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        環(huán)境高溫誘導(dǎo)巴馬香豬睪丸細(xì)胞凋亡并激活Nrf2/HO-1抗氧化信號通路

        2018-07-04 07:59:52李延森李照見賈瀟瀟李春梅南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院南京210095
        畜牧獸醫(yī)學(xué)報 2018年6期

        李延森,李照見,賈瀟瀟,李春梅(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,南京 210095)

        夏季環(huán)境高溫引起的公豬熱應(yīng)激是困擾公豬生產(chǎn)的一大難題。隨著全球氣候變暖趨勢加劇,近年來許多地區(qū),特別是長江中下游地區(qū)相繼出現(xiàn)夏季持續(xù)性高溫高熱天氣,一些城市(武漢、南京、蘇州、上海、杭州)夏季高溫更是突破40 ℃,致使畜舍飼養(yǎng)環(huán)境溫度大幅升高。夏季高溫會引起公豬生理內(nèi)分泌紊亂和公豬睪丸機(jī)能障礙,精液品質(zhì)下降[1],間接導(dǎo)致母豬受胎率降低和胎兒不良發(fā)育[2],進(jìn)而降低生豬生產(chǎn)能力,給畜牧業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。研究發(fā)現(xiàn),高溫引起的睪丸組織氧化應(yīng)激以及生精上皮細(xì)胞凋亡和死亡,直接導(dǎo)致生精上皮損傷,精子活力和密度的降低[3-4]。核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)信號通路能夠顯著誘導(dǎo)機(jī)體內(nèi)源性抗氧化應(yīng)答,其缺失或激活障礙,會加劇氧化應(yīng)激程度,使細(xì)胞內(nèi)正常氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡,導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙,引起細(xì)胞毒性,細(xì)胞凋亡或死亡,它是目前發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞抗氧化應(yīng)答的核心途徑之一[5-6]。血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1, HO-1)能被各種引起細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的因素所誘導(dǎo),其mRNA和蛋白質(zhì)在組織中的表達(dá)上調(diào)通常也被認(rèn)為是氧化應(yīng)激的標(biāo)志,HO-1及其催化產(chǎn)物作為體內(nèi)具有高活性的抗氧化成分,能高效清除細(xì)胞過量的活性氧,緩解細(xì)胞應(yīng)激,維持細(xì)胞氧化還原平衡,發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用[7]。已有研究表明,Nrf2蛋白和HO-1蛋白可以在睪丸間質(zhì)細(xì)胞高水平表達(dá),可有效緩解應(yīng)激原引起的睪丸組織細(xì)胞損傷和精子生成障礙[8-10]。然而,目前與睪丸組織細(xì)胞Nrf2蛋白和HO-1蛋白表達(dá)相關(guān)研究只局限在人或鼠上,還未發(fā)現(xiàn)豬睪丸組織細(xì)胞中表達(dá)定位Nrf2蛋白和HO-1蛋白的報道,也沒有發(fā)現(xiàn)測定豬睪丸組織細(xì)胞Nrf2蛋白通路或HO-1蛋白表達(dá)模式的研究報道。因此,本試驗旨在通過研究高溫環(huán)境對巴馬香豬陰囊溫度分布和睪丸組織中抗氧化和細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,揭示豬陰囊散熱機(jī)制,明確豬睪丸組織細(xì)胞中Nrf2蛋白和HO-1蛋白表達(dá)定位模式,為探索從細(xì)胞抗氧化分子機(jī)制方面緩解高溫環(huán)境導(dǎo)致的公豬精液品質(zhì)下降提供參考依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 試驗動物

        選取巴馬香豬(泰州泰和生物科技有限公司)為試驗對象。

        1.2 試驗設(shè)計

        選取7月齡體重相近雄性巴馬香豬(平均體重(17.93±0.91) kg)12頭,隨機(jī)分成2組,對照組和高溫組,每組6頭。對照組飼養(yǎng)環(huán)境溫度保持在25 ℃,高溫組飼養(yǎng)環(huán)境溫度為24 h從25~40 ℃循環(huán)變溫(變溫分4個階段:①09:00-10:00, 25 ℃→40 ℃;②10:00-15:00, 40 ℃;③ 15:00-16:00, 40 ℃→26 ℃;④16:00-09:00, 25 ℃),連續(xù)8 d。高溫期間使用熱成像儀(TiR27,F(xiàn)luke Corporation,Washington,USA)記錄動物體表溫度和陰囊皮膚溫度分布。測量陰囊皮膚溫度數(shù)值是指單次測量時整個陰囊皮膚溫度的平均值。體表溫度數(shù)值是指單次測量時整個體表溫度,包括動物頭、耳朵、軀體、四肢和尾巴表面溫度的平均值。測量的溫度數(shù)值通過Fluke Smart View 3.1 圖像分析軟件分析所得。

