宋林林，賈存瑜，韓熙夢，周恩民*，穆 楊*(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100；2.農(nóng)業(yè)部獸用藥物與診斷技術(shù)陜西科學(xué)觀測實驗站，楊凌 712100)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是世界上對養(yǎng)豬業(yè)生產(chǎn)影響最嚴重的疾病之一，該病于1987年在美國首次被發(fā)現(xiàn)。30年多來，科研人員就PRRS的病原、起源、演化、機體免疫應(yīng)答等方面進行了大量研究，并取得了一系列的研究成果[1-4]，免疫接種、提高飼養(yǎng)管理水平、抗病育種、捕殺感染豬等措施在防控PRRS方面都發(fā)揮了積極的作用[4-6]，但目前仍然沒有一種可完全有效根除該病的方法。ORF5 編碼的GP5蛋白是PRRSV最主要的結(jié)構(gòu)蛋白與免疫保護性抗原，針對GP5 的研究可以為PRRSV致病機制的剖析積累資料。

RNA干擾(RNA interference, RNAi)指在進化過程中由高度保守的雙鏈RNA誘發(fā)的同源mRNA高效特異降解現(xiàn)象。小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)是一段長20～25個核苷酸的雙鏈RNA，主要參與RNAi現(xiàn)象，可專一性調(diào)節(jié)基因的表達。利用RNAi 降低病毒對細胞和易感動物的感染已經(jīng)用于多種病毒的研究，如口蹄疫病毒[7]、偽狂犬病病毒[8]、PRRSV[9-10]等。構(gòu)建穩(wěn)定表達某一病毒蛋白的細胞系是研究病毒蛋白功能的一種常用方法[11]。本研究構(gòu)建穩(wěn)定表達PRRSV GP5的Marc-145細胞系，同時設(shè)計合成針對PRRSV ORF5 的特異性siRNA轉(zhuǎn)染Marc-145細胞后用病毒感染細胞，研究穩(wěn)定表達GP5和敲低GP5表達對PRRSV復(fù)制的影響及機制，以期為GP5功能及PRRSV致病機制的研究積累資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 細胞、病毒、質(zhì)粒和載體 Marc-145細胞系購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心；PRRSV SD16株(GenBank Access No. JX087437.1)、pMD18-T-GP5質(zhì)粒由西北農(nóng)林科技大學(xué)重大動物疫病病原感染和致病機制團隊保存；E.coliDH5α感受態(tài)細胞、pMD18-T載體為TaKaRa公司產(chǎn)品；piggyBacTMTransposon vector system 購自SBI公司。

1.1.2 siRNA Scrambled siRNA、siRNA GP5-404、siRNA GP5-471、siRNA GP5-525(表1)由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計合成。

1.1.3 主要試劑 RNAiso plus、PrimeScriptTMRT reagent Kit、PrimeSTAR HS DNA Polymerase、ExTaqVersion 2.0 plus dye購自寶生物工程(大連)有限公司，EasyPure Plasmid MiniPrep Kit、EasyPure Quick Gel Extraction Kit購自Transgen Biotech.，T4 DNA連接酶、BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ為New England Biolabs產(chǎn)品，F(xiàn)astStart Universal SYBR Green Master為Roche公司產(chǎn)品，PageRuler預(yù)染蛋白marker(10-170 ku)、BCA protein assay kit、LipofectamineTM3000為Thermo Scientific公司產(chǎn)品；嘌呤霉素(puromycin)為Merck公司產(chǎn)品；抗PRRSV N蛋白單抗6D10、抗PRRSV 豬血清、抗GP5鼠血清由西北農(nóng)林科技大學(xué)重大動物疫病病原感染和致病機制團隊制備、保存；抗 α-tubulin (Catalog# T6074)抗體購自Sigma-Aldrich；HRP-標記的羊抗鼠IgG(Catalog# 115-035-003)、Texas Red-標記的羊抗豬IgG(Catalog# 114-075-003)為Jackson ImmunoResearch公司產(chǎn)品；Cell counting kit-8(cck-8)和NP40裂解液購自碧云天生物技術(shù)公司；猴源干擾素α(IFN-α)、IFN-β、IFN-γ ELISA檢測試劑盒購自Cusabio公司。

