王隆柏，王晨燕，吳學(xué)敏，陳秋勇，車勇良，陳如敬，周倫江(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/福建省畜禽疫病防治工程技術(shù)研究中心，福州 350013)

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的急性、高度接觸性的腸道疾病，主要導(dǎo)致各階段發(fā)病豬群腹瀉、嘔吐、脫水或死亡，是目前導(dǎo)致哺乳仔豬發(fā)生腹瀉死亡的全球性疫病之一[1-2]。該病自1978年英國首次報(bào)道[3]，隨后世界各國均有發(fā)生。我國于1980年首次報(bào)道PED，并陸續(xù)有該病的發(fā)生。從2007年以來，因PEDV的基因發(fā)生了變異，PEDV又開始在泰國、韓國和越南等國家流行，隨后蔓延至日本、中國、加拿大和美國等養(yǎng)豬國家[4-6]，導(dǎo)致該病再次暴發(fā)，席卷全球。由于該病來勢(shì)兇猛，且臨床癥狀比以往更為嚴(yán)重，哺乳仔豬的發(fā)病率高達(dá)100%，死亡率在80%以上，尤其是對(duì)7日齡以內(nèi)的仔豬危害嚴(yán)重[7]，死亡率高達(dá)100%。PEDV為冠狀病毒科，冠狀病毒屬的成員，主要含有4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，分別為S、M、N及E蛋白。雖然M和N基因相對(duì)比較保守，但與經(jīng)典毒株CV777以及早些年份的毒株相比較，其氨基酸也發(fā)生了部分變異，遺傳進(jìn)化樹也不在一個(gè)分支上[8-11]。目前，已見利用經(jīng)典PEDV的單個(gè)基因(如N、M及S1基因片段)，表達(dá)出單基因蛋白[1，12]，并測(cè)定出蛋白具有免疫原性。在雙基因表達(dá)方面，未見通過變異PEDV的M和N基因片段，利用原核表達(dá)載體，通過無縫克隆技術(shù)，構(gòu)建出PEDV的pE2-S-N的融合雙基因原核表達(dá)質(zhì)粒。因此，一種構(gòu)建PEDV的M-N融合雙基因表達(dá)載體方法的建立，對(duì)今后開展該病的診斷技術(shù)和免疫研究，具有重要意義和應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

RNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、pEASY-Blunt E2(pE2)原核表達(dá)載體、pEASY-UniSeamless Cloning and Assembly Kit、dNTPs、FastPfu Fly DNA Polymerase、5×TransStart KD Plus Buffer、TransStart KD Plus DNA Polymerase、Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞、轉(zhuǎn)染試劑等主要試劑均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；羊抗兔IgG-HRP酶和羊抗鼠IgG-HRP酶購自武漢博士德；BLAB/c鼠購自吳氏試驗(yàn)動(dòng)物公司；10%分離膠和轉(zhuǎn)印膜購自碧云天公司；變異PEDV-FJFQ2014毒株(GenBank登陸號(hào)KJ646580)、M蛋白高免血清、N蛋白高免血清及PEDV兔抗高免血清由本科室制備保存。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)變異PEDV 的M、N基因片段，結(jié)合pE2表達(dá)載體的引物序列，設(shè)計(jì)合成引物序列，具體見表1。

表1引物序列

Table1Thesequenceofprimer

片段Fragment引物序列(5′→3′)Sequenceofprimer退火溫度/℃Annealingtemperature片段大小/bpSizeoffragmentsM上引M?F：ATGTCTAACGGTTTTATTCC55678下引M?R：GACTAAATGAAGCACTTTCTM+E2上引E2?F：AAGGGCCAATTCCTCGAGCAC606071下引E2?R：GACTAAATGAAGCACTTTCTN(引物包含載體部分同源臂)上引N?F：GAGAAAGTGCTTCATTTAGTCGCTTCTGTCAGCTTTCAGGAT55 551359下引N?R：TGCTCGAGGAATTGGCCCTTATTTCCTGTATCGAAGATCTC

1.2.2 RNA提取及RT反應(yīng) 按常規(guī)方法采用商品化試劑盒提取變異PEDV的RNA。以提取PEDV的RNA為模板，進(jìn)行RT反應(yīng)，反應(yīng)條件為25 ℃ 10 min；50 ℃ 30 min；85 ℃ 5 s。

