朱 璐，燕 霞，代 科，王正皓，趙玉佳，楊 振，文心田，曹三杰，黃小波，伍 銳，趙 勤，文翼平*(.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院豬病研究中心，成都 630；.成都大熊貓繁育研究基地，成都 6008)

犬瘟熱(canine distemper，CD)是由副黏病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒屬(Morbillivirus)的犬瘟熱病毒(canine distemper virus, CDV)引起的在食肉目動(dòng)物中廣泛傳播的急性高度接觸性傳染病[1-3]。CDV給犬、貂等經(jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)和大熊貓等特種動(dòng)物的保護(hù)及生物多樣性帶來(lái)極大損失，其社會(huì)公共危害性越來(lái)越受到人們重視[4]。犬瘟熱病毒對(duì)外界環(huán)境特別敏感，分離病毒不易，嚴(yán)重制約對(duì)CDV的深入研究。有學(xué)者利用Vero細(xì)胞系、MDCK細(xì)胞系和倉(cāng)鼠細(xì)胞系BHK21分離CDV，需要盲傳多代才有可能觀察到細(xì)胞病變(cytopathic effect, CPE)，且不是所有CDV毒株感染Vero細(xì)胞和BHK21細(xì)胞后都能產(chǎn)生CPE，能適應(yīng)Vero細(xì)胞生長(zhǎng)的CDV多為疫苗株(如Onderstepoort株)，野毒株很少能適應(yīng)Vero細(xì)胞和BHK21細(xì)胞[4]。也有報(bào)道稱(chēng)隨著野毒株適應(yīng)以上細(xì)胞生長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致天然毒力丟失[5]，且在Vero、MDCK和BHK21等細(xì)胞上傳代的CDV基因容易發(fā)生突變[6]。近年來(lái)研究人員發(fā)現(xiàn)信號(hào)淋巴激活分子(signaling lymphocyte activation molecule，SLAM 又稱(chēng) CD150)是麻疹病毒屬的病毒受體[5，7]。Seki等[8]構(gòu)建表達(dá)犬SLAM受體的Vero細(xì)胞系(Vero.DogSLAMtag)，更容易使犬源的CDV在Vero.DogSLAMtag細(xì)胞系上產(chǎn)生病變，并且不會(huì)導(dǎo)致病毒變異，表達(dá)犬SLAM受體的Vero細(xì)胞系可以在接種病料24 h后高效率地分離到CDV，利用Vero.DogSLAMtag細(xì)胞和B95a細(xì)胞對(duì)野生型CDV的分離率分別為71%和43%，表明存在較大差異。

SLAM主要在人和動(dòng)物的胸腺、激活淋巴細(xì)胞、成熟樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞中表達(dá)[9]，在未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板中無(wú)法有效進(jìn)行檢測(cè)[10]。在非淋巴器官(如小腸、腎、腦和心)中也都沒(méi)有檢測(cè)到SLAM mRNA的表達(dá)[11]。有學(xué)者報(bào)道，麻疹病毒的感染可引起SLAM的表達(dá)水平上調(diào)[12]，但麻疹病毒感染過(guò)程中SLAM表達(dá)量趨于穩(wěn)定[13]，表達(dá)量不會(huì)隨著感染時(shí)間變化而變化。另一項(xiàng)研究感染組SLAM表達(dá)量顯著高于未感染對(duì)照組，表明CDV感染引起SLAM表達(dá)的上調(diào)[14]。本研究擬從CDV陽(yáng)性犬外周血中分離淋巴細(xì)胞，獲取SLAM基因，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)CDV受體SLAM的Vero細(xì)胞系和BHK21細(xì)胞系，比較兩者對(duì)于臨床CDV分離的敏感性，確定能夠在體外快速分離CDV野毒株的細(xì)胞系，為其毒力及致病性等相關(guān)研究提供可靠的生物材料和研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 生物材料 Vero細(xì)胞系、BHK21細(xì)胞系、pcDNA3.1(-)質(zhì)粒均由本實(shí)驗(yàn)室保存，2017年來(lái)源于四川省成都市區(qū)、大邑縣、都江堰的3份犬CDV的陽(yáng)性病料由本實(shí)驗(yàn)室保存于-80 ℃冰箱。Pcaggs-HA真核表達(dá)載體購(gòu)自西南地區(qū)淼靈質(zhì)粒生物公司。

