尼多病毒目(Nidovirales)，冠狀病毒科(Coronaviridae)，冠狀病毒屬(Coronavirus)[1]。早在2009年我國(guó)香港收集的豬直腸拭子中已被檢測(cè)到，但未分離到該病毒[2-3]。之后在健康的野生鳥類，亞洲豹貓身上也發(fā)現(xiàn)了它的身影，也證實(shí)該病毒與豬攜帶的PDCoV有極高的親緣性[4]。Woo等[1]提出的冠狀病毒進(jìn)化模型主張蝙蝠為α、β冠狀病毒的最初基因源，而鳥類為γ、δ冠狀病毒的最初基因源，因此δ冠狀病毒有可能是由野生鳥類傳給小型哺乳動(dòng)物和家豬。PDCoV與PEDV、TGEV臨床發(fā)病癥狀相似，能夠引起哺乳仔豬的消化系統(tǒng)疾病，導(dǎo)致豬腹瀉、嘔吐和脫水，嚴(yán)重者多系統(tǒng)衰竭死亡[5]。目前該病毒已在美國(guó)[6]、加拿大[7]、韓國(guó)[8]、老撾[9]被檢測(cè)到，感染的范圍正逐步擴(kuò)大，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)構(gòu)成嚴(yán)重的威脅。近年，國(guó)內(nèi)的一些流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明PDCoV在中國(guó)大陸的流行較為普遍，檢測(cè)率高達(dá)30%[10-13]，Dong等[14]在2004年存檔的安徽樣本中檢出PDCoV CHN-AH-2004毒株，說(shuō)明PDCoV早于首次發(fā)現(xiàn)時(shí)就已存在于中國(guó)豬群；吳美洲等[15]對(duì)2014年11月至2015年5月之間采集的我國(guó)3個(gè)省的10個(gè)豬場(chǎng)的64份樣品進(jìn)行了檢測(cè)，PDCoV的檢測(cè)率為23.4%；2015年3月Song等[16]對(duì)我國(guó)江西省進(jìn)行調(diào)查，PDCoV的檢測(cè)率已經(jīng)達(dá)到33.1%。作為新發(fā)型傳染性病原，需要高度重視和立即加強(qiáng)對(duì)PDCoV的研究，降低養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)的損失和威脅。

PDCoV為有囊膜的單鏈正股RNA病毒，已測(cè)定的PDCoV全基因組序列大小約為25.4 kb，是目前已知冠狀病毒中基因組最小的[16]。共編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白，即纖突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白 (M)、核衣殼蛋白(N)和4種非結(jié)構(gòu)蛋白。PDCoV的基因組構(gòu)成和排列順序：5′非編碼區(qū) (5′UTR)、開放閱讀框 1a /1b、S、E、M、非結(jié)構(gòu)蛋白NS6、N、非結(jié)構(gòu)蛋白NS7、3′非編碼區(qū)(3′UTR)[17]。目前PDCoV的蛋白功能研究較少，根據(jù)其他冠狀病毒的研究結(jié)果推測(cè)PDCoV的S蛋白在誘導(dǎo)中和抗體[18]、病毒識(shí)別宿主和決定病毒毒力等方面[19]發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。Thachil等[20]利用真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)PDCoV的S蛋白，成功建立了檢測(cè)PDCoV的ELISA方法，該方法的敏感性與特異性分別達(dá)到91%、95%，間接證實(shí)S蛋白具有良好的反應(yīng)性。本研究克隆了PDCoV的S1基因，在生物信息學(xué)分析基礎(chǔ)上，將抗原表位預(yù)測(cè)區(qū)域Sa插入大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)，提純蛋白免疫新西蘭大白兔制備了兔抗Sa蛋白高免血清，證明原核表達(dá)的Sa蛋白具有良好的抗原性和免疫原性，為開展S蛋白的應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 大腸桿菌DH5α和Rosetta(DE3)；pMD19-T質(zhì)粒、pET22b(+)原核載體由實(shí)驗(yàn)室保存；PDCoV陽(yáng)性病料由本實(shí)驗(yàn)室保存；兩月齡雌性新西蘭兔購(gòu)自簡(jiǎn)陽(yáng)達(dá)碩動(dòng)物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑、材料 PrimeScript RT reagent Kit、HindⅢ、T4DNA ligase均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；Mouse anti-His單克隆抗體、HRP-羊抗兔二抗、弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑均購(gòu)自Sigma公司；PVDF膜購(gòu)自Millipore公司。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(P0012S)購(gòu)自碧云天公司；普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒(DP204)購(gòu)自天根生化科技有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司。