表1siRNA名稱與對應(yīng)的序列

Table1NamesandsequencesofsiRNA

siRNA名稱NameofsiRNA靶標Target鏈Strand序列(5′→3′)SequencesscrambledsiRNANoSenseUUCUUCGAACGUGUCACGUTTAntisenseACGUGACACGUUCGGAGAATTsiRNAGP5?404PRRSVSenseGCUACUCUUGUACCAGAUATTSD16ORF5AntisenseUAUCUGGUACAAGAGUAGCTTsiRNAGP5?471PRRSVSenseGCCCGUCAUUGUGGAGAAATTSD16ORF5AntisenseUUUCUCCACAAUGACGGGCTTsiRNAGP5?525PRRSVSenseCCUCAAGAGAGUUGUGCUUTTSD16ORF5AntisenseAAGCACAACUCUCUUGAGGTT

1.2 試驗方法

1.2.1 穩(wěn)定表達PRRSV GP5細胞的構(gòu)建與鑒定 以 pMD18-T-GP5為模板，用引物GP5-F和GP5-R(表2)進行擴增，回收目的條帶后利用EcoR Ⅰ和BamHⅠ酶切位點將目的片段定向插入PiggyBacTMVector System的 PB Transposon vector，鑒定正確的重組載體命名為pPB-GP5。將狀態(tài)良好的Marc-145細胞按2×105個細胞·孔-1接種于6孔細胞板，培養(yǎng)至80%左右融合度時按文獻方法用donor質(zhì)粒(pPB-GP5或空載體質(zhì)粒PB Transposon vector)和helper質(zhì)粒(PiggyBac Transposase vector)進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、篩選、亞克隆、保存及鑒定[12-13]，將鑒定正確的表達GP5和標簽蛋白GFP的細胞命名為Marc-145-GP5，將僅表達標簽蛋白GFP的細胞命名為Marc-145-GFP。

1.2.2 細胞增殖測定 調(diào)整細胞濃度，以每孔2×103個細胞接種96孔板培養(yǎng)，按cck-8試劑盒說明分別于培養(yǎng)的1、2、3、4、5、6和 7 d 測定細胞增殖情況，每個時間點設(shè)置6個重復(fù)孔，同時設(shè)Marc-145和Marc-145-GFP對照，并按照公式

PDT=[log 2/(logNt-logN0)]×t,

(Nt=培養(yǎng)th時的細胞數(shù)，N0=初期接種的細胞數(shù))計算細胞群體倍增時間(population doubling time, PDT)[13-15]。

1.2.3 PRRSV GP5表達對病毒復(fù)制的影響 將Marc-145、Marc-145-GP5和Marc-145-GFP按每孔1×105接種于6孔細胞板，培養(yǎng)至80%融合度時按0.1 MOI接種PRRSV SD16株，接毒后12、24、36、48 h分別收集細胞和培養(yǎng)液上清，每個時間點設(shè)3個重復(fù)。收集的細胞一部分提取總RNA，采用RT-qPCR檢測N基因mRNA表達水平；另一部分按NP40裂解液說明裂解細胞準備樣品進行12%分離膠 SDS-PAGE，以6D10 (3 ng·μL-1) 為一抗，HRP-標記的羊抗鼠 IgG(80 ng·μL-1)為二抗進行Western blot檢測，確定病毒復(fù)制情況。收集的上清一部分用不含血清的DMEM作10倍倍比稀釋，按Reed-Muench法用Marc-145細胞測定病毒滴度(TCID50·mL-1)，另一部分用于干擾素表達水平檢測。