1.1.2 主要試劑和儀器XhoⅠ、BglⅡ、EcoRⅠ、SalⅠ等限制性?xún)?nèi)切酶、mini BEST Universal RNA Extraction Kit、高保真聚合酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR擴(kuò)增體系 Premix-Taq酶(TaKaRa公司)；Histopaque-1077淋巴細(xì)胞分離液(SIGAMA公司)；One step Cloning Kit(vazyme 公司)；無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒(OMEGA公司)；胎牛血清、DMEM和G418(Invitrogen 公司)；瓊脂糖凝膠回收試劑盒(WizardSV Gel and PCR Clean-up system)(Promega公司)；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000(Life Technologies公司)；CDV-NP-MAB(VMRD公司)；兔anti-HA-tag抗體(Abcam公司)；FITC(Fluorescein Isothiocyanate)異硫氰酸熒光素標(biāo)記山羊抗兔IgG(生工公司)；PAGE凝膠制備試劑盒(佰合科技公司)；凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD)；熒光倒置顯微鏡(尼康)。

1.1.3 引物的合成 犬SLAM受體引物、擴(kuò)增Neo基因引物和鑒定CDV特異性引物均由TaKaRa公司合成。引物序列如表1所示。

表1引物序列

Table1Sequenceofprimers

引物Primer序列(5′→3′)SequenceS?FGCGAATTCATGGATTCCAGGGGCTTCS?RGCAGATCTTCAGCTCTCTGGGAACGTCACNo?S?FGCCTCGAGACAGGGAGAGCTTGATGATNeo?F?SalⅠAAAAGTGCCACCTGGGTCGACCTGTGGAATGTGTGTCAGTNeo?R?SalⅠTAGTCAATAATCAATGTCGACTCAGAAGAACTCGTCAAGA1GATAAAGCATGTCATTATAGTCCTAAA2CTTGAGCTTTCGACCCTTCP1CGGAAATCAACGGACCTAAATP2TCCTTGAGCTTTCGACCCTT

1.2 Pcag-SLAM表達(dá)載體的構(gòu)建

1.2.1 Pcaggs-Neo-HA-Igk-HA表達(dá)載體的構(gòu)建 以pcDNA3.1(-)為模板，以Neo-F-SalⅠ和Neo-R-SalⅠ為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增含SV40啟動(dòng)子的Neo基因，PCR反應(yīng)體系：高保真聚合酶12.5 μL，上下游引物各1.5 μL，質(zhì)粒模板2 μL，ddH2O補(bǔ)齊25 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 40 s，34個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。獲取Neo基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，并利用純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物。限制性?xún)?nèi)切酶SalⅠ單酶切線性化Pcaggs-HA載體并純化，利用同源重組的方法將純化產(chǎn)物Neo基因插入單酶切線性化Pcaggs-HA載體的SalⅠ酶切位點(diǎn)。反應(yīng)體系與試驗(yàn)步驟按One step Cloning Kit說(shuō)明書(shū)操作。將反應(yīng)產(chǎn)物冷卻后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)化獲得的菌液涂于含抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，挑單個(gè)細(xì)菌至LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，并通過(guò)PCR和酶切的方法鑒定插入片段正確后，在Pcaggs-Neo-HA載體的多克隆位點(diǎn)EcoRⅠ和XhoⅠ之間插入含有Igk鏈信號(hào)肽和HA標(biāo)簽的28個(gè)氨基酸(H2-METDTLLLWVLLLWVPGSTGDYPYDVPD-COOH)的基因片段GAATTCGCCACCATGGAGACAGA-CACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGG-GTTCCAGGTTCCACTGGTGACTATCCATATG-ATGTTCCAGATTATGCTGGGGCCCTCGAG，構(gòu)建Pcaggs-Neo-HA-Igk-HA載體。