1.2 方法

1.2.1S1基因的克隆 以本實(shí)驗(yàn)室保存的PDCoV陽(yáng)性病料為材料，提取病毒總RNA。采用PrimeScript RT reagent Kit合成單鏈cDNA,取1 μL產(chǎn)物采用克隆引物(參考CH/Sichuan/S27/2012；GenBank:KT266822.1)進(jìn)行擴(kuò)增，上游引物：5′-ATGCAGAGAGCTCTATTGATTATGAC-3′；下游引物：5′-ATAAAAGAAAGTAGGTGTGACAATAG-3′，目的片段大小為1 566 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后克隆至pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α中進(jìn)行氨芐抗性篩選，重組大腸桿菌進(jìn)行菌落PCR鑒定和序列測(cè)定。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 通過(guò)Edit Seq分析測(cè)序結(jié)果的開放閱讀框、蛋白編碼、蛋白分子量及等電點(diǎn)。用在線軟件signalP3.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析S1蛋白信號(hào)肽序列，軟件分別運(yùn)用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型(neural networks，NN) 和隱馬爾可夫模型(hiddenMarkov models，HMM)。利用在線軟件TMHMM Server v. 2.0(http://genome.cbs.dtu.dk/services/ TMH-MM-2.0/)分析S1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)。利用DNAStar軟件中的Protean軟件提供的模塊，用Chou-Fasman和Gamier-Rob-son 法分析S1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、用 Kyte-Doolit-tle 法分析S1的親水性，用Karplus-Schulz法分析S1的柔性區(qū)域，用Emini法分析S1蛋白的表面可能性。利用DNAStar 軟件中的Protean提供的模塊，采用Jameson-Wolf法分析鼠S1蛋白的B細(xì)胞表位。

1.2.3Sa基因引物的設(shè)計(jì)及其片段的擴(kuò)增 參考生物信息軟件預(yù)測(cè)結(jié)果，設(shè)計(jì)一對(duì)單酶切同源重組連接表達(dá)載體的特異性引物,上游引物：5′-agtgcggccgcaagcttCATAAACCCACGAGTAATTCCA CC-3′,下游引物：5′-gagctccgtcgacaagcttATCAGTGATTACACTAGAAGTGTCT-3′(HindⅢ)，擴(kuò)增Sa基因106—1 290 bp(36—430 aa),目的片段為1 188 bp,以pMD19-T-S1質(zhì)粒為模板對(duì)Sa基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序：98 ℃ 5 min；98 ℃ 15 s；57 ℃ 15 s；72 ℃ 40 s; 34個(gè)循環(huán)；72 ℃ 8 min，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.4Sa基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建與重組蛋白的表達(dá) PCR產(chǎn)物純化后參照ClonExpressⅡ同源重組克隆試劑盒使用說(shuō)明書與使用HindⅢ限制性內(nèi)切酶處理的pET-22b(+)表達(dá)載體進(jìn)行連接。連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，陽(yáng)性克隆菌落PCR鑒定和上海生工測(cè)序。質(zhì)粒少量提取試劑盒提取測(cè)序正確的pET22b-Sa重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)Rosetta(DE3)菌株。挑取經(jīng)PCR驗(yàn)證的陽(yáng)性菌落，接種至6 mL含120 mg·L-1Amp LB液體培養(yǎng)基的試管中37 ℃、220 r·min-1搖至OD600 nm=0.6，加IPTG至終濃度為0.8 mmol·L-1，37 ℃、220 r·min-1誘導(dǎo)表達(dá)5 h。于誘導(dǎo)表達(dá)后取菌液5 mL，離心得菌體，加入SDS-PAGE上樣緩沖液,煮沸8 min，12%SDS-PAGE分析，同時(shí)取空質(zhì)粒菌液誘導(dǎo)5 h的產(chǎn)物作為對(duì)照。

參考上述方法，取未誘導(dǎo)陽(yáng)性菌液1 mL接種至200 mL含120 mg·L-1Amp LB液體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，37 ℃、220 r·min-1培養(yǎng)至OD600nm=0.6～0.8,加入IPTG至終濃度為0.8 mmol·L-1,誘導(dǎo)表達(dá)5 h；12 000 r·min-1離心10 min，菌體用50 mmol·L-1Tris-HCl進(jìn)行重懸，采用超聲破碎的方法，離心后收集上清和沉淀。樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，經(jīng)5%脫脂乳封閉，以Mouse anti-His單克隆抗體(1∶5 000)為一抗，羊抗鼠HRP-IgG(1∶7 000)為二抗，通過(guò)DAB底物顯色進(jìn)行Western blot鑒定。