1.2.4 IFN表達水平檢測 分別取此前收集的培養(yǎng)24和48 h的上清，用猴源IFN-α、IFN-β和IFN-γ ELISA 試劑盒檢測各樣品中各IFN蛋白的表達情況。

1.2.5 siRNA轉(zhuǎn)染及其對病毒復(fù)制影響的檢測 將狀態(tài)良好的Marc-145細胞按5×104·孔-1鋪于24孔細胞板，培養(yǎng)至70%左右融合度時參照試劑說明用LipofectamineTM3000將特異性siRNA和Scrambled siRNA分別轉(zhuǎn)染細胞，同時設(shè)立空白對照。分別在轉(zhuǎn)染后6和12 h按 0.1 MOI 接種PRRSV SD16，感染后24 h 收集細胞，一部分提取基因組RNA，采用RT-qPCR 檢測GP5 mRNA的表達水平[16]，另一部分按NP40裂解液說明裂解細胞準備樣品進行12%分離膠SDS-PAGE，以抗N蛋白單抗6D10(3 ng·μL-1)為一抗，HRP-標記的羊抗鼠 IgG(80 ng·μL-1)為二抗進行Western blot檢測[12]，確定病毒的復(fù)制情況。

表2引物及其序列

Table2Primersandtheirsequences

引物名稱Primer’sname引物序列(5′→3′)Primer’ssequencesGP5?FCGGAATTCATGTTGGGGAAGTGCTTGACCGP5?RCGGGATCCCTAGAGACGACCCCATTGTTCORF7?FAGATCATCGCCCAACAAAACORF7?RGACACAATTGCCGCTCACTAORF5?FTGGTGTATCGTGCCGTCTTATCORF5?RAGTCTCCACTGCCCAGTCAAAβ?actin?FCGGGAAATCGTGCGTGACβ?actin?RATGCCCAGGAAGGAAGGTTG

下劃線標記分別是EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點

Underlined letters are restriction enzyme digestion sites ofEcoRⅠ andBamHⅠ, respectively

2 結(jié) 果

2.1 穩(wěn)定表達PRRSV GP5 細胞的篩選與鑒定

轉(zhuǎn)染后經(jīng)嘌呤霉素篩選和3次亞克隆獲得了全部表達綠色熒光的細胞克隆，為了確定外源基因在細胞中的表達，提取Marc-145-GP5、Marc-145-GFP 和 Marc-145細胞總RNA 利用引物GP5-F和GP5-R采用RT-PCR進行檢測，從 Marc-145-GP5細胞樣品中可以擴增到GP5基因，而從Marc-145-GFP和 Marc-145樣品中沒有擴增條帶(圖1A)，Western blot檢測結(jié)果也顯示，在 Marc-145-GP5細胞中可檢測到 GP5蛋白的表達， 但Marc-145-GFP 和 Marc-145細胞中沒有，而內(nèi)參蛋白α-tubulin在3種細胞中的表達基本一致(圖1B)；IFA結(jié)合激光共聚焦顯微鏡觀察可以看到，從Marc-145-GFP細胞樣品可以觀察到綠色的GFP熒光，而Marc-145-GP5細胞中既有綠色的GFP熒光也有紅色的GP5熒光，而且GP5主要表達在細胞質(zhì)中， Marc-145細胞中兩種熒光都沒有(圖1C)；說明ORF5已插入到 Marc-145 細胞基因組中。

2.2 GP5表達不影響Marc-145細胞增殖

為確定表達GP5是否會對Marc-145細胞增殖產(chǎn)生影響，利用顯微鏡觀察細胞形態(tài)顯示，Marc-145-GP5 和Marc-145-GFP 與Marc-145細胞一樣培養(yǎng)約2 d可形成單層，且形態(tài)與Marc-145細胞基本一致(圖2A)；利用cck-8試劑盒檢測細胞增殖活性，結(jié)果顯示從細胞接種到細胞進入生長的平臺期，其增殖曲線與Marc-145的基本一致(圖2B)，計算培養(yǎng)48、72、96和120 h的PDT，結(jié)果顯示3種細胞的沒有明顯差異(圖2C)。Marc-145-GP5 和 Marc-145-GFP 培養(yǎng)50代以上仍然增殖活躍，說明GP5表達不影響Marc-145的增殖。