1.2.2SLAM基因的克隆和Pcag-SLAM真核表達(dá)載體的構(gòu)建 無(wú)菌采集CDV陽(yáng)性犬外周抗凝血20 mL，按照Histopaque-1077淋巴細(xì)胞分離液說(shuō)明書(shū)操作分離外周血淋巴細(xì)胞。按TaKaRa的RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取犬外周血淋巴細(xì)胞總mRNA，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑合成cDNA后，用S-F/S-R引物對(duì)擴(kuò)增犬SLAM基因。將犬SLAM基因克隆到pMD18-T Simple 載體上，克隆的基因片段送生工生物工程公司測(cè)序后與NCBI GenBank已經(jīng)發(fā)表的犬SLAM的DNA序列(AF325357)比對(duì)正確后，通過(guò)網(wǎng)站(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)出SLAM基因的信號(hào)肽，然后設(shè)計(jì)去信號(hào)肽的引物no-S-F和S-R擴(kuò)增去信號(hào)肽的SLAM基因片段，將克隆的去信號(hào)肽的SLAM基因片段插入到Pcaggs-Neo-HA-Igk-HA的多克隆位點(diǎn)XhoⅠ和BglⅡ之間，通過(guò)PCR、酶切等方法鑒定插入片段的方向正確后，構(gòu)建得到Pcaggs-Neo-HA-Igk-HA-SLAM真核表達(dá)載體，命名為Pcag-SLAM。

1.3 G418篩選濃度的確定

在25 cm2細(xì)胞瓶培養(yǎng)生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Vero細(xì)胞和BHK21細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化、離心后棄去上清液，用12 mL含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液加至12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，5% CO2，37 ℃ 培養(yǎng)箱培養(yǎng)待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)單層，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗2次，更換不同質(zhì)量濃度梯度G418的DMEM篩選培養(yǎng)基(質(zhì)量濃度依次為0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0 mg·mL-1)，每個(gè)梯度設(shè)4個(gè)重復(fù)孔。每3 d更換一次篩選培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)14 d，每天觀察細(xì)胞死亡情況，以第7天細(xì)胞全部死亡的最低G418濃度為最適篩選濃度。以第14天細(xì)胞全部死亡的G418濃度的1/2為維持培養(yǎng)濃度。

1.4 Vero細(xì)胞和BHK21細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及克隆篩選

1.4.1 Vero細(xì)胞和BHK21細(xì)胞轉(zhuǎn)染Pcag-SLAM真核表達(dá)載體 無(wú)血清無(wú)抗生素DMEM培養(yǎng)基稀釋Pcag-SLAM重組質(zhì)粒，質(zhì)量濃度達(dá)到1 500 ng·μL-1以后，參照Lipofectamine?2000 Reagent轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)同時(shí)轉(zhuǎn)染長(zhǎng)至90%的Vero細(xì)胞和BHK21單層細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后更換含2% FBS和篩選濃度G418的DMEM培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)置轉(zhuǎn)染對(duì)照組，待對(duì)照組細(xì)胞全部死亡，對(duì)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞消化傳代，通過(guò)RT-PCR鑒定細(xì)胞是否轉(zhuǎn)染成功。

1.4.2 SLAM-Vero細(xì)胞及SLAM-BHK21細(xì)胞單克隆篩選 PCR鑒定SLAM陽(yáng)性的SLAM-Vero細(xì)胞和SLAM-BHK21細(xì)胞分別鋪于96孔板，每孔添加篩選濃度的G418，2% FBS DMEM培養(yǎng)基，用稀釋篩選法篩選出單克隆的SLAM-Vero細(xì)胞和SLAM-BHK21細(xì)胞，經(jīng)間接免疫熒光法鑒定，確定篩選出穩(wěn)定表達(dá)SLAM受體的Vero細(xì)胞和BHK21細(xì)胞，分別命名為SLAM-Vero細(xì)胞和SLAM-BHK21細(xì)胞。

