劉建奎，范佳霖，魏春華，李 艷，劉佳悅，馬露露，虞慧蕓，戴愛玲，楊小燕(龍巖學院生命科學學院，福建省家畜傳染病防治與生物技術(shù)重點實驗室福建省生豬疫病防控工程技術(shù)研究中心，龍巖 364000)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRS virus, PRRSV)引起的一種全球性的豬的重要傳染性疾病，以引起母豬繁殖障礙、生長豬特別是仔豬的呼吸道疾病和持續(xù)性感染等為主要特征，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[1-2]。PRRS于1996年在我國大陸首次暴發(fā)，并迅速蔓延，成為我國規(guī)模化養(yǎng)豬場主要疫病之一。2006年，在我國暴發(fā)的高致病性PRRSV(highly pathogenic PRRS virus，HP-PRRSV)，給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失，2013年國內(nèi)出現(xiàn)了新流行毒株，該毒株與2008年美國分離到的NADC30毒株親緣關(guān)系較近，稱之為類NADC30 PRRSV(NADC30-like PRRSV)，隨后迅速蔓延至全國多個省市，給豬場防控PRRS帶來了嚴峻挑戰(zhàn)[3-10]。

類NADC30 PRRSV于2013年開始在福建省流行，給當?shù)氐酿B(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟損失[11-13]。臨床調(diào)查發(fā)現(xiàn)該類毒株主要引起母豬流產(chǎn)和仔豬呼吸道疾病，傳播速度非?？欤i場一旦感染，迅速波及全場，即使在疫苗免疫的豬場也不能幸免?；蚪M序列分析表明，該類毒株與經(jīng)典毒株VR2332和CH-1a相比其在Nsp2基因存在131 aa的不連續(xù)缺失[6-7,11-13]。流行病學調(diào)查結(jié)果表明2014年之后類NADC30 PRRSV成為福建省豬場的優(yōu)勢毒株，因此有必要深入研究類NADC30 PRRSV的生物學特性和致病性，為今后對該類毒株的防控提供科學依據(jù)。本研究選取可以用MARC-145細胞分離且與NADC30相似性最高(97.1%)的2013年分離株FJZ03進行致病性研究，通過觀察記錄感染仔豬的臨床癥狀和體溫變化，檢測其排毒情況、病毒血癥及組織病理變化等情況，研究該毒株對仔豬的致病性。

1 材料與方法

1.1 試劑

PRRSV抗體檢測試劑盒為IDEXX Herd Check?PRRS ELISA X3試劑盒；RNA提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司；PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2 購自大連寶生物公司；IFN-β、TNF-α、IL-8、IL-10、IL-1β 及IL-12p70 ELISA定量試劑盒購自R&D公司(R&D Systems，MN, USA)。

1.2 細胞、毒株

MARC-145細胞、類NADC30毒株FJZ03和高致病性毒株FJLYDX由龍巖學院生命科學學院重點實驗室分離并保存。FJZ03毒株(GenBank收錄號為KP860909)于2013年分離自福建省某規(guī)模化豬場，該豬場妊娠母豬流產(chǎn)較嚴重(30%左右)，仔豬呼吸道癥狀比較明顯，零星死亡。

1.3 動物試驗

將15頭30日齡PRRSV和PCV2抗原和抗體均為陰性的健康仔豬，隨機均分為3組，分別為FJZ03組、FJLYDX組和對照組。攻毒組(FJZ03組和FJLYDX組)按每頭豬2 mL(2×104TCID50)的劑量進行滴鼻接種。對照組每頭豬接種2 mL不含血清的DMEM細胞培養(yǎng)液。

1.4 臨床癥狀

接種后每天觀察每頭豬的臨床癥狀，測量體溫(上午和下午各測量一次)，并在攻毒前(0 d)和攻毒后14 d對豬進行稱重。臨床癥狀評分標準參考冷雪[14]的方法，從動物行為(精神狀態(tài)、食欲、神經(jīng)癥狀)、呼吸癥狀和皮膚顏色等方面進行評分。