2.3 GP5穩(wěn)定表達促進PRRSV在Macr-145細胞中的復(fù)制

為確定GP5的穩(wěn)定表達對PRRSV復(fù)制的影響，將Marc-145-GP5、Marc-145-GFP和Marc-145 接種24孔板，培養(yǎng)至細胞達80% 左右融合度時接種0.1 MOI PRRSV SD16，每天觀察出現(xiàn)的細胞病變(cytopathic effect，CPE)，發(fā)現(xiàn)接毒后36 h Marc-145-GP5細胞上出現(xiàn)了典型的CPE，且比Marc-145細胞和Marc-145-GFP 細胞上的明顯(圖3)。采用RT-qPCR檢測接毒后不同時間細胞中的PRRSVN基因拷貝數(shù)發(fā)現(xiàn)，接毒后12、24和36 h Marc-145-GP5中N基因拷貝數(shù)顯著或極顯著高于Marc-145細胞和Marc-145-GFP細胞中的，到48 h時，N基因拷貝數(shù)顯著下降(圖4A)，N基因拷貝數(shù)的峰值出現(xiàn)在病毒感染后36 h，但上清液中病毒滴度到感染后48 h一直處于比較高的水平(圖4B)，感染后48 h N蛋白的免疫印跡檢測進一步說明GP5的穩(wěn)定表達在PRRSV感染早期可以促進病毒的復(fù)制(圖4C)。

2.4 IFN表達檢測

為了探究GP5穩(wěn)定表達促進PRRSV SD16復(fù)制的可能原因，收集培養(yǎng)24和48 h或病毒感染24 和48 h的培養(yǎng)上清，用ELISA試劑盒檢測樣品中IFN-α、IFN-β和 IFN-γ的蛋白含量。結(jié)果顯示，與Marc-145細胞和Marc-145-GFP細胞相比，Marc-145-GP5 細胞表達的IFN-α、IFN-β和IFN-γ的量均明顯降低(圖5)，0.1 MOI PRRSV 感染后24 h，Marc-145-GP5細胞上清中IFN-β的量為273.92±43.48 pg·mL-1，而Marc-145-GFP細胞和Marc-145細胞的分別為(873.37±67.14)pg·mL-1和(1 119.07±56.90)pg·mL-1(圖5B)。因此IFN表達下調(diào)可能是GP5穩(wěn)定表達促進PRRSV復(fù)制的原因之一，是否還有其他因素參與，有待進一步研究。

A. RT-PCR 鑒定；B. Western blot 鑒定；C. 激光共聚焦顯微鏡分析GP5的表達與定位A. Identification with RT-PCR；B. Western blot analysis of GP5 expression in Marc-145-GP5, Marc-145-GFP, and parental Marc-145 cells after culture 48 h using anti-GP5 or α-tubulin primary antibodies (control)；C. Cellular localization of GP5 in Marc-145-GP5 cells following immunohistochemical detection

圖1 穩(wěn)定表達GP5細胞的鑒定Fig.1 Validation of GP5 in Marc-145 cells

A. 顯微鏡觀察(200×)；B. 細胞增殖曲線，n=6；C. 根據(jù)公式：PDT=[log 2/(log Nt -logN0)]×t (Nt=培養(yǎng)t h時的細胞數(shù)，N0=接種的細胞數(shù))計算的對數(shù)生長期3種細胞的PDTA. Cell morphology observed under 200×magnification；B. Cell growth curves were plotted using average cell numbers across 7 days of culture time，n=6；C. The PDT of Marc-145-GP5, Marc-145-GFP, and Marc-145 cells were determined at 48, 72, 96, 120 h after seeding according the formula: PDT =[log 2/(log Nt -logN0)]×t(Nt=number of cells after t hours of culturing, N0=number of cells seeded) 圖2 GP5表達不影響Marc-145細胞的增殖Fig.2 Expression of PRRSV GP5 does not influence Marc-145 cell growth characteristics