1.4.3 SLAM-Vero細(xì)胞和SLAM-BHK21細(xì)胞間接免疫熒光鑒定 在12孔板中分別接種篩選得到的單克隆SLAM-Vero 細(xì)胞和SLAM-BHK21細(xì)胞，以及普通Vero細(xì)胞、BHK21細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，用PBS清洗2次，每孔加入500 μL 4% PFA(多聚甲醛)固定液4 ℃ 固定12 h，棄上清，PBS清洗3次，棄上清，每孔加入500 μL 0.25% TritonX 100/PBS 4 ℃ 作用12 h，棄上清，PBST清洗3次；用300 μL 5% BSA封閉液，4 ℃封閉12 h，之后對(duì)抗兔anti-HA一抗進(jìn)行稀釋?zhuān)靠准尤?50 μL稀釋好的一抗，4 ℃作用12 h；用PBS稀釋的FITC 標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗，每孔加入350 μL的二抗，37 ℃ 作用45 min，棄上清，PBST清洗3次，每孔滴加10 μL含DAPI封片劑。用熒光顯微鏡觀察并且存照。

1.4.4SLAM基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)的鑒定 選取間接免疫熒光鑒定結(jié)果最亮的SLAM-Vero細(xì)胞和SLAM-BHK21細(xì)胞克隆株連續(xù)傳代，將第10、20、50代細(xì)胞凍存。凍存細(xì)胞復(fù)蘇傳代后提取其mRNA，反轉(zhuǎn)錄后，用no-S-F/S-R引物對(duì)檢測(cè)SLAM基因mRNA，并用HA-tag MAb對(duì)SLAM-Vero細(xì)胞和SLAM-BHK21細(xì)胞的SLAM基因融合蛋白表達(dá)進(jìn)行Western blot 鑒定。

1.5 利用不同組織分離CDV 的情況比較

選擇3只不同時(shí)間不同地點(diǎn)來(lái)源CDV陽(yáng)性犬，取其肺、腦、脾、淋巴、腸內(nèi)容物這5種病料加液氮研磨，然后加雙抗和DMEM(體積比1∶1∶8)制成細(xì)胞懸液，經(jīng)3凍3融處理后4 ℃、10 000 r·min-1離心15 min，將上清轉(zhuǎn)入新離心管，用0.22 μm的濾器過(guò)濾除菌，分別取1 mL濾液接種SLAM-Vero 細(xì)胞、Vero細(xì)胞、SLAM-BHK21細(xì)胞和BHK21細(xì)胞，置于CO2培養(yǎng)箱37 ℃孵育1.5 h后，棄上清，PBS洗2次，更換含2% FBS，維持濃度 G418的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)5 d收毒后繼續(xù)接毒傳代，同時(shí)設(shè)置不經(jīng)處理的SLAM-Vero 細(xì)胞、Vero細(xì)胞、SLAM-BHK21細(xì)胞和BHK21細(xì)胞作為對(duì)照組。每代收毒后均用引物(A1/A2和P1/P2)進(jìn)行RT-PCR鑒定，結(jié)果為陽(yáng)性的一直傳代,直至出現(xiàn)穩(wěn)定的CPE。

1.6 CDV分離株間接免疫熒光鑒定(IFA)

將本研究分離到的三株CDV接種到SLAM-Vero單層細(xì)胞中，并設(shè)置陰性對(duì)照組，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)48 h后，棄細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞單層固定，通透和封閉后，以抗CDV-NP MAb為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記山羊抗鼠IgG為二抗進(jìn)行IFA鑒定，最后滴加DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色。