1.2.5 Sa蛋白的純化 對(duì)含有目的蛋白的上清液，12 000 r·min-1離心10 min，之后采用0.22 μm濾膜過(guò)濾、超濾柱濃縮、Ni柱親合層析純化的方法進(jìn)行純化，純化后的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定。

1.2.6 兔抗Sa蛋白多克隆抗體的制備 使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定Sa蛋白濃度(3.938 mg·mL-1)，并把蛋白濃度定至 1 mg·mL-1，與等體積的弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑乳化，免疫新西蘭兔(表1)，制備兔抗Sa蛋白多克隆抗體。免疫前耳靜脈采集血液，間接ELISA測(cè)定抗體效價(jià)。四免10 d后經(jīng)心臟采血，分離血清，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 兔抗Sa蛋白多克隆抗體效價(jià)的測(cè)定 以純化的Sa蛋白為包被抗原，37 ℃1 h包被ELISA板 (0.2 μg·孔), PBST洗滌3次 (5 min·次-1, 下同) 后用5%的脫脂奶粉37 ℃封閉1.5 h, PBST洗滌3次, 以兔抗Sa蛋白多克隆抗體為一抗 (1∶1 000～1∶12 800), 37 ℃孵育1 h, PBST洗滌3次,加入HRP標(biāo)記羊抗兔IgG(1∶5 000), 37 ℃孵育1 h, PBST洗滌3次后加入TMB顯色底物, 顯色10 min后加入終止液, 酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值。以免疫血清OD450 nm值與陰性對(duì)照血清OD450 nm的比值≥2.1 為陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)，判定制備的兔抗Sa蛋白多克隆抗體的最低檢出效價(jià)。

表1免疫程序

Table1Immuneprogram

免疫Immune免疫原Immunogen免疫劑量/μgImmunizationdose免疫途徑Immuneroute初次免疫(0d)Sa蛋白+弗氏完全佐劑720背部皮下多點(diǎn)注射二次免疫(初免后10d)Sa蛋白+弗氏不完全佐劑720背部皮下多點(diǎn)注射三次免疫(初免后20d)Sa蛋白+弗氏不完全佐劑720背部皮下多點(diǎn)注射四次免疫(初免后30d)Sa蛋白+弗氏不完全佐劑720背部皮下多點(diǎn)注射

1.2.8 兔抗Sa蛋白多克隆抗體免疫活性的鑒定 將純化得到的蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)印到PVDF膜上,然后用5%脫脂奶粉于37 ℃封閉1 h，TBST漂洗3次，用采集到的兔多抗血清稀釋(1∶200)后作為一抗孵育過(guò)夜，TBST洗3次，HRP-IgG(羊抗兔)二抗(1∶7 000倍)孵育1 h，TBST洗滌3次，最后加入底物(DAB)，反應(yīng)5～15 min，觀察顯色情況；對(duì)PVDF膜上的條帶進(jìn)行照相及分析。

2 結(jié) 果

2.1 PDCoV-S1基因的克隆

利用克隆型特異性引物對(duì)PDCoV-S1基因進(jìn)行RT-PCR，擴(kuò)增出了大小約為1 566 bp的cDNA片段，其長(zhǎng)度與預(yù)期大小相一致(圖1)。

M. DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～2. S1基因擴(kuò)增產(chǎn)物； 3.陰性對(duì)照M.DNA marker DL2000;1-2. RT-PCR product of S1 gene；3. Control

圖1 S1基因的RT-PCR擴(kuò)增Fig.1 Amplification of S1 gene by RT-PCR

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1S1基因的序列分析 本研究克隆得到PDCoV的S1基因(GenBank No.:KY398009)。經(jīng)Edit Seq分析表明,S1的cDNA序列含有一個(gè)完整1 566 bp的開放閱讀框, 編碼522個(gè)氨基酸,堿基組分分別為A共418個(gè)堿基(26.7%)，C共379的堿基(24.2%)，G共275個(gè)堿基(17.6%)，T共494個(gè)堿基(31.5%)。氨基酸的等電點(diǎn)為6.15，蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量為57.8 ku。通過(guò)與CH/Sichuan/S27/2012毒株S1基因進(jìn)行比對(duì)，僅有堿基位點(diǎn)突變存在，沒(méi)有堿基的插入與缺失。