圖3 PRRSV接種后36 h 細胞上出現(xiàn)的CPE(200×)Fig.3 CPE were observed at 36 h after PRRSV SD16 infection (Magnification 200×)

A. RT-qPCR檢測接毒后不同時間的N基因拷貝數(shù)；B. 病毒滴度檢測結(jié)果；C. Western blot檢測接毒后48 h N蛋白的表達(左)以及灰度分析結(jié)果(右)，*. P<0.05；**. P<0.01；***. P<0.001A. N gene copies of PRRSV SD16 were quantified by RT-qPCR；B. Viral titers in supernatant were titrated on Marc-145 cells with 10-fold serial dilutions；C. N protein expression at 48 h post infection was detected by Western blot (left) and N protein expression levels were quantitatively analyzed and were compared with α-tubulin expression by use of Image J (right). *. P<0.05；**. P<0.01；***. P<0.001

圖4 GP5 穩(wěn)定表達促進PRRSV感染早期病毒的復(fù)制Fig.4 PRRSV replication was promoted in Marc-145-GP5 cells

2.5 針對 PRRSV ORF5編碼區(qū)的特異性siRNA能抑制病毒在Marc-145細胞上的增殖

為了進一步確定GP5對病毒復(fù)制的影響，針對ORF5的編碼區(qū)設(shè)計合成siRNA，轉(zhuǎn)染Marc-145細胞后再接種病毒，檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染siRNA后6和12 h接種PRRSV， 3對特異性 siRNAs (siRNA GP5-404、siRNA GP5-471 和siRNA GP5-525)均能顯著抑制GP5 mRNA的表達，而且轉(zhuǎn)染siRNA后12 h接種病毒的抑制效果更明顯(圖6A和圖6B)；其中100 nmol·L-1的 siRNA GP5-471的抑制效果最好，與scrambled siRNA 處理的對照組相比，GP5 mRNA 表達水平降低超過70% (1.026±0.050vs0.291±0.044,P=9.809×10-5)(圖6C)；對N蛋白的免疫印跡檢測和相對表達分析顯示干擾GP5的表達顯著抑制病毒的復(fù)制(圖6D和圖6E)。