        1.3 樣品采集與處理

        第8天高溫處理結(jié)束后,取豬睪丸器官,浸于4%多聚甲醛溶液,用于免疫組織化學(xué)檢測抗氧化通路標(biāo)志蛋白Nrf2,抗氧化蛋白HO-1和細(xì)胞凋亡標(biāo)志蛋白(cleaved caspase 3,c-caspase 3)的組織表達(dá)情況。

        1.4 組織切片和免疫組織化學(xué)檢測

        4%多聚甲醛溶液固定好的睪丸組織,依次分別通過梯度酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋和切片,制作睪丸組織石蠟切片;然后,依次通過二甲苯和梯度酒精脫蠟止水后,用3% H2O2-甲醇處理1 h,消除內(nèi)源性過氧化物酶活性;再用0.01 mol·L-1檸檬酸三鈉(pH=6.0)微波爐抗原熱修復(fù)10 min,冷卻,0.01 mol·L-1PBS(pH=7.2~7.4)洗滌3次;10%上樣血清封閉1 h,甩干,分別加一抗Nrf2抗體(abcam, ab53019),HO-1抗體(abcam, ab13248),c-caspase 3(cell signaling, 9661S)抗體過夜;甩去一抗,PBS搖床洗3次,甩干,加二抗,濕盒孵育2 h,PBS搖床洗3次,甩干,加SARC濕盒孵育1 h,PBS搖床洗3次,DAB顯色,鏡檢蛋白著色表達(dá)情況;蘇木素復(fù)染40 s,沖洗返藍(lán),常規(guī)脫水,透明,封片,最后鏡檢拍照。光鏡下觀察,棕色顆粒染色表示蛋白呈陽性。利用Image Pro Plus 6.0 軟件(media cybernetics bethesda, MD, USA)分析對照組和高溫組睪丸組織Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)情況。對細(xì)胞核陽性表達(dá)c-caspase 3的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù),分別獲得細(xì)胞核陽性表達(dá)c-caspase3細(xì)胞的百分比。

        1.5 數(shù)據(jù)分析

        采用GraphPad Prism Version 5.0 統(tǒng)計軟件(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,所有數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM)”表示,對照組和高溫組睪丸組織蛋白表達(dá)采用t檢驗進(jìn)行差異顯著性分析,P<0.05表示差異顯著。

        2 結(jié) 果

        2.1 環(huán)境高溫對巴馬香豬體表溫度和陰囊皮膚溫度分布的影響

        由表1可知,高溫組豬體表溫度顯著升高,升高幅度達(dá)到1.9 ℃,所測體表溫度范圍中最大溫度點為39.7 ℃,最小溫度點為34.9 ℃,對照組最大溫度點為38.8℃,最小溫度點為28.0 ℃;高溫組豬陰囊表面平均溫度顯著升高,升高幅度達(dá)到3.7 ℃,所測陰囊表面溫度范圍中最大溫度點為38.4 ℃,最小溫度點為36.3 ℃,對照組分別為最大溫度點為35.0 ℃,最小溫度點為31.7 ℃,最大溫度和最小溫度分別升高3.4 ℃和4.6 ℃。高溫組陰囊皮膚升高溫度幅度大于體表溫度升高幅度。與對照組相比,高溫組豬活動減少,表現(xiàn)嗜睡。由圖1可知,豬體體表溫度升高幅度較高部分為豬頭、耳朵、四肢以及背部,相比之下腹部溫度升高幅度較低。發(fā)射率表示物體表面輻射出的能量與相同溫度的黑體輻射能量的比率。

        表1環(huán)境高溫對巴馬香豬體表溫度和陰囊皮膚溫度參數(shù)的影響

        Table1EffectofhighambienttemperatureonbodyandscrotalsurfacetemperaturesinBamaminiaturepig

        部位Position分組Treatment平均溫度/℃Avergetemperature最小溫度/℃Minimumtemperature最大溫度/℃Maximumtemperature發(fā)射率Emissivity體表Bodysurface對照Thermalneutral36.6±1.14a28.038.80.95高溫Heat?treated38.5±0.59b34.939.70.95陰囊表面Scrotalsurface對照Thermalneutral33.4±0.71?31.735.00.95高溫Heat?treated37.1±0.37?36.338.40.95

        同列數(shù)據(jù)上標(biāo)小寫字母不同表示體表溫度組間差異顯著(P<0.05),*.陰囊表面溫度組間差異顯著(P<0.05)(n=6)