1.2.3M基因和N基因PCR擴(kuò)增 按常規(guī)方法，以cDNA為模板，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增M基因片段的反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。擴(kuò)增N基因片段的反應(yīng)條件為94 ℃ 10 min；94 ℃ 3 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物均通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.4M基因克隆至E2載體 參考說明書進(jìn)行。連接體系如下：M片段2.0 μL，Blunt-E2載體1.0 μL，使用ddH2O補(bǔ)齊體積至5.0 μL，25 ℃連接10 min；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈混勻，冰浴30 min；42 ℃熱激30 s，立即置于冰上2 min；加入平衡至室溫的LB培養(yǎng)基，250 r·min-1，37 ℃培養(yǎng)1 h；4 000 r·min-1離心1 min，棄部分上清，保留100 μL，輕彈重懸后涂于Amp+抗性平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜，構(gòu)建出pE2-M質(zhì)粒。

1.2.5E2-M基因PCR擴(kuò)增 以pE2-M質(zhì)粒為模板，反應(yīng)體系與“1.2.3”相同，進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件：94 ℃ 10 min；94 ℃ 3 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.6 純化片段 采用回收和純化試劑盒，分別膠回收純化PCR擴(kuò)增的N片段和PCR擴(kuò)增的E2-M片段。

1.2.7 無縫拼接 參考pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit無縫拼接試劑盒說明書進(jìn)行。連接體系如下：2×Assembly Mix 5 μL,純化回收N片段2 μL,純化回收E2-M片段3 μL；于PCR儀中50 ℃連接15 min。

1.2.8 構(gòu)建pE2-M-N重組質(zhì)粒 將N基因片段和E2-M基因片段連接產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)化Trans 1-T1感受態(tài)細(xì)胞中，42 ℃熱激30 s，冰上靜置2 min，加入400 μL LB培養(yǎng)基中，37 ℃ 200 r·min-1搖菌1 h；取搖好的菌液4 000 r·min-1離心1 min后棄部分上清，取菌株吹懸后涂于Amp+抗性的LB平板上，在37 ℃培養(yǎng)箱里培養(yǎng)過夜；18 h后從培養(yǎng)箱中取出平板，隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化至Trans1-T1感受態(tài)，菌落PCR鑒定陽性單克隆測(cè)序。取活菌經(jīng)過活化后轉(zhuǎn)接入LB氨芐抗性培養(yǎng)基，放入搖床37 ℃ 200 r·min-1培養(yǎng)16 h后，收集菌液提取質(zhì)粒。

1.2.9 原核蛋白表達(dá)及鑒定 取pE2-M-N質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Transetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，將克隆菌種分別按照37 ℃(加0.25 μg·mL-1IPTG)、16 ℃(0.25 μg·mL-1IPTG)溫度搖床培養(yǎng),表達(dá)融合蛋白。將菌液12 000 r·min-1離心5 min，將上清移入新的EP管中，沉淀用500 μL的1×PBS重懸，分別取50 μL上清和50 μL沉淀重懸液，加入10 μL 蛋白上樣緩沖液，煮沸10 min。將蛋白樣品跑10% SDS-PAGE，之后進(jìn)行考染，鑒定表達(dá)蛋白情況。

1.2.10 Western blot驗(yàn)證目的蛋白 以PEDV的兔抗高免血清為一抗，羊抗兔IgG-HRP酶為二抗，進(jìn)行Western blot試驗(yàn)，采用化學(xué)發(fā)光成像儀進(jìn)行檢測(cè)。分別以PEDV的M蛋白和N蛋白鼠抗高免血清為一抗，羊抗鼠IgG-HRP酶為二抗，進(jìn)行Western blot試驗(yàn)，采用化學(xué)發(fā)光成像儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.11 鼠抗M-N融合蛋白抗體的制備及活性檢測(cè) 將誘導(dǎo)融合蛋白進(jìn)行純化，與弗氏完全佐劑充分乳化后，以100 μg·只-1的劑量皮下多點(diǎn)接種6只8周齡小鼠，間隔14 d后，將融合蛋白與弗氏不完全佐劑充分乳化后，以同樣的方式及劑量進(jìn)行再次免疫。在第二次免疫21 d后，采小鼠血并分離血清。同時(shí)設(shè)立2只小鼠免疫生理鹽水，作為陰性對(duì)照。分別采用純化的PEDV、M蛋白和N蛋白包被的酶標(biāo)板，采用ELISA方法檢測(cè)融合蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體水平。

2 結(jié) 果

2.1 M基因的PCR擴(kuò)增

以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得約678 bp的基因片段，與預(yù)期大小相符，如圖1。

1. M基因片段；M. DL8000相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1. Fragment of M gene; M. DL8000 marker

圖1 M基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Colony PCR confirmation of M gene