2 結(jié) 果

2.1 Pcag-SLAM表達(dá)載體的構(gòu)建

按“1.2.1”的方法將擴(kuò)增到的含SV40啟動(dòng)子的Neo基因和Igk-HA氨基酸的編碼序列插入到Pcaggs-HA表達(dá)載體，用PCR方法擴(kuò)增Neo基因和Igk-HA基因，并將產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果表明在1 259 bp處出現(xiàn)Neo特異性擴(kuò)增片段，在120 bp處出現(xiàn)Igk-HA特異性擴(kuò)增片段，二者均與預(yù)期結(jié)果相符(圖1)。Pcaggs-Neo-HA-Igk-HA載體具有抗新霉素活性，能用于轉(zhuǎn)染后陽(yáng)性細(xì)胞篩選；含有的HA標(biāo)簽可用于外源蛋白鑒定；Igk鏈信號(hào)肽能增強(qiáng)外源蛋白表達(dá)，并使表達(dá)外源蛋白錨定在細(xì)胞膜表面。按照“1.2.2”的方法從CDV陽(yáng)性犬的外周血內(nèi)提取到SLAM受體，并將其克隆到pMD18-T Simple 載體上，經(jīng)生工生物公司測(cè)序正確后再擴(kuò)增去信號(hào)肽的SLAM基因片段，并將其插入到Pcaggs-Neo-HA-Igk-HA載體內(nèi)，構(gòu)建得到Pcaggs-Neo-HA-Igk-HA-SLAM真核表達(dá)載體，命名為Pcag-SLAM。SLAM基因 cDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示。

M、M1. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～6. SV40 Neo基因片段(1 259 bp)； 8～10. Igk-HA基因片段(120 bp)；7、11. 陰性對(duì)照M. DNA marker DL5000; M1. DNA marker DL1000 ; 1-6. SV40 Neo gene fragment; 8-10. Igk-HA gene fragment; 7, 11. Negative control

圖1 含SV40啟動(dòng)子的Neo基因擴(kuò)增和Igk-HA基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification of Neo gene with SV40 promoter and amplification of Igk-HA gene

M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. 陰性對(duì)照；2～5.去信號(hào)肽的SLAM基因cDNAM. DNA marker DL5000; 1. Negative control; 2-5. SLAM gene without signaling peptide cDNA

圖2 去信號(hào)肽的SLAM基因RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis results of SLAM gene without signaling peptide RT-PCR products

2.2 G418篩選濃度的確定

Vero細(xì)胞加入含不同質(zhì)量濃度G418的培養(yǎng)液，培養(yǎng)至第4天，1.6 mg·mL-1組30%的細(xì)胞死亡，2.2 mg·mL-1組60%的細(xì)胞死亡，2.4 mg·mL-1組90%的細(xì)胞死亡，2.8 mg·mL-1組98%的細(xì)胞死亡，3.0 mg·mL-1組細(xì)胞全部死亡；培養(yǎng)至第14天，2.0 mg·mL-1組細(xì)胞全部死亡，則確定Vero細(xì)胞的G418最適篩選濃度為3.0 mg·mL-1，G418維持濃度為1.0 mg·mL-1。用同樣的方法得到確定BHK21細(xì)胞G418最適篩選濃度為2.2 mg·mL-1，維持濃度為0.8 mg·mL-1。

2.3 Vero細(xì)胞和BHK21細(xì)胞轉(zhuǎn)染及克隆篩選

Pcag-SLAM重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Vero細(xì)胞和BHK21細(xì)胞后通過(guò)RT-PCR的方法初次鑒定SLAM基因的表達(dá)后，通過(guò)G418壓力篩選與稀釋篩選法結(jié)合，篩選出穩(wěn)定表達(dá)SLAM受體的Vero細(xì)胞和BHK21細(xì)胞，以HA-tag MAb為一抗，通過(guò)間接免疫熒光法(圖3)和Western blot(圖4)鑒定SLAM受體的表達(dá)。間接免疫熒光法結(jié)果顯示SLAM基因傳代至F50代都可以穩(wěn)定地表達(dá)，Western blot結(jié)果表明在49.5和39 ku處可以檢測(cè)到2個(gè)蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)大小與預(yù)期結(jié)果一致。