1.5 血清和鼻拭子、咽喉分泌物樣本采集

分別在攻毒后0、1、2、3、4、7、11和14 d經(jīng)前腔靜脈采血，分離血清，-80 ℃冰箱保存。在采血的同時用棉簽采集鼻拭子和咽喉分泌物進行PRRSV核酸的RT-PCR檢測。按照天根生化科技有限公司RNA提取試劑盒說明書進行樣品的RNA提取，參照 TaKaRa 試劑盒說明書采用一步法進行 RT-PCR。參考Zhao等[15]用于擴增PRRSVORF7基因的引物，P1: 5′-TCCACTACGGTCAACGGCACA-3′；P2：5′-TTTTTTAATTDCGGCCGCATGG-3′。

1.6 肺組織病理學觀察

攻毒后14 d剖殺所有豬，無菌采集肺并用10%中性福爾馬林固定，按常規(guī)方法制作病理切片，觀察組織病理學變化。

1.7 病毒滴度和抗體檢測

參考Guo等[16]的方法測定PRRSV滴度。參照IDEXX豬繁殖與呼吸綜合征抗體檢測試劑盒說明書檢測血清中PRRSV抗體。

1.8 細胞因子檢測

采集攻毒后0、4、7、11和14 d的血清和攻毒后14 d的支氣管肺泡灌洗液用于測定IL-1β、IL-8、IL-10、IL-12p70、TNF-α和IFN-γ的濃度，具體操作根據(jù)檢測試劑盒說明書進行。

1.9 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié) 果

2.1 臨床癥狀

攻毒后1 d(1 DPC)，F(xiàn)JZ03組仔豬體溫升高到40 ℃以上，3 DPC時達到最高(平均體溫40.5 ℃)，仔豬表現(xiàn)出咳嗽、打噴嚏和厭食等癥狀，至試驗結(jié)束時沒有仔豬死亡(圖1)。高致病性毒株FJLYDX組仔豬在2 DPC體溫上升到40 ℃以上，7 DPC時達到最高為41 ℃，40 ℃以上的體溫一直持續(xù)到試驗結(jié)束，豬表現(xiàn)出精神沉郁、咳嗽、呼吸困難和厭食等典型的臨床癥狀，10 DPC時1頭仔豬死亡(圖1)。整個試驗過程中，對照組的仔豬體溫正常(均在39.4～39.8 ℃范圍內(nèi)波動)，無異常呼吸癥狀，兩攻毒組仔豬臨床癥狀分值明顯高于對照組(圖2)。FJZ03組、FJLYDX組與對照組仔豬體重每天平均增加0.252、0.142和0.322 kg，F(xiàn)JZ03組和FJLYDX組與對照組相比仔豬增重差異顯著(P<0.05)。攻毒14 d后剖殺所有豬，F(xiàn)JZ03組的仔豬肺呈間質(zhì)性肺炎的癥狀，多灶性彌散，肺部存在散在的出血點，具有不規(guī)則邊界的褐色至紅色斑點區(qū)域，F(xiàn)JLYDX組的仔豬肺呈典型的間質(zhì)性肺炎的癥狀，多灶性彌散，具有不規(guī)則邊界的褐色區(qū)域，對照組無異常變化(圖3)。同時FJZ03組仔豬的脾與對照組相比嚴重萎縮(圖3)。

2.2 病毒血癥

提取血清中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此為模板進行PCR檢測，結(jié)果顯示在1 DPC時FJZ03組血清中病毒核酸檢出率為4/5，2 DPC時檢出率為5/5，并且一直持續(xù)到試驗結(jié)束。而FJLYDX組在3 DPC時才檢測到血清中病毒核酸，檢出率為3/5，在4～14 DPC時檢出率為5/5(表1)。整個試驗過程中對照組仔豬均沒有檢測到病毒核酸。