        Differentsmall letters in the same colum means significant difference in the body surface between the thermal neutral and the heat-treated treatments(P<0.05),* in the same colum means significant difference in the scrotal surface between the thermal neutral and the heat-treated treatments(P<0.05)(n=6)

        A.對照組豬熱紅外分布圖;B.對照組豬可見光圖;C. 高溫組豬熱紅外分布圖;D. 高溫組豬可見光圖。T.睪丸A.The infrared images of pigs in the thermal neutral group;B.The infrared images of pigs in the thermal neutral group;C.The visible images of pigs in the heat-treated group;D.The visible images of pigs in the heat-treated group.T.Testis

        圖1 環(huán)境高溫條件下巴馬香豬體表和陰囊皮膚熱紅外分布圖Fig.1 The infrared distribution images of body and scrotal surface in Bama miniature pig under high ambient temperature

        2.2 環(huán)境高溫對巴馬香豬睪丸組織Nrf2蛋白表達(dá)的影響

        由圖2可知,Nrf2蛋白主要在睪丸間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)(圖2A1,B1,C,D),在睪丸生精小管表達(dá)較低(圖2A2,B2)。高溫環(huán)境影響巴馬香豬睪丸組織Nrf2蛋白表達(dá),主要對睪丸間質(zhì)細(xì)胞中Nrf2蛋白表達(dá)產(chǎn)生顯著影響,與對照組相比,高溫組睪丸間質(zhì)細(xì)胞Nrf2蛋白表達(dá)顯著升高(圖2E,P<0.05)。對照組睪丸間質(zhì)細(xì)胞核顯示為藍(lán)色,而高溫組睪丸間質(zhì)細(xì)胞核顯示為明顯的棕色(圖2 B1),這說明細(xì)胞核Nrf2蛋白表達(dá)明顯升高。高溫環(huán)境影響巴馬香豬睪丸生精小管上皮組織Nrf2蛋白表達(dá),與對照組相比,高溫組睪丸生精上皮組織Nrf2蛋白表達(dá)顯著升高(圖2E,P<0.05)

        2.3 環(huán)境高溫對巴馬香豬睪丸組織HO-1蛋白表達(dá)的影響

        由圖3可知,HO-1蛋白主要在睪丸間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)(圖3 A1,B1,C,D),在睪丸生精小管表達(dá)較低(圖3 A2,B2),與Nrf2表達(dá)模式相似,不同的是HO-1蛋白在高溫組和對照組睪丸間質(zhì)細(xì)胞核的表達(dá)相似,高溫組并沒有出現(xiàn)明顯的細(xì)胞核HO-1蛋白棕色染色現(xiàn)象,這證明了Nrf2的核轉(zhuǎn)錄因子作用。高溫環(huán)境影響巴馬香豬睪丸組織HO-1蛋白表達(dá),主要對睪丸間質(zhì)細(xì)胞中HO-1蛋白表達(dá)產(chǎn)生顯著影響,與對照組相比,高溫組睪丸間質(zhì)細(xì)胞HO-1蛋白表達(dá)顯著升高(圖3E,P<0.05),對照組睪丸間質(zhì)細(xì)胞核與高溫組睪丸間質(zhì)細(xì)胞核都表現(xiàn)藍(lán)色(圖3 B1),說明高溫不改變細(xì)胞核HO-1蛋白表達(dá),或者高溫不促進(jìn)HO-1蛋白在細(xì)胞核中累積。高溫環(huán)境影響巴馬香豬睪丸生精小管上皮組織HO-1蛋白表達(dá),與對照組相比,高溫組睪丸生精上皮組織HO-1蛋白表達(dá)顯著升高(圖3E,P<0.05)。

        2.4 環(huán)境高溫對巴馬香豬睪丸組織細(xì)胞核陽性表達(dá)c-caspase 3蛋白細(xì)胞百分比的影響

        由圖4可知,正常情況下,睪丸間質(zhì)和睪丸生精上皮細(xì)胞核都會陽性表達(dá)c-caspase 3蛋白,與對照組相比,在高溫組豬睪丸間質(zhì)和睪丸生精上皮細(xì)胞核陽性表達(dá)c-caspase 3蛋白細(xì)胞百分比顯著升高(圖4E,A1與B1,A2與B2之間差異顯著,P<0.05),其中,睪丸間質(zhì)細(xì)胞核陽性表達(dá)c-caspase 3蛋白細(xì)胞百分比由8.5%升高至32.5%,升高2.8倍,高溫組睪丸生精上皮細(xì)胞核陽性表達(dá)c-caspase 3蛋白細(xì)胞百分比由3.5%升高至29.8%,升高7.5倍,相比間質(zhì)細(xì)胞升高更為明顯。