2.4 利用不同細(xì)胞接種不同病料分離CDV情況的比較

3只CDV陽(yáng)性犬分別命名DJY-5.4、CD-5.7和DY-6.3，每只犬取肺、脾、腦、淋巴、腸內(nèi)容物5種共15份病料按“1.5”的方法分別接種在SLAM-Vero細(xì)胞、Vero細(xì)胞、SLAM-BHK21細(xì)胞和BHK21細(xì)胞上分離CDV，最終CD-5.7-肺，DY-6.3-肺和DY-6.3-脾在SLAM-Vero細(xì)胞分離到CDV，且分離株均可以在細(xì)胞上產(chǎn)生明顯穩(wěn)定的病變(圖5), SLAM-Vero細(xì)胞在接毒后12 h出現(xiàn)融合體細(xì)胞，呈現(xiàn)多核巨細(xì)胞樣，第24小時(shí)細(xì)胞融合處出現(xiàn)星狀收縮，培養(yǎng)至72 h有細(xì)胞脫落。CD-5.7-肺和DY-6.3- 肺在傳代第6代出現(xiàn)明顯病變，DY-6.3-脾在第3代出現(xiàn)明顯病變，分離株通過(guò)引物A1A2和引物P1P2進(jìn)行鑒定，結(jié)果與預(yù)期相符，證實(shí)其為CDV(圖6)。而其余組織(腦、淋巴、腸內(nèi)容物)在SLAM-Vero細(xì)胞上傳代2次后RT-PCR檢測(cè)結(jié)果均為陰性，無(wú)法繼續(xù)傳代。所有15份病料在SLAM-BHK21細(xì)胞、BHK21細(xì)胞以及Vero細(xì)胞上均無(wú)法進(jìn)行增殖傳代。

A. BHK21細(xì)胞(60×)； B. SLAM-BHK21細(xì)胞(60×)；C. F50代SLAM-BHK21細(xì)胞(60×)；D. Vero細(xì)胞(60×；E. SLAM-Vero細(xì)胞(60×)；F. F50代SLAM-Vero細(xì)胞(60×)；Bar=10 μmA. BHK21 cell (60×); B. SLAM-BHK21 cell (60×); C. The F50 passage of SLAM-BHK21 cells transfected stably (60×); D. Vero cell (60×); E. SLAM-Vero cell (60×); F. The F50 passage of SLAM-Vero cells transfected stably (60×); Bar=10 μm

圖3 SLAM基因融合蛋白IFA鑒定Fig.3 SLAM gene fusion protein expression in SLAM-Vero cell and SLAM-BHK21 cell based on HA MAb Indirect immunofluorescence assay

M. 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. SLAM-BHK21細(xì)胞；2. F50代SLAM-BHK21細(xì)胞；3. SLAM-Vero細(xì)胞；4. F50代SLAM-Vero細(xì)胞；5. BHK21細(xì)胞；6. Vero細(xì)胞M. Protein molecular weight marker; 1. SLAM-BHK21 cells; 2. The F50 passage of SLAM-BHK21 cells; 3. SLAM-Vero cells; 4. The F50 passage of SLAM-Vero cells; 5. BHK21 cells; 6. Vero cells

圖4 Western blot法鑒定SLAM-BHK21細(xì)胞和SLAM-Vero細(xì)胞的SLAM基因融合蛋白表達(dá)情況Fig.4 Western blot identification of SLAM gene fusion protein in SLAM-BHK21 cells and SLAM-Vero cells

2.5 CDV的IFA鑒定結(jié)果

以CDV-NP MAb作為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG為二抗，對(duì)分離株進(jìn)行IFA鑒定，結(jié)果顯示分離株感染SLAM-Vero細(xì)胞出現(xiàn)綠色熒光(圖7)，普通Vero細(xì)胞接毒后無(wú)特異性熒光，正常SLAM-Vero對(duì)照組細(xì)胞無(wú)特異性熒光，進(jìn)一步表明該分離株為CDV。