圖1 攻毒后豬體溫變化Fig.1 Comparison of rectal temperatures among FJLYDX, FJZ03 and control groups

***. P<0.01

圖2 FJLYDX、FJZ03和對照組平均臨床癥狀分值Fig.2 Mean clinical scores of piglets in different group after infection

圖3 FJZ03感染豬肺、脾解剖病變Fig.3 Gross lesions of lung and spleen of infected piglets

將經(jīng)雙抗處理的陽性血清接種至長成單層的MARC-145細胞上，測定血清中的病毒載量。兩組攻毒組仔豬的血清均可分離到病毒，F(xiàn)JZ03組在4 DPC 時血清中呈現(xiàn)較高的病毒滴度，7 DPC達到最高(105.0TCID50·mL-1)，F(xiàn)JLYDX組在7 DPC達到最高(106.1TCID50·mL-1)，較高的病毒載量一直維持到試驗結(jié)束。FJZ03攻毒組和FJLYDX攻毒組病毒載量在7、11和14 DPC差異顯著(P<0.05)(圖4)。試驗結(jié)果表明，F(xiàn)JZ03毒株在仔豬體內(nèi)能快速復(fù)制。

2.3 攻毒試驗豬的排毒情況

采用RT-PCR方法，檢測攻毒仔豬鼻、咽喉分泌物中的PRRSV核酸，研究PRRSV的排毒情況。結(jié)果表明FJZ03在3 DPC時在豬的鼻、咽喉分泌物中均可檢測到PRRSV核酸，而FJLYDX組在7 DPC時可以檢測到PRRSV核酸(表1)，表明FJZ03感染豬體后能較快地向環(huán)境中排毒，從而感染其他豬，這可以解釋為什么豬場一旦感染此類毒株就能迅速波及全場。

2.4 抗體檢測

用IDEXX抗體檢測試劑盒檢測豬血清中特異性的PRRSV N蛋白抗體，結(jié)果如圖5。FJZ03組在7 DPC時有3頭豬轉(zhuǎn)陽，11 DPC全部轉(zhuǎn)陽，而FJLYDX組在7 DPC時5頭豬全部轉(zhuǎn)陽(S/P>0.4)，抗體水平顯著高于FJZ03攻毒組(圖5)。在整個試驗過程對照組血清中的PRRSV N蛋白抗體均為陰性。

a、b、c不同字母間表示差異顯著P<0.05Different letter superscripts denote significant differences at P<0.05

圖4 病毒載量測定Fig.4 Virus titer from positive serum samples at each collection time point

表1鼻、咽喉分泌物和血清PRRSVORF7檢測結(jié)果

Table1DetectionofORF7geneofPRRSVbyRT-PCR

DPCFJZ03攻毒組FJZ03inoculatedgroupFJLYDX攻毒組FJLYDXinoculatedgroup對照組Control分泌物Secretion血清Serum分泌物Secretion血清Serum分泌物Secretion血清Serum00/50/50/50/50/50/510/54/50/50/50/50/520/55/50/50/50/50/535/55/50/53/50/50/545/55/50/55/50/50/575/55/55/55/50/50/5115/55/55/55/50/50/5145/55/55/55/50/50/5

2.5 肺病理組織學檢查

FJZ03組肺呈間質(zhì)性肺炎病變，肺泡內(nèi)皮細胞增生、脫落，肺泡壁增寬，有大量炎性細胞浸潤或纖維性滲出，肺泡腔被占據(jù)而縮小。肺泡毛細血管擴張，充滿大量的紅細胞；各級氣管黏膜上皮細胞腫脹、增生，形成波浪形皺褶，且管腔內(nèi)充斥著大量的淋巴細胞以及脫落的黏膜上皮細胞和細胞壞死的崩解物(圖6b)。FJLYDX組肺病理組織病理變化比FJZ03組嚴重，各級支氣管周圍有大量炎性細胞浸潤(圖6c)。