        睪丸組織Nrf2蛋白免疫組織化學(xué)染色:A.對照組;A1.對照組睪丸間質(zhì)細(xì)胞染色;A2.對照組睪丸生精上皮染色;B.高溫組;B1.高溫組睪丸間質(zhì)細(xì)胞染色;B2.高溫組睪丸生精上皮染色;→.Nrf2蛋白染色的睪丸間質(zhì)細(xì)胞,紅色長方形代表Nrf2在睪丸間質(zhì)細(xì)胞表達(dá),黃色長方形代表Nrf2在睪丸生精上皮細(xì)胞表達(dá),棕色為蛋白陽性表達(dá),藍(lán)色為細(xì)胞核染色。ipp軟件增強(qiáng)睪丸組織Nrf2蛋白免疫組織化學(xué)染色為紅色:C.對照組;D.高溫組;E.ipp軟件分析對應(yīng)睪丸不同區(qū)域A1、A2、B1和B2的Nrf2蛋白染色的平均光密度。*.A1和B1、A2和B2,P<0.05。下同Immunohistochemical detection of Nrf2 in the thermal neutral group (A) and the heat-treated group (B). The red and yellow rectangles enlarged immunohistochemical detection of Nrf2 in testicular interstitial cells of the thermal neutral group (A1) and the heat-treated group (B1),and immunohistochemical detection of Nrf2 in testicular seminiferous epithelium of the thermal neutral group (A2) and the heat-treated group (B2). The immunohistochemical signal appears brown; the counterstained background appears blue. →.Stained interstitial cells. E.The quantitative evaluation of mean density of Nrf2 immunostaining in interstitial cells and seminiferous epithelium of the thermal neutral group (C) and the heat-treated group (D),and Nrf2 immunostaining areas are highlighted in red colour. *.A1 and B1,A2and B2,P<0.05. The same as below

        圖2 環(huán)境高溫對巴馬香豬睪丸組織Nrf2蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effect of high ambient temperature on the testicular Nrf2 protein expression in Bama miniature pig

        睪丸組織HO-1蛋白免疫組織化學(xué)染色:A.對照組;A1.對照組睪丸間質(zhì)細(xì)胞染色;A2.對照組睪丸生精上皮染色;B.高溫組;B1.高溫組睪丸間質(zhì)細(xì)胞染色;B2.高溫組睪丸生精上皮染色;→.HO-1蛋白染色的睪丸間質(zhì)細(xì)胞,紅色長方形代表HO-1在睪丸間質(zhì)細(xì)胞表達(dá),黃色長方形代表HO-1在睪丸生精上皮細(xì)胞表達(dá),棕色為蛋白陽性表達(dá),藍(lán)色為細(xì)胞核染色。ipp軟件增強(qiáng)睪丸組織HO-1蛋白免疫組織化學(xué)染色為紅色:C.對照組;D.高溫組;E.ipp軟件分析對應(yīng)睪丸不同區(qū)域A1,A2,B1,B2的Nrf2蛋白染色的平均光密度Immunohistochemical detection of HO-1 in the thermal neutral group (A) and the heat-treated group (B). The red and yellow rectangles enlarged immunohistochemical detection of HO-1 in testicular interstitial cells of the thermal neutral group (A1) and the heat-treated group (B1),and immunohistochemical detection of HO-1 in testicular seminiferous epithelium of the thermal neutral group (A2) and the heat-treated group (B2). The immunohistochemical signal appears brown. The counterstained background appears blue. →, stained interstitial cells. E. The quantitative evaluation of mean density of HO-1 immunostaining in interstitial cells and seminiferous epithelium of the thermal neutral group (C) and the heat-treated group (D), and HO-1 immunostaining areas are highlighted in red colour

        圖3 環(huán)境高溫對巴馬香豬睪丸組織HO-1蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of high ambient temperature on the testicular HO-1 protein expression in Bama miniature pig