2.2.2 S1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)的分析 SignalP4.1軟件分析信號(hào)肽切割位點(diǎn)，預(yù)測(cè)方法為神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(neural network)，結(jié)果顯示(圖2A)該蛋白序列含有一個(gè)信號(hào)肽切割位點(diǎn)，位于19、20位氨基酸之間(KFA19-D20D)。將推導(dǎo)的蛋白氨基酸序列運(yùn)用TMHMM server軟件預(yù)測(cè)跨膜區(qū)，分析結(jié)果(圖2B)表明該蛋白非跨膜蛋白。

2.2.3 S1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) Chou-Fasman 法預(yù)測(cè)S1蛋白α螺旋結(jié)果顯示，S1蛋白骨架可形成多個(gè)α螺旋，位置分別在第18—20、36—40、231—240、289—290、300—302、321—324、341—344 區(qū)段；用 Gamier-Robson法預(yù)測(cè)的α螺旋結(jié)構(gòu)較Chou-Fasman方法預(yù)測(cè)的數(shù)量少，但結(jié)果基本一致(圖3A)。Kyte-Doolittle 法分析S1的親水性結(jié)果顯示，S1蛋白分子親水性區(qū)域的分布不均勻，親水區(qū)域占整個(gè)蛋白的多數(shù)部分，為親水蛋白 (圖3B)。Karplus-Schulz法分析S1的柔性區(qū)域結(jié)果顯示，S1蛋白含有較多的柔性區(qū)域，主要集中在蛋白第 19—21、36—50、58—64、68—76、82—88、94—98、106—111、123—124、136—138、146—150、158、168—170，174—177、182—185、191—196、201—204、225—228、242—243、249—255、260—263、270—274、282—286、290—294、298—303、320區(qū)域(圖3C)。Emini法對(duì)S1蛋白表面可能性預(yù)測(cè)的結(jié)果顯示，S1蛋白的氨基酸表面可能性區(qū)域主要是第2—7、10—12、46—50、55—63、84—89、120—124、130—135、180—191區(qū)段，其他區(qū)段展示的表面可能性較小或表現(xiàn)為負(fù)值(圖3D)

圖2 S1蛋白的信號(hào)肽分析(A)和跨膜區(qū)域分析(B)Fig.2 Signal peptide analysis of S1 protein(A) and transmembrane domain analysis (B)

2.2.4 S1蛋白B細(xì)胞表位的預(yù)測(cè) Jameson-Wolf法分析S1蛋白潛在的抗原表位位點(diǎn)結(jié)果顯示，S1蛋白存在15個(gè)潛在的B細(xì)胞抗原表位，主要集中于40—460 aa的位置。與CH/Sichuan/S27/2012株S1蛋白相比，都具有15個(gè)抗原，存在抗原表位氨基酸的變異：37—40 aa由KPTS變?yōu)镵LTS(圖3E)。

2.3 重組原核表達(dá)載體pET22b-Sa的鑒定

隨機(jī)挑取數(shù)個(gè)Rosetta(DE3)單菌落，經(jīng)PCR驗(yàn)證其在1 200 bp左右出現(xiàn)特異條帶(圖4)，其結(jié)果與預(yù)期相符。菌液擴(kuò)大培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒送生工生物(上海)股份有限公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果與目的基因一致，說(shuō)明外源基因已成功轉(zhuǎn)化至大腸桿菌受體菌株中。

A. 蛋白α螺旋結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)(Chou-Fasman 法與Gamier-Robson法)；B. 蛋白親水性的預(yù)測(cè)(Kyte-Doolittle 方法)；C. 蛋白的柔性區(qū)域的預(yù)測(cè)(Karplus-Schulz 方法)；D. 蛋白表面可能性的預(yù)測(cè)(Emini方法)；E. 蛋白潛在抗原表位的預(yù)測(cè)(Jameson-Wolf方法)A. α-Helix prediction (Gamier-Robson and Chou-Fasman models); B. Hydrophilicity prediction (Kyte-Doolittle model); C. Flexible regions prediction (Karplus -Schulz model); D. Surface probability prediction (Emini model); E. Antigenic prediction (Jameson-Wolf model)

圖3 S1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析Fig.3 The secondary structure prediction of S1 protein

M. DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～3. Rosetta菌液樣品 ；4. 陰性對(duì)照；5. 陽(yáng)性對(duì)照M. DL2000 DNA marker；1-3. Bacteria samples；4. Negative control；5. Positive control

圖4 PDCoV Sa基因鑒定結(jié)果Fig.4 Identification results of PDCoV Sa gene

2.4 Sa基因原核表達(dá)產(chǎn)物的鑒定

誘導(dǎo)后，目的蛋白在pET22b-Sa上清與包涵體中均有表達(dá)，相對(duì)分子質(zhì)量約為46 ku(圖5)，將重組Sa蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)，結(jié)果顯示，pET22b-Sa上清蛋白和包涵體蛋白均在46 ku處有一條目的條帶(圖6)，說(shuō)明重組蛋白能與Anti-His-tag反應(yīng)。

M. 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. 空載 2. 誘導(dǎo)前；3. 誘導(dǎo)后全菌；4. 上清；5. 包涵體M. Protein marker; 1：Rosetta (DE3) light；2：pET22b-Sa not induced; 3. All bacteria after induction; 4. The supernatant fluid protein; 5. Inclusion body protein

圖5 重組蛋白質(zhì)可溶性分析Fig.5 Soluble analysis of Recombinant protein

2.5 Sa重組蛋白的純化

將上清蛋白離心超濾之后經(jīng)Ni親和層析柱純化得到純度較高的Sa蛋白(圖7)。

2.6 多克隆抗體的制備

兔抗S1蛋白的血清進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)時(shí)，免疫血清OD450 nm值與陰性對(duì)照血清OD450 nm的比值≥2.1為陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)計(jì)算，此研究制備的兔抗血清效價(jià)為1∶10 240(圖8),為了檢驗(yàn)所制備抗體的特異性，利用純化后的pET22b-Sa重組蛋白，經(jīng)Western blot 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)所制備的陽(yáng)性抗血清組在46 ku處存在特異條帶；同時(shí)，以陰性血清作為陰性對(duì)照，未見條帶(圖9)，這說(shuō)明所制備的抗血清具有較好的特異性。

M. 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.空載；2.誘導(dǎo)前；3.誘導(dǎo)后包涵體；4.誘導(dǎo)后上清；5.誘導(dǎo)后全菌M. Protein marker; 1. Rosetta (DE3) light; 2. pET22b-Sa not induced; 3. Inclusion body protein; 4. The supernatant fluid protein; 5. All bacteria after induction

圖6 Sa蛋白的Western blot鑒定(His單克隆抗體)Fig.6 Detection of recombinant protein Sa by Western blot(His mAb)

M. 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.全菌；2. 上清；3. 包涵體；4. 洗脫峰1；5. 洗脫峰2；6. 純化后蛋白M. Protein marker; 1. The total bacteria liquid; 2. Protein in solution; 3. Inclusion body protein; 4. Elution peak for the first time; 5. The second elution peak; 6. Purified protein

圖7 重組蛋白的純化結(jié)果Fig.7 Purification of recombinant protein

圖8 間接ELISA方法檢測(cè)兔抗S1蛋白多克隆抗體的效價(jià)Fig.8 In-ELISA analysis of positive samples

M. 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. 陽(yáng)性血清；2. 陰性血清M. Protein marker; 1. Positive antiserum；2. Negative antiserum