2.2 N基因的PCR擴(kuò)增

以cDNA為模板，進(jìn)行N基因PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得1 359 bp的基因片段，與預(yù)期大小相符，如圖2。

2.3 E2-M基因的PCR擴(kuò)增

以M基因片段連接至pE2載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中，再以pE2 -M質(zhì)粒為模板，進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得6 071 bp目的片段，與預(yù)期大小相符，如圖2。

1. N基因片段；2、3. E2-M基因片段；M. DL8000相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1. Fragment of N gene； 2, 3. Fragment of E2-M gene；M. DL8000 marker

圖2 E2-M和N基因片段擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Colony PCR confirmation of E2-M and N gene

2.4 M+N基因的PCR鑒定

將N基因和E2-M基因連接產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)化Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中，構(gòu)建出pE2-M-N重組質(zhì)粒，采用PCR技術(shù)進(jìn)行鑒定，獲得大約為2 037 bp基因片段，與預(yù)期大小相符，如圖3。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定比對(duì)分析，表明擴(kuò)展序列與PEDV-FJFQ2014毒株相應(yīng)序列的相似性為99.4%。

1～7 . M+N基因片段； M. DL8000 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1-7. Fragment of M-N gene； M. DL8000 marker

圖3 pE2-M-N重組質(zhì)粒PCR鑒定電泳圖Fig.3 Colony PCR confirmation of pE2-M-N

2.5 原核蛋白的表達(dá)

pE2-M-N重組質(zhì)粒在0.25 μg·mL-1IPTG的誘導(dǎo)下，轉(zhuǎn)化Transetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，在37和16 ℃誘導(dǎo)下蛋白均表達(dá)，蛋白條帶大小約75 ku，與預(yù)期相符，如圖4。誘導(dǎo)目的蛋白在上清和包涵體中均有表達(dá)，但主要是在沉淀的包涵體表達(dá)量比較多。

1. 未誘導(dǎo)的上清； 2. 37 ℃誘導(dǎo)下的上清； 3. 37 ℃誘導(dǎo)下的沉淀；4. 16 ℃誘導(dǎo)下的上清；5 .16 ℃誘導(dǎo)下的沉淀；M. 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1. Not revulsive supernatant; 2 . Revulsive supernatant at 37 ℃; 3.Revulsive precipitation at 37 ℃ ; 4.Revulsive supernatant at 16 ℃; 5. Revulsive precipitation at 16 ℃; M. Protein marker

圖4 SDS-PAGE電泳圖Fig.4 The SDS-PAGE of protein expressed in Transetta (DE3)

2.6 M-N表達(dá)蛋白的純化

采用包涵體洗滌方法對(duì)提取蛋白質(zhì)進(jìn)行純化后，取蛋白質(zhì)再次進(jìn)行SDS-PAGE試驗(yàn)，結(jié)果獲得約75 ku的蛋白片段，如圖5。

1. 誘導(dǎo)后上清；2.誘導(dǎo)后的沉淀；M.蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1. Revulsive supernatant；2.Revulsive precipitation；M. Protein marker

圖5 SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)結(jié)果Fig.5 The SDS-PAGE of protein expressed in Transetta(DE3)

2.7 驗(yàn)證目的蛋白的表達(dá)情況

以兔抗PEDV高免血清為一抗， 通過Western blot試驗(yàn)表明，獲得約75 ku的目的片段，與預(yù)期大小相符，說明表達(dá)蛋白能與病毒抗體反應(yīng)，具有反應(yīng)原性，如圖6。

1.表達(dá)的蛋白； M.蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1. Expressed protein； M.Protein marker

圖6 以兔抗PEDV高免血清為一抗用Western blot驗(yàn)證蛋白表達(dá)Fig.6 The Western blot of protein expressed in Transetta (DE3) with hyperimmume serum against PEDV

分別以PEDV的M蛋白和N蛋白鼠抗高免血清為一抗，通過Western blot試驗(yàn)表明，分別獲得約25和57 ku大小的目的片段，與預(yù)期大小相符，說明表達(dá)蛋白能與病毒的M蛋白抗體和N蛋白抗體反應(yīng)，具有反應(yīng)原性，見圖7。

1.M蛋白高免血清組；2. N蛋白高免疫血清組； M.蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1. Hyperimmune serum group of M protein；2. Hyperimmune serum group of N protein; M.Protein marker

圖7 以PEDV M、N蛋白高免血清為一抗用Western blot驗(yàn)證蛋白表達(dá)Fig.7 The Western blot of protein expressed in Transetta (DE3) with hyperimmune sera against M and N protein of PEDV

2.8 鼠抗M-N融合雙基因蛋白抗體的獲得及活性檢測(cè)