        睪丸組織細(xì)胞核陽性表達(dá)c-caspase 3蛋白的細(xì)胞:A.對照組;A1.對照組睪丸間質(zhì)細(xì)胞核陽性表達(dá)c-caspase 3蛋白的細(xì)胞;A2.對照組睪丸生精上皮細(xì)胞核陽性表達(dá)c-caspase 3蛋白的細(xì)胞;B.高溫組;B1.高溫組睪丸間質(zhì)細(xì)胞核陽性表達(dá)c-caspase 3蛋白的細(xì)胞;B2.高溫組睪丸生精上皮細(xì)胞核陽性表達(dá)c-caspase 3蛋白的細(xì)胞;→.睪丸間質(zhì)細(xì)胞核陽性表達(dá)c-caspase 3蛋白的細(xì)胞;↑.生精上皮細(xì)胞核陽性表達(dá)c-caspase 3蛋白的細(xì)胞;紅色長方形代表c-caspase 3在睪丸間質(zhì)細(xì)胞表達(dá),黃色長方形代表c-caspase 3在睪丸生精上皮細(xì)胞表達(dá),棕色表示c-caspase 3蛋白陽性表達(dá)。E.睪丸不同區(qū)域A1,A2,B1,B2的細(xì)胞核陽性表達(dá)c-caspase 3蛋白的細(xì)胞百分比Percentage of cellswith c-caspase 3-positive nucleuses in the thermal neutral group and the heat-treated group. Sections of control (A) and heated testes (B). The red and yellow rectangles enlarged immunohistochemical detection of c-caspase 3-positive interstitial cells of the thermal neutral group (A1) and the heat-treated group (B1),and immunohistochemical detection of c-caspase 3-positive germ cells in testicular seminiferous epithelium of the thermal neutral group (A2) and the heat-treated group (B2).→.c-caspase 3-positive interstitial cells;↑.c-caspase 3-positive germ cells;The positive cells appear brown in colour. E. The percentage of positive cells in the thermal neutral group and the heat-treated group

        圖4 環(huán)境高溫對巴馬香豬睪丸組織細(xì)胞核陽性表達(dá)c-caspase 3蛋白的細(xì)胞百分比的影響Fig.4 Effect of high ambient temperature on percentage of cells with the c-caspase 3-positive nucleuses in testes of Bama miniature pig

        3 討 論

        3.1 環(huán)境高溫對巴馬香豬體表溫度和陰囊皮膚溫度分布影響

        豬皮膚表面溫度受自身體溫和外界環(huán)境的雙重影響,一般距離體核較遠(yuǎn),皮毛較少,散熱面積較大部位,變化較大。如果環(huán)境溫度高于體表溫度,機(jī)體蒸發(fā)散熱須排除體內(nèi)產(chǎn)熱和自然得熱,才能維持體溫正常,只有汗腺機(jī)能發(fā)達(dá)的靈長類可以通過加強(qiáng)蒸發(fā)散熱維持體溫正常,一般家畜很難維持體溫恒定[11]。豬汗腺不發(fā)達(dá),高溫環(huán)境主要通過加強(qiáng)呼吸道蒸發(fā)散熱維持體溫,如果高溫持續(xù)時間較久,便很難維持體溫恒定。余進(jìn)等[12]將中國實驗用小型豬暴露于高于豬體表溫度40 ℃的環(huán)境溫度中,與暴露之前相比豬體表溫度和直腸溫度顯著升高,表現(xiàn)呼吸急促,排尿減少,喜飲水或滾臥糞尿。Li等[13]利用FLUKE TiR27紅外成像儀對高溫環(huán)境中小鼠的體表溫度和陰囊溫度測定發(fā)現(xiàn),體表溫度和陰囊溫度顯著升高,同時直腸溫度也顯著升高。對夏季高溫期間公豬直腸溫度和陰囊皮膚溫度測定發(fā)現(xiàn),當(dāng)環(huán)境溫度處于35 ℃時,公豬直腸溫度升高幅度接近1 ℃,陰囊皮膚溫度升高幅度接近3.5 ℃[14]。在本試驗中,高溫組豬體表溫度和陰囊表面平均溫度顯著升高,陰囊皮膚溫度仍舊明顯低于體表皮膚溫度,但陰囊皮膚升高溫度幅度>體表溫度升高幅度。由于豬陰囊皮膚有豐富的汗腺,并且肉膜能在氣溫升高時變松弛使陰囊變薄,而豬皮膚汗腺退化,所以在高溫時陰囊皮膚較體表皮膚蒸發(fā)散熱更強(qiáng),使得高溫組陰囊皮膚溫度仍低于體表溫度。同時,本試驗也表明當(dāng)環(huán)境溫度高于一定值后,陰囊的熱調(diào)節(jié)功能達(dá)到極致,隨著體核溫度升高睪丸溫度也伴隨升高,陰囊皮膚溫度升高幅度變大。