3 討 論

本研究構(gòu)建并篩選到穩(wěn)定表達PRRSV GP5的Marc-145細胞系，RT-PCR、Western blot 和免疫組化結(jié)合激光共聚焦顯微鏡觀察均證實GP5在細胞中獲得穩(wěn)定表達(圖1)。雖然在采用Western blot檢測GP5表達時出現(xiàn)兩條印跡條帶，但這與報道的GP5存在不同糖基化形式一致[17]。形態(tài)觀察和采用cck-8試劑盒檢測發(fā)現(xiàn)GP5穩(wěn)定表達不影響Marc-145-GP5細胞的增殖(圖2)。Wang等[18]指出，穩(wěn)定表達某一病毒蛋白可能會改變細胞中病毒的產(chǎn)量甚至改變病毒的嗜性。本研究在獲得穩(wěn)定表達GP5細胞系的基礎(chǔ)上，用PRRSV SD16 株感染 Marc-145-GP5 細胞，感染后不同時間觀察細胞上出現(xiàn)的CPE并檢測細胞中N基因拷貝數(shù)和上清液中的病毒滴度，發(fā)現(xiàn)在感染的早期(48 h內(nèi))Marc-145-GP5細胞組的CPE比對照細胞組的明顯(圖3)，其N基因拷貝數(shù)和病毒滴度在感染后36 h也持續(xù)顯著高于對照細胞組，雖然到病毒感染后48 h，Marc-145-GP5細胞組的N基因拷貝數(shù)比對照細胞組的低，但病毒滴度仍然高于對照組的(圖4)，到感染后60和72 h，Marc-145-GP5細胞組的N基因拷貝數(shù)和病毒滴度就與對照組沒有差異了(數(shù)據(jù)未顯示)。對感染后 48 h N蛋白表達水平的免疫印跡檢測進一步說明穩(wěn)定表達GP5在PRRSV感染的早期可以促進病毒的復(fù)制，這一結(jié)果與在Marc-145細胞中穩(wěn)定表達Nsp2可以促進病毒復(fù)制的結(jié)果一致[18]。但在筆者團隊前期構(gòu)建的另一個穩(wěn)定表達GP5的細胞系Marc-145-GP5Flag中，GP5表達通過誘導(dǎo)IFN-β的生成抑制病毒的復(fù)制[19]。為了探究出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因，本研究采用ELISA試劑盒檢測正常培養(yǎng) 24和48 h 以及病毒感染 24和48 h上清中的IFN-α、IFN-β和 IFN-γ水平發(fā)現(xiàn)，與Marc-145-GFP 和 Marc-145 細胞組相比，無論病毒感染與否，Marc-145-GP5細胞組的IFN-α、IFN-β和IFN-γ表達水平在 24和 48 h 都是下調(diào)的(圖5)。那么，都是穩(wěn)定表達 GP5的細胞系，為什么會出現(xiàn)相反的結(jié)果呢？仔細分析發(fā)現(xiàn)，研究團隊前期構(gòu)建Marc-145-GP5Flag細胞系采用的是慢病毒載體系統(tǒng)，在GP5的羧基端融合了Flag標簽，而本研究構(gòu)建細胞系采用的是piggyBacTMTransposon載體系統(tǒng)，此載體系統(tǒng)的優(yōu)點是篩選細胞系時借助的GFP標簽在目的蛋白被表達后與目的蛋白是分離的，因此標簽蛋白不會對目的蛋白功能的發(fā)揮產(chǎn)生影響。而且筆者推測，在Marc-145-GP5細胞中，穩(wěn)定表達的GP5可能參與了感染早期病毒粒子的組裝，因此導(dǎo)致病毒粒子的生成加快，至于這種推測是否成立以及為什么不同的載體系統(tǒng)構(gòu)建的細胞系會獲得不同的結(jié)果，具體原因還有待進一步研究。

研究表明，PRRSV感染在體內(nèi)外均可誘導(dǎo)細胞凋亡[20-21]，發(fā)揮功能的主要是GP5氨基端的119個氨基酸殘基形成的功能域[22]。然而，Lee等[23]指出前者報道的GP5誘導(dǎo)的細胞凋亡可能是非典型的，是由融合在GP5氨基端的His標簽或抗原標簽引起的，這些額外的標簽擾亂了GP5氨基端信號肽的功能，導(dǎo)致被修飾的GP5出現(xiàn)胞內(nèi)功能紊亂(intracellular trafficking of the modified protein)，而且研究者使用的牛痘病毒可能也是造成這種非典型細胞凋亡的原因之一。本研究使用 piggyBacTMTransposon 載體系統(tǒng)構(gòu)建穩(wěn)定表達 GP5的細胞系，piggyBacTMTransposon 載體系統(tǒng)是一種非病毒DNA傳遞系統(tǒng)，包含PB Transposon vector 和 PiggyBac Transposase vector，Transposase指導(dǎo) PB Transposon結(jié)合到基因組的TTAA 位點，且在轉(zhuǎn)染細胞中GFP標簽蛋白和目的蛋白是分離的[24-26]。這種情況下，標簽蛋白的可能影響就被去除了，而且筆者已經(jīng)證實 PRRSV SD16 的 GP5不能引起細胞凋亡[13]，引起細胞凋亡的是PRRSV的Nsp4和Nsp10[27]。