圖9 多克隆抗體特異性鑒定Fig.9 Polyclonal antibody specificity identification

3 討 論

PDCoV作為一種新發(fā)型病毒性腹瀉的致病原，可單獨(dú)感染仔豬，也可與PEDV、TGEV、PoRV混合感染[21]，引起患病仔豬的死亡，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的損失。S蛋白作為冠狀病毒的纖突糖蛋白，在病毒侵襲宿主，決定病毒毒力等方面發(fā)揮作用[22]。目前對(duì)于PDCoVS基因及功能的研究還十分有限，根據(jù)其他豬冠狀病毒的研究報(bào)道得知，冠狀病毒S蛋白缺乏水解位點(diǎn)不能被切割，N端的抗原表位區(qū)S1區(qū)主要是病毒與細(xì)胞受體結(jié)合的功能區(qū)[23]，C端的膜融合區(qū)域S2區(qū)與膜融合有關(guān)[24]?？梢酝茰y(cè)PDCoV的S1蛋白包含主要的中和位點(diǎn)以及刺激宿主細(xì)胞產(chǎn)生中和抗體的能力[3]。針對(duì)PDCoVS1基因在不同毒株間變異性較大的特點(diǎn)[25]，通過(guò)對(duì)S1基因的序列測(cè)定，可以作為診斷鑒別不同毒株的依據(jù)。本研究成功擴(kuò)增出了S1基因，序列全長(zhǎng)1 566 bp，編碼522個(gè)氨基酸，通過(guò)與NCBI公布的CH/Sichuan/S27/2012株S1基因相比，雖然在基因序列方面，兩株病毒S1基因存在較多點(diǎn)突變，但在B細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，兩蛋白在抗原表位上基本一致沒(méi)有差異，除此之外，它們的糖基化位點(diǎn)也基本一致，證明該病毒在四川的流行并沒(méi)有發(fā)生變異。由結(jié)果“2.2.4”對(duì)PDCoV CHN-SC2015株S1蛋白的抗原表位預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白的抗原表位主要集中Sa區(qū)域，綜合其他冠狀病毒屬成員[26]如PEDV的S蛋白抗原表位分布在不含信號(hào)肽切割位點(diǎn)的非跨膜區(qū)域，最終選擇了CHN-2015株S1蛋白的36—430 aa殘基用以表達(dá)，該蛋白的氨基酸序列均位于S1區(qū)域并且不含有信號(hào)肽切割位點(diǎn)；目前對(duì)于PDCoVS基因及蛋白的結(jié)構(gòu)與功能尚不明確，PDCoV的檢測(cè)技術(shù)還不完善，因此對(duì)S蛋白深入研究在該病的治療和預(yù)防等方面有應(yīng)用前景。本研究中證實(shí)Sa(36—430 aa)蛋白存在抗原表位，但不能定義PDCoV抗原表位的準(zhǔn)確位置，需要進(jìn)一步通過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證。

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有操作簡(jiǎn)單、周期短、價(jià)格低、獲得量高等優(yōu)點(diǎn)，且人們對(duì)其基因背景、表達(dá)特征的了解比較清楚。雖然存在一些缺陷，如沒(méi)有翻譯后加工的功能，以及表達(dá)的蛋白沒(méi)有足夠的生物學(xué)活性，但表達(dá)產(chǎn)物在與功能活性無(wú)關(guān)的免疫性質(zhì)研究中較為理想，故仍然是目前最受歡迎的異源表達(dá)系統(tǒng)之一[27]。有研究指出，糖基化蛋白不易于原核表達(dá)，根據(jù)宿主對(duì)密碼子的偏愛性優(yōu)化cDNA 密碼子，提高靶蛋白表達(dá)水平[28]。試驗(yàn)中pET22b-Sa表達(dá)載體轉(zhuǎn)入Rosetta感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)的表達(dá)量不是很高，可能與病毒蛋白本身特性有關(guān)，可考慮密碼子優(yōu)化或更換能優(yōu)于pET-22b(+)的載體用以表達(dá)病毒蛋白。在運(yùn)用間接ELISA的方法檢測(cè)多抗血清的效價(jià)時(shí)，Sa蛋白包被時(shí)間不夠?qū)е聹y(cè)定的多抗效價(jià)明顯偏低，所以在測(cè)定多抗效價(jià)過(guò)程中應(yīng)該提前優(yōu)化測(cè)定的條件，防止出現(xiàn)數(shù)值的偏差。

通過(guò)SDS-PAGE分析證實(shí)了重組蛋白主要以上清的形式表達(dá), 使用該重組蛋白作為免疫原免疫健康雌性新西蘭大白兔, 成功制備了抗Sa蛋白多克隆抗體, 并且以該抗體為一抗進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析, 證實(shí)了Sa蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為46 ku, 以上這些研究結(jié)果一方面證明了S1基因抗原表位預(yù)測(cè)區(qū)Sa蛋白具有抗原性, 另一方面也為我們將來(lái)進(jìn)一步研究Sa蛋白的結(jié)構(gòu)和功能奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

克隆了PDCoV的S1基因，在生物信息學(xué)分析基礎(chǔ)上，將抗原表位預(yù)測(cè)區(qū)域Sa插入大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)，提純蛋白免疫新西蘭大白兔制備了兔抗Sa蛋白高免血清，證明原核表達(dá)的Sa蛋白具有良好的抗原性和免疫原性，間接確定該區(qū)域存在PDCoV的抗原表位，為開展S蛋白的應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。

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