        3.2 環(huán)境高溫對巴馬香豬睪丸組織Nrf2蛋白表達(dá)影響

        抗氧化信號通路Nrf2/ARE (antioxidant responsive element, ARE)是機(jī)體抵抗內(nèi)外環(huán)境應(yīng)激的重要防御性轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一。細(xì)胞正常代謝時,轉(zhuǎn)錄因子Nrf2在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中含量處于相對穩(wěn)定狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞處于環(huán)境應(yīng)激狀態(tài)時,細(xì)胞質(zhì)中的Nrf2轉(zhuǎn)位入核,使細(xì)胞核中Nrf2含量升高,增加其與核內(nèi)抗氧化應(yīng)答元件上GCTGAGTCA位點結(jié)合,提高ARE調(diào)控的多種解毒酶及抗氧化酶基因表達(dá),增強(qiáng)細(xì)胞對環(huán)境應(yīng)激的抗性,進(jìn)而維持細(xì)胞和組織器官內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[15]。小鼠高溫環(huán)境熱應(yīng)激和小鼠陰囊水浴局部熱應(yīng)激都能夠顯著誘導(dǎo)睪丸間質(zhì)細(xì)胞和生精上皮細(xì)胞中Nrf2蛋白表達(dá),并促使睪丸間質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)Nrf2蛋白轉(zhuǎn)位入核[13,16]。利用Western blot方法測定陰囊局部熱應(yīng)激小鼠睪丸細(xì)胞胞質(zhì)和胞核中Nrf2蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn),高溫可促使睪丸細(xì)胞中胞質(zhì)Nrf2向胞核中轉(zhuǎn)移累積的現(xiàn)象[17]。除此,很多體內(nèi)外研究也發(fā)現(xiàn)Nrf2蛋白不僅在睪丸間質(zhì)細(xì)胞表達(dá),而且在應(yīng)對外界應(yīng)激導(dǎo)致的損傷以及維持間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌功能發(fā)揮重要作用[8,18]。本研究結(jié)果表明,環(huán)境高溫顯著增加豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞和生精上皮組織Nrf2蛋白表達(dá),其中睪丸間質(zhì)細(xì)胞中Nrf2表達(dá)更高,入核現(xiàn)象更明顯。由此可見,豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞可高效表達(dá)Nrf2蛋白,并且豬在受到高溫環(huán)境暴露時會有效激活睪丸間質(zhì)細(xì)胞中Nrf2蛋白通路,這可能在一定程度上維持了睪丸間質(zhì)細(xì)胞的正常功能,緩解高溫誘導(dǎo)的睪丸溫度升高對生精上皮造成的損傷。

        3.3 環(huán)境高溫對巴馬香豬睪丸組織HO-1蛋白表達(dá)影響

        HO-1即熱休克蛋白32,能被各種引起細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷因素所誘導(dǎo),包括高氧、缺氧、熱休克、內(nèi)毒素、過氧化氫、紫外線和重金屬等,其mRNA和蛋白質(zhì)在組織中的上調(diào)表達(dá)通常也被認(rèn)為是氧化應(yīng)激的標(biāo)志[7]。在細(xì)胞應(yīng)激發(fā)生時,HO-1作為血紅素降解的起始酶和限速酶能快速催化應(yīng)激誘導(dǎo)紅細(xì)胞破壞產(chǎn)生的血紅素,其催化產(chǎn)生的膽綠素、CO以及亞鐵作為體內(nèi)具有高活性的抗氧化成分,能高效清除細(xì)胞內(nèi)由應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧,維持細(xì)胞氧化還原平衡和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài),緩解血紅素毒性和細(xì)胞應(yīng)激,發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用[19]。近年研究發(fā)現(xiàn),睪丸間質(zhì)細(xì)胞受到環(huán)境應(yīng)激后,能夠通過上調(diào)HO-1的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá),緩解柴油機(jī)納米顆粒物等環(huán)境應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡或死亡[20-21]。HO-1可受許多上游信號激活,其中核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2是通過結(jié)合ARE序列激活HO-1啟動子,啟動HO-1 mRNA表達(dá)。因此,通過Nrf2/ARE信號通路上調(diào)HO-1表達(dá)也已成為近年研究者攻克細(xì)胞氧化應(yīng)激難題的首要選擇[22]。本研究結(jié)果表明,在睪丸組織中,環(huán)境高溫主要誘導(dǎo)睪丸間質(zhì)細(xì)胞中HO-1蛋白高水平表達(dá),這說明豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞可高效表達(dá)HO-1蛋白,并通過啟動HO-1蛋白表達(dá),抵抗環(huán)境高溫引起的睪丸組織損傷??紤]到高溫同時誘導(dǎo)了睪丸間質(zhì)細(xì)胞Nrf2蛋白入核,這表明高溫可能是通過激活Nrf2/ARE/HO-1信號通路間接上調(diào)HO-1表達(dá),進(jìn)而發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。