*. P<0.05；**. P<0.01；***. P<0.001

圖5 ELISA 方法檢測IFN-α、IFN-β、IFN-γ蛋白表達水平Fig.5 Interferon protein expression levels were detected with ELISA method

A、B. RT-qPCR 檢測siRNA轉(zhuǎn)染后6 h(A)和12 h(B)接種PRRSV對GP5 mRNA表達的影響；β-actin為內(nèi)參基因，PRRSV對照組的GP5 mRNA表達被設(shè)定為1；C. RT-qPCR檢測不同濃度siRNA GP5-471的抑制效果；D、E. Western blot檢測siRNA對N蛋白表達的影響(左)及其灰度分析(右)；n=3；*. P<0.05；**. P<0.01；***. P<0.001A, B. RT-qPCR results show the inhibition on GP5 mRNA expression when inoculating PRRSV at 6 h (A) and 12 h (B) after siRNA treatment. β-actin served as an internal control. Gene expression in the PRRSV control was set to 1；C. RT-qPCR results show the inhibition efficiency of 50, 100, and 200 nmol·L-1 siRNA GP5-471；D, E. Western blot data shows that siRNA targeting GP5 coding region of PRRSV SD16 inhibits N protein expression. α-tubulin was used as an internal control (Left). N protein expression levels were quantitatively analyzed and were compared with α-tubulin expression by use of Image J (Right). n=3. *. P<0.05；**. P<0.01；***. P<0.001

圖6 針對GP5編碼區(qū)的siRNA抑制 PRRSV在MARC-145細胞中的復(fù)制Fig.6 siRNAs targeting GP5 coding regions inhibit PRRSV SD16 replication in Marc-145 cells

研究指出，將表達IFN-α的重組腺病毒Ad5-IFN-α與 Ingelvac PRRS?ATP 同時給豬注射，可以摧毀(abolished)疫苗毒在豬體內(nèi)的復(fù)制[28]，在CRL-2843-CD163細胞中過表達豬 2′,5′-寡腺苷酸合成酶(OASs)可以通過促進 IFN-α和IFN-β 等細胞因子的表達抑制PRRSV復(fù)制[29]。本研究中，與Marc-145 細胞組相比，Marc-145-GP5細胞組的IFN-α、IFN-β和IFN-γ 蛋白表達水平均下調(diào)，提示在穩(wěn)定表達 GP5的Marc-145-GP5 細胞中，干擾素表達下調(diào)可能是PRRSV復(fù)制被抑制的原因之一，其具體的詳細機制還需要進一步研究。

GP5是PRRSV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，在感染性病毒粒子的組裝、病毒侵染宿主細胞等方面發(fā)揮著重要作用。在確定了過表達GP5 可以在病毒感染早期促進病毒復(fù)制后，本研究進一步設(shè)計合成針對ORF5編碼區(qū)的特異性siRNA，采用RNA干擾技術(shù)在siRNA轉(zhuǎn)染Marc-145細胞后6和12 h 分別接種PRRSV SD16株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)特異性siRNA能從轉(zhuǎn)錄水平顯著干擾GP5 mRNA的表達(圖6A、B、C)和N蛋白表達(圖6D、E)，說明抑制GP5表達在病毒感染早期可以顯著抑制病毒復(fù)制，進一步表明GP5 能調(diào)控病毒復(fù)制。

本研究無論是過表達GP5還是干擾ORF5的轉(zhuǎn)錄，均是在體外水平進行，要確定PRRSV感染豬體后，GP5在豬體內(nèi)是否也可以發(fā)揮相同的效應(yīng)，還需要采用豬體試驗進行進一步的研究。

4 結(jié) 論

在Marc-145細胞中穩(wěn)定表達GP5可以通過下調(diào)IFN的表達在PRRSV感染早期促進病毒復(fù)制，利用特異性siRNA干擾GP5表達可以抑制PRRSV復(fù)制，GP5對PRRSV復(fù)制具有調(diào)控作用。

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