在M-N融合蛋白二免小鼠21 d后，免疫小鼠血清能與PEDV全病毒、M蛋白和N蛋白發(fā)生反應(yīng)，且相應(yīng)的效價(jià)均在1∶1 000以上，而陰性對(duì)照小鼠血清未檢測(cè)到相應(yīng)抗體，表明融合蛋白具有較好的免疫活性，見圖8。

圖8 抗體產(chǎn)生情況Fig.8 The situation of generated antibody

3 討 論

PEDV屬于尼多病毒目、冠狀病毒科冠狀病毒屬成員，病毒核酸為正義單鏈RNA，PEDV基因組全長約為28 kb[17]，主要結(jié)構(gòu)蛋白為纖突糖蛋白(S蛋白)、核衣殼蛋白(N蛋白)、膜蛋白(M蛋白)和小膜蛋白(E蛋白)[18-19]。PEDV的M基因編碼整合膜蛋白，是一種穿膜糖蛋白，從N端到C端有3個(gè)糖基化位點(diǎn)，通過其C末端與核衣殼結(jié)合可使核衣殼和病毒包膜聯(lián)系在一起[20]，從而決定和影響了病毒的出芽。另外，M蛋白能介導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生α干擾素，可作為PEDV基因工程疫苗的候選抗原，并已成為開展PEDV血清學(xué)診斷抗原的主要蛋白之一。N蛋白與基因組RNA結(jié)合, 形成螺旋狀的核蛋白體, 參與病毒基因組轉(zhuǎn)錄、RNA 的包裝、病毒組裝，也是病毒主要的免疫原蛋白之一，可誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答[21]。另外，由于N蛋白具有抗原性，在PEDV感染早期就能在豬體內(nèi)產(chǎn)生較高水平的抗體并誘導(dǎo)病豬體內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞免疫反應(yīng)[22]?；贛和N基因?yàn)椴《镜闹匾δ芑?，在體外通過生物技術(shù)把M與N基因進(jìn)行雙基因融合，并表達(dá)出相應(yīng)的融合蛋白，對(duì)今后開展該病的診斷技術(shù)和免疫機(jī)制研究，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和應(yīng)用前景。

本文選用pE2哺乳動(dòng)物原核表達(dá)載體，該載體為平末端線性載體，載體兩端偶聯(lián)有拓?fù)洚悩?gòu)酶，此酶具有限制性內(nèi)切酶和連接酶的功能，因此在構(gòu)建載體時(shí)，只需將載體和特異性片段在25 ℃孵育5～10 min便可快速平端克隆技術(shù)克隆PCR產(chǎn)物，通過增強(qiáng)型CMV啟動(dòng)子高效表達(dá)目的基因，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行克隆。另外，在基因連接方面，采用pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit無縫拼接試劑盒，利用試劑盒特殊的重組酶和同源重組的原理，將E2-M線性化后的載體末端片段基因與擴(kuò)增N基因片段的上游引物中重疊區(qū)域的片段進(jìn)行定向重組，成功實(shí)現(xiàn)了M與N基因的高效無縫拼接，這種連接方式僅需要15 min的反應(yīng)時(shí)間，無需對(duì)片段進(jìn)行酶切，不受酶切位點(diǎn)的影響，也不需要額外引進(jìn)其他基因序列，連接效果可通過PCR和測(cè)序方法進(jìn)行鑒定。本研究將建立的pE2-M-N重組質(zhì)粒進(jìn)行了序列測(cè)定分析，獲得準(zhǔn)確的基因片段。

在雙基因原核表達(dá)方面，樂敏等[23]利用原核表達(dá)載體 pGEX-KG構(gòu)建出豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF7和ORF5雙基因質(zhì)粒，并表達(dá)出了具有免疫原性的雙基因蛋白。本文則根據(jù)變異PEDV的M和N基因，通過pE2原核表達(dá)載體，構(gòu)建出變異PEDV的M和N雙基因融合質(zhì)粒，并表達(dá)出了M-N融合雙基因蛋白，通過Western blot技術(shù)和應(yīng)用于免疫小鼠也進(jìn)一步驗(yàn)證了表達(dá)蛋白具有免疫活性，這為今后開展變異PEDV的免疫診斷技術(shù)和免疫學(xué)研究奠定了理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。

4 結(jié) 論

構(gòu)建變異PEDV的pE2-M-N融合雙基因質(zhì)粒，并表達(dá)了具有免疫原性M-N融合蛋白。為進(jìn)一步開展變異PEDV的診斷技術(shù)和免疫學(xué)等研究，奠定良好基礎(chǔ)。

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