        3.4 環(huán)境高溫對巴馬香豬睪丸組織細(xì)胞核陽性表達(dá)cleaved caspase 3蛋白細(xì)胞百分比影響

        一般情況下,有絲分裂活動旺盛的細(xì)胞,如癌細(xì)胞和生殖細(xì)胞,比體細(xì)胞更易受到熱應(yīng)激影響。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活率和溫度之間存在一定關(guān)系,當(dāng)細(xì)胞溫度處于或高于42.5 ℃左右,大多數(shù)細(xì)胞存活率快速下降,對于生精細(xì)胞,溫度超過36.5 ℃時,會導(dǎo)致生精細(xì)胞凋亡,當(dāng)溫度超過43 ℃時,生精細(xì)胞則主要表現(xiàn)為壞死[23]。在體內(nèi),熱誘導(dǎo)細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)在不同細(xì)胞的表現(xiàn)也不同,精母細(xì)胞和早期精子細(xì)胞,不具有熱耐受性,很容易出現(xiàn)細(xì)胞凋亡,而支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞具有完善的抗氧化體系和較強(qiáng)的熱耐受性,對溫度的敏感性較低[24]。免疫組織化學(xué)染色方法測定熱應(yīng)激大白公豬睪丸組織中c-caspase 3蛋白表達(dá),發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激處理會誘導(dǎo)公豬睪丸支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞c-caspase 3蛋白表達(dá),并且大量生精細(xì)胞細(xì)胞核呈c-caspase 3蛋白陽性著色[25]。本研究結(jié)果表明,環(huán)境高溫誘導(dǎo)豬睪丸間質(zhì)和睪丸生精上皮細(xì)胞核陽性表達(dá)c-caspase 3蛋白,并且睪丸生精上皮細(xì)胞核陽性表達(dá)c-caspase 3蛋白的細(xì)胞百分比升高幅度更為明顯,這說明環(huán)境高溫可誘導(dǎo)公豬睪丸組織細(xì)胞凋亡。由于生精細(xì)胞熱耐受性較間質(zhì)細(xì)胞弱,因此睪丸生精上皮細(xì)胞比睪丸間質(zhì)細(xì)胞對高溫反應(yīng)更加敏感,出現(xiàn)凋亡的比例也更多。

        4 結(jié) 論

        本研究表明,豬睪丸組織間質(zhì)細(xì)胞和生精上皮細(xì)胞可表達(dá)Nrf2蛋白和HO-1蛋白。環(huán)境高溫可促進(jìn)睪丸間質(zhì)細(xì)胞Nrf2蛋白入核,并且高效表達(dá)HO-1蛋白。環(huán)境高溫會誘導(dǎo)公豬睪丸組織細(xì)胞凋亡,其中生精上皮細(xì)胞比睪丸間質(zhì)細(xì)胞對高溫更加敏感,出現(xiàn)凋亡比例更多,這可能是由于環(huán)境溫度超過了陰囊的最大熱調(diào)節(jié)功能范圍,隨著體核溫度升高睪丸溫度也伴隨升高,進(jìn)而引起細(xì)胞應(yīng)激損傷,最終導(dǎo)致豬睪丸組織細(xì)胞凋亡增加。同時,激活的Nrf2信號通路和高效表達(dá)的HO-1蛋白,是豬睪丸組織通過體內(nèi)分子途徑緩解高溫環(huán)境誘導(dǎo)損傷的有效措施,也給體內(nèi)尋找解決熱應(yīng)激導(dǎo)致公豬精液品質(zhì)下降難題,提供潛在的有效分子靶點。

        參考文獻(xiàn)(References):

        [1] 李延森, 曹 云, 王愛華, 等. 南通地區(qū)不同品種公豬夏季精液品質(zhì)變化[J]. 畜牧與獸醫(yī), 2014, 46(10): 40-42.

        LI Y S, CAO Y, WANG A H, et al. The changes in boar semen quality of different type strains in the area of Nantong during hot summer[J].AnimalHusbandry&VeterinaryMedicine, 2014, 46(10): 40-42. (in Chinese)

        [2] 李延森, 沈祥星, 李春梅. 母豬發(fā)情和產(chǎn)仔性能與環(huán)境溫度變化相關(guān)性分析[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報, 2016, 47(6): 1133-1139.

        LI Y S, SHEN X X, LI C M. Correlation analysis between the ambient temperatures and reproductive performance of sows[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica, 2016, 47(6): 1133-1139. (in Chinese)

        [3] PAUL C, TENG S, SAUNDERS P T K. A single, mild, transient scrotal heat stress causes hypoxia and oxidative stress in mouse testes, which induces germ cell death[J].BiolReprod, 2009, 80(5): 913-919.

        [4] ZHANG M Q, JIANG M, BI Y, et al. Autophagy and apoptosis act as partners to induce germ cell death after heat stress in mice[J].PLoSOne, 2012, 7(7): e41412.