A. SLAM-Vero細(xì)胞對(duì)照組120 h；B. Vero細(xì)胞接毒后120 h；C. SLAM-Vero細(xì)胞接毒后12 h；D. SLAM-Vero細(xì)胞接毒后120 hA. SLAM-Vero cell negative control 120 hpi; B. Vero cell inoculated with CDV 120 hpi; C. SLAM-Vero cell inoculated with CDV 12 hpi; D. SLAM-Vero cell inoculated with CDV 120 hpi

圖5 Vero細(xì)胞和SLAM-Vero細(xì)胞接種犬瘟熱病毒后CPE圖(20×)Fig.5 CPE of Vero and SLAM-Vero cell inoculated by CDV positive samples (20×)

A. A1A2引物鑒定CDV(335 bp)；B. P1P2引物鑒定CDV(242 bp)；M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. CD-5.7-肺；2. DY-6.3-肺；3. DY-6.3-脾；4. 陰性對(duì)照A. Identification of CDV by A1A2 primer (335 bp)；B. Identification of CDV by P1P2 primer (242 bp)；M. DL5000 DNA marker; 1. CD-5.7-lung; 2. DY-6.3-lung; 3. DY-6.3-spleen; 4. Negative control

圖6 CDV的 RT-PCR電泳結(jié)果Fig.6 Electrophoresis of RT-PCR product of CDV

A. CDV 感染SLAM-Vero細(xì)胞(10×)；B、C. CDV 感染SLAM-Vero細(xì)胞(40×)，藍(lán)色為細(xì)胞核A. SLAM-Vero inoculated with CDV(10×); B, C. SLAM-Vero inoculated with CDV(40×), the nucleus DAPI stained blue

圖7 CDV的IFA鑒定結(jié)果Fig.7 IFA identification results of CDV

3 討 論

CDV的分離通常通過(guò)原代細(xì)胞和傳代細(xì)胞來(lái)進(jìn)行，原代細(xì)胞包括犬巨噬細(xì)胞、犬淋巴細(xì)胞等，但原代細(xì)胞可傳代次數(shù)少且不容易獲得，不利于病毒的保存[15]；傳代細(xì)胞主要有Vero細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、BHK21細(xì)胞等，通常適應(yīng)了這些細(xì)胞的毒株多數(shù)為疫苗株，例如Onderstepoort 株和Rockborn株，但這些細(xì)胞不利于野毒株的分離[16]。通常，當(dāng)CDV野毒株適應(yīng)了沒(méi)有CDV受體SLAM的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，會(huì)導(dǎo)致病毒的天然毒力丟失[17]。近年來(lái)許多研究已經(jīng)證實(shí)，SLAM是表達(dá)在宿主免疫細(xì)胞膜上的一種糖蛋白[18]，是麻疹病毒屬病毒的淋巴細(xì)胞趨向性、宿主特異性和組織趨向性的主要決定因素之一[19-20]。Seki等[8]證明表達(dá)SLAM的Vero細(xì)胞比B95a細(xì)胞對(duì)CDV更敏感，表達(dá)SLAM的Vero細(xì)胞系是CDV的理想宿主。他們構(gòu)建的表達(dá)SLAM的Vero細(xì)胞可以利用脾分離到CDV[8]，本研究構(gòu)建的SLAM-Vero細(xì)胞系利用脾和肺均可以分離到CDV。目前在國(guó)內(nèi)表達(dá)SLAM受體的SLAM-Vero細(xì)胞系仍未商品化，在此之前，本人利用無(wú)SLAM受體的Vero細(xì)胞分離CDV，很長(zhǎng)時(shí)間一直未分離到CDV野毒株，構(gòu)建成功該細(xì)胞系后，很順利地分離到2株野生型CDV，因此構(gòu)建一株SLAM-Vero細(xì)胞系對(duì)CDV的研究顯得尤為重要。