2.6 主要細胞因子的測定

2.6.1 血清中細胞因子的變化 仔豬接種FJZ03和FJLYDX后，血清中的TNF-α濃度逐漸升高，在11 DPC達到最高，F(xiàn)JZ03組的TNF-α濃度略高于FJLYDX組，沒有統(tǒng)計學意義。IL-1β濃度在11 DPC達到最高，F(xiàn)JLYDX組在7、11和14 DPC顯著高于FJZ03組(P<0.05)。FJZ03組IL-10的濃度在4 DPC迅速升高，顯著高于FJLYDX組(P<0.05)，11 DPC達到最高；而FJLYDX組的IL-10的濃度在7 DPC迅速升高，11 DPC達到最高(P<0.05)。FJZ03和FJLYDX組血清中IL-12p70濃度在7、11和14 DPC時差異顯著(P<0.05)。FJZ03組IFN-γ濃度在4 DPC迅速升高，顯著(P<0.05)高于FJLYDX組，然后逐漸下降，顯著(P<0.05)低于FJLYDX組(圖7)。

a、b、c不同字母間表示差異顯著P<0.05Different letter superscripts denote significant differences at P<0.05

圖5 攻毒后PRRSV N蛋白抗體水平變化Fig.5 Virus-specific antibody response of piglets as measured by ELISA

a. 正常對照組肺； b. FJZ03攻毒后肺病變；c. FJLYDX攻毒后肺病變a. Normal lung from control pigs; b. Lung tissues from pigs inoculated with FJZ03; c. Lung tissues from pigs inoculated with FJLYDX

圖6 攻毒后14 d豬肺的顯微病理變化 (200×)Fig.6 Lung tissues collected at autopsy at 14 DPC were fixed in 10% neutral-buffered formalin and routinely processed for histological examination (200×)

2.6.2 支氣管沖洗液細胞因子的變化 攻毒后14 d 剖殺所有豬，無菌摘除肺后，用50 mL不含抗生素的DMEM無菌沖洗支氣管，收集沖洗液，3 000 r·min-1離心10 min，上清液用于細胞因子檢測，檢測結(jié)果如圖8。與對照組相比，兩組攻毒組IL-1β、TNF-α、IL-8、IFN-γ和IL-10的濃度都有不同程度的升高，F(xiàn)JZ03組的IL-10和TNF-α的濃度顯著(P<0.05)高于FJLYDX組，而IL-1β、IL-8和IFN-γ顯著(P<0.05)低于FJLYDX組(圖8)。

a、b、c不同字母間表示差異顯著P<0.05Different letter superscripts denote significant differences at P<0.05

圖7 血清中細胞因子濃度變化Fig.7 Change of cytokine concentration in serum samples at specified days post exposure

**. P<0.05

圖8 支氣管洗液中細胞因子濃度變化Fig.8 Change of cytokine concentration in bronchoalveolar lavage fluid (BALF)