        [5] SPORNM B, LIBY K T. Nrf2 and cancer: The good, the bad and the importance of context[J].NatRevCancer, 2012, 12(8): 564-571.

        [6] BELLK F, AL-MUBARAK B, FOWLER J H, et al. Mild oxidative stress activates Nrf2 in astrocytes, which contributes to neuroprotective ischemic preconditioning[J].ProcNatlAcadSciUSA, 2011, 108(1): E1-E2.

        [7] SOARESM P, BACH F H. Heme oxygenase-1: From biology to therapeutic potential[J].TrendsMolMed, 2009, 15(2): 50-58.

        [8] SHEN B, WANG W, DING L, et al. Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 rescues the oxidative stress induced by di-N-butylphthalate in testicular Leydig cells[J].HumExpToxicol, 2015, 32(2): 145-152.

        [9] SHIRAISHI K, NAITO K. Increased expression of Leydig cell haem oxygenase-1 preserves spermatogenesis in varicocele[J].HumReprod, 2005, 20(9): 2608-2613.

        [10] BAE W J, HA U S, CHOI J B, et al. Protective effect of decursin extracted from Angelica gigas in male infertility via Nrf2/HO-1 signaling pathway[J].OxidMedCellLongev, 2016, 2016: 5901098.

        [11] 顏培實, 李如治. 家畜環(huán)境衛(wèi)生學(xué)[M]. 北京: 高等教育出版社, 2011.

        YAN P S, LI R Z. Domestic animals and environmental hygiene[M]. Beijing: China Higher Education Press, 2011. (in Chinese)

        [12] YU J, YIN P, LIU F H, et al. Effect of heat stress on the porcine small intestine: A morphological and gene expression study[J].CompBiochemPhysiolA, 2010, 156(1): 119-128.

        [13] LI Y S, HUANG Y, PIAO Y G, et al. Protective effects of nuclear factor erythroid 2-related factor 2 on whole body heat stress-induced oxidative damage in the mouse testis[J].ReprodBiolEndocrin, 2013, 11: 23.

        [14] LI Y S, WANG A H, TAYA K, et al. Declining semen quality and steadying seminal plasma ions in heat-stressed boar model[J].ReprodMedBiol, 2015, 14(4): 171-177.

        [15] MAHER J, YAMAMOTO M. The rise of antioxidant signaling-the evolution and hormetic actions of Nrf2[J].ToxicolApplPharmacol, 2010, 244(1): 4-15.

        [16] LI Y S, CAO Y, WANG F, et al. Scrotal heat induced the Nrf2-driven antioxidant response during oxidative stress and apoptosis in the mouse testis[J].ActaHistochem, 2014, 116(5): 883-890.

        [17] LI Y S, CAO Y, WANG F, et al.Tert-butylhydroquinone attenuates scrotal heat-induced damage by regulating Nrf2-antioxidant system in the mouse testis[J].GenCompEndocrinol, 2014, 208: 12-20.

        [18] CHEN H L, JIN S Y, GUO J J, et al. Knockout of the transcription factorNrf2: Effects on testosterone production by aging mouse Leydig cells[J].MolCellEndocrinol, 2015, 409: 113-120.

        [19] STOCKER R. Induction of haem oxygenase as a defence against oxidative stress[J].FreeRadicResCommun, 1990, 9(2): 101-112.

        [20] KOMATSU T, TABATA M, KUBO-IRIE M, et al. The effects of nanoparticles on mouse testis Leydig cellsinvitro[J].Toxicolinvitro, 2008, 22(8): 1825-1831.

        [21] OZAWA N, GODA N, MAKINO N, et al. Leydig cell-derived heme oxygenase-1 regulates apoptosis of premeiotic germ cells in response to stress[J].JClinInvest, 2002, 109(4): 457-467.

        [22] ALAM J, COOK J L. How many transcription factors does it take to turn on the heme oxygenase-1 gene?[J].AmJRespirCellMolBiol, 2007, 36(2): 166-174.

        [23] AGARWAL A, JOHN A R, ALVAREZ J G. Studies on men’s health and fertility[M]. New Jersey: Humana Press, 2012.

        [24] HARDY M P, GANJAM V K. Stress, 11β-HSD, and Leydig cell function[J].JAndrol, 1997, 18(5): 475-479.

        [25] 范小瑞, 張 禛, 席華明, 等. 熱應(yīng)激對豬睪丸Cyt-C和Caspase-3表達(dá)的影響[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2017, 50(5): 924-931.

        FAN X R, ZHANG Z, XI H M, et al. Effect of heat stress on the expression of Cyt-C and Caspase-3 in boar testis[J].ScientiaAgriculturaSinica, 2017, 50(5): 924-931. (in Chinese)

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