本研究從犬瘟熱陽(yáng)性犬的外周血中提取淋巴細(xì)胞，并成功擴(kuò)增到SLAM基因。通過(guò)分子克隆技術(shù)將去信號(hào)肽的SLAM基因片段插入到Pcaggs-Neo-HA-Igk-HA載體，構(gòu)成Pcaggs-HA-Neo-Igk-HA-SLAM真核表達(dá)載體，命名為Pcag-SLAM。該載體存在兩個(gè)HA-tag用于SLAM-HA融合蛋白表達(dá)情況的檢測(cè)，每個(gè)HA-tag前各有一個(gè)啟動(dòng)子，兩個(gè)HA-tag和SLAM基因共用一個(gè)終止子，若SLAM基因無(wú)法表達(dá)，則檢測(cè)不到任何蛋白；當(dāng)SLAM-HA融合蛋白完全表達(dá)的情況下可檢測(cè)到與預(yù)期一致，大小分別是39和49.5 ku的2個(gè)HA蛋白。

本研究在培養(yǎng)時(shí)間、分離方法均相同的條件下，利用兩種表達(dá)SLAM受體的細(xì)胞系分離CDV野毒株，比較兩種細(xì)胞在CDV野毒株分離時(shí)的敏感性，結(jié)果表明，3例犬瘟熱病例中有2例可以利用SLAM-Vero細(xì)胞分離到CDV，且在接毒后12 h就可看到明顯的細(xì)胞病變。而這三例CDV均無(wú)法在SLAM-BHK21細(xì)胞上生長(zhǎng)。出現(xiàn)這一結(jié)果可能的原因是CDV有兩個(gè)包膜糖蛋白，分別是血凝素蛋白(H)和融合蛋白(F)，這兩個(gè)蛋白共同介導(dǎo)病毒與細(xì)胞受體結(jié)合以及膜融合[21-22]，由于CDV野毒株基因的不同，導(dǎo)致對(duì)不同細(xì)胞的親和性有差異[20]。本研究分離到的2株CDV野毒株可以在SLAM-Vero細(xì)胞上穩(wěn)定地生長(zhǎng)，而無(wú)法在SLAM-BHK21細(xì)胞上生長(zhǎng)，說(shuō)明還有未知的蛋白或者氨基酸位點(diǎn)影響CDV對(duì)不同細(xì)胞系的親和力。本實(shí)驗(yàn)室仍繼續(xù)利用這兩種細(xì)胞系分離野毒株，根據(jù)現(xiàn)有研究的結(jié)果顯示表達(dá)SLAM受體的Vero細(xì)胞系較表達(dá)SLAM受體的BHK21細(xì)胞系對(duì)本地區(qū)CDV野毒株的分離率相對(duì)較高。

Qiao等[23]利用一只犬的肺分離出一株CDV強(qiáng)毒株。趙建軍等[24]利用犬的肺和脾在表達(dá)犬SLAM受體的Vero細(xì)胞分離出一株CDV。本研究將3只CDV陽(yáng)性犬的肺、脾、淋巴結(jié)、大腦、腸內(nèi)容物經(jīng)處理后，將上清接種于SLAM-Vero細(xì)胞和SLAM-BHK21細(xì)胞，最終從肺和脾分離出病毒，而淋巴結(jié)、大腦和腸內(nèi)容物雖然可以通過(guò)RT-PCR檢測(cè)到特異性擴(kuò)增片段，但體外分離效果不理想，這也許與病毒的組織趨向性有關(guān)。

4 結(jié) 論

成功構(gòu)建了表達(dá)犬瘟熱病毒受體SLAM的SLAM-Vero細(xì)胞系和SLAM-BHK21細(xì)胞系，通過(guò)對(duì)其接種3株不同來(lái)源的犬瘟熱臨床樣本的5種不同組織，發(fā)現(xiàn)在分離CDV野毒株時(shí)選擇肺和脾更容易在表達(dá)SLAM受體的細(xì)胞系上分離出病毒。同時(shí)發(fā)現(xiàn)SLAM-Vero細(xì)胞比SLAM-BHK21細(xì)胞對(duì)CDV野毒株的分離率高，且病變明顯，為CDV野毒株的快速分離與研究提供了有效的工具。

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