3 討 論

研究表明PRRSV的毒力不僅與病毒滴度有關(guān)，還與病毒在動物體內(nèi)復(fù)制的速度和時間有關(guān)[6, 17]。接種FJZ03仔豬體內(nèi)的病毒載量迅速上升，7 DPC時達到最高，與FJLYDX攻毒組相比，F(xiàn)JZ03毒株能更早地誘發(fā)仔豬發(fā)熱，可能與該毒株在體內(nèi)能較快地復(fù)制和產(chǎn)生較高的病毒載量有關(guān)。FJZ03攻毒后在豬的鼻、咽喉分泌物中檢測到PRRSV核酸的時間早于FJLYDX攻毒組，表明豬群感染FJZ03毒株后能迅速向環(huán)境中排毒，從而感染其他豬，導致此類毒株的迅速傳播。豬感染PRRSV后體溫的變化與病毒載量密切相關(guān)，提示豬在高熱期是排毒的活躍期，豬場可根據(jù)豬體溫的變化情況采取合理的措施，防止PRRSV在豬群傳播，減少經(jīng)濟損失。FJZ03組仔豬體溫升高在3 DPC時達到最高(平均體溫40.5℃)，并出現(xiàn)明顯的呼吸癥狀，整個試驗過程中沒有出現(xiàn)仔豬死亡，與Zhou等[18]的研究結(jié)果相似。病理剖檢顯示，F(xiàn)JZ03攻毒組仔豬主要的病理變化為間質(zhì)性肺炎，出血性壞死性腎炎，全身淋巴結(jié)出現(xiàn)不同程度的淋巴結(jié)炎，胸腺萎縮以及脾出血等，與HP-PRRSV引起的病理變化相似。此外，F(xiàn)JZ03引起豬脾萎縮，不同于其他HP-PRRSV毒株引起脾大的病理變化，具體原因有待進一步研究。序列分析表明，F(xiàn)JZ03與FJLYDX的N蛋白的相似性僅為90.2%。FJZ03 N蛋白序列與FJLYDX、VR2332進行比對，發(fā)現(xiàn)FJZ03 N蛋白存在幾處獨有的氨基酸突變：K7R、K10N、S34R、K48R和Q80R，這些氨基酸的突變可能會影響N蛋白的結(jié)構(gòu)和抗原性，從而影響ELISA血清學檢測結(jié)果[19]。

細胞因子檢測結(jié)果顯示，攻毒后FJZ03組細胞因子的濃度都有不同程度的升高，與FJLYDX組相比最明顯的是產(chǎn)生較高水平的TNF-α和IL-10。研究表明，IL-10在PRRSV對宿主產(chǎn)生免疫抑制的過程中起著主要作用，IL-10表達與PRRSV復(fù)制呈顯著正相關(guān)[20]。本研究用FJZ03毒株接種仔豬，并對其血清中IL-10濃度進行了檢測，檢測結(jié)果顯示，豬感染FJZ03后血清呈現(xiàn)較高濃度的IL-10，和之前的研究結(jié)果相似[21-23]。FJZ03接種仔豬后，IL-10的大量表達可能有利于FJZ03在仔豬肺的快速復(fù)制。PRRSV誘導機體產(chǎn)生不同水平的TNF-α表達可能與ORF1a的變異程度有關(guān)[24]。FJZ03攻毒后血清中TNF-α在整個試驗過程中維持較高的濃度，可能與FJZ03的ORF1a與HP-PRRSVs、CH-1a和VR2332毒株氨基酸相似性較低，變異程度較大以及病毒本身的固有差異有關(guān)，具體原因有待進一步研究。高水平的TNF-α表達可以誘導產(chǎn)生IL-10以控制炎癥反應(yīng)[25]，F(xiàn)JZ03組豬體產(chǎn)生較高濃度TNF-α從而誘發(fā)機體產(chǎn)生高水平的IL-10，從而導致PRRSV在體內(nèi)快速增殖。

綜上所述，F(xiàn)JZ03對仔豬的致病能力較強，能較早地向環(huán)境中排毒，值得注意的是類NADC30 PRRSV與田間流行毒株重組的報道越來越多，因此有必要采取有效措施來防控該類毒株，除了研發(fā)新型高效安全的疫苗之外，豬場更應(yīng)該加強生物安全措施。

4 結(jié) 論

本研究通過動物試驗研究類NADC30 PRRSV FJZ03毒株對仔豬的致病性，結(jié)果表明該毒株能在豬體內(nèi)快速復(fù)制，引起仔豬較高滴度的病毒血癥，體溫升高和體外排毒時間均早于FJLYDX毒株，并能引起嚴重的間質(zhì)性肺炎，表明FJZ03對仔豬具有較強的致病性。

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