邢義珅，胡 鑫，任 玲，王亞慧，徐凌洋，李俊雅，張路培(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

肉用動(dòng)物的肌肉產(chǎn)量主要由肌纖維數(shù)量和截面直徑直接決定[1]。胎兒期是動(dòng)物骨骼肌發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期，出生后個(gè)體骨骼肌的發(fā)育主要表現(xiàn)為肌纖維的增大，而肌纖維的數(shù)量基本上不再增加[2]。因此，研究胎兒期的骨骼肌發(fā)育，對(duì)于肉用家畜來(lái)說(shuō)具有非常重要的意義。在哺乳動(dòng)物的骨骼肌發(fā)育過(guò)程中，多種細(xì)胞信號(hào)分子和轉(zhuǎn)錄因子參與了肌細(xì)胞的增殖和分化[3]。除此之外，microRNA(miRNA)作為一類重要的非編碼RNA，通過(guò)其序列、結(jié)構(gòu)、豐度和轉(zhuǎn)錄方式的多樣性，在骨骼肌發(fā)育等許多生物過(guò)程中調(diào)控基因表達(dá)[4]。

miRNA是一類在真核生物中廣泛表達(dá)的內(nèi)源性小分子單鏈RNA，成熟后長(zhǎng)度在22個(gè)核苷酸左右[5]。miRNA通過(guò)與靶向mRNA的3′UTR區(qū)域進(jìn)行特異性的堿基互補(bǔ)配對(duì)，引起靶向mRNA的降解或轉(zhuǎn)錄活性穩(wěn)定下降，抑制其翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后層面抑制基因的表達(dá)[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA能夠參與機(jī)體的多種生命活動(dòng)，包括細(xì)胞增殖分化和凋亡、新陳代謝、疾病發(fā)生、干細(xì)胞自我更新以及腫瘤發(fā)生等[8-12]。隨著研究的深入，人們對(duì)miRNA調(diào)控骨骼肌發(fā)育的理解也越來(lái)越透徹，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)眾多的miRNA廣泛地作用于控制細(xì)胞成肌分化的相關(guān)基因，對(duì)成肌分化產(chǎn)生重要影響[13]。miR-1抑制HDAC4的表達(dá)，促進(jìn)非洲爪蛙肌細(xì)胞分化[4]；miR-27b可以抑制Pax3的表達(dá)，從而抑制小鼠胎兒細(xì)胞進(jìn)入骨骼肌發(fā)育的過(guò)程[14]；miR-206能夠作用于多個(gè)與肌肉分化相關(guān)的基因來(lái)影響動(dòng)物肌肉的發(fā)育[15-16]；miR-125b能夠作用于IGF-II，抑制成肌細(xì)胞的分化[17]等。

關(guān)于牛肌肉發(fā)育的miRNA已經(jīng)有一些報(bào)道[18]，但大都停留在成體水平，關(guān)于胎兒骨骼肌分化相關(guān)miRNA動(dòng)態(tài)變化的研究鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)牛胎兒來(lái)源的骨骼肌細(xì)胞分化始末差異表達(dá)miRNA進(jìn)行篩查與鑒定，挖掘與牛胎兒期肌肉發(fā)育相關(guān)的miRNA，同時(shí)，采用熒光定量PCR技術(shù)驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果的可靠性，為后續(xù)研究牛胎兒骨骼肌發(fā)育提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 成肌細(xì)胞 試驗(yàn)細(xì)胞來(lái)源于3頭4月齡的牛胎兒背最長(zhǎng)肌組織。試驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)操作符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例(國(guó)家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)，2017第3次修訂)，母牛屠宰后取出子宮，迅速帶回中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，用于分離培養(yǎng)成肌細(xì)胞。

1.1.2 主要試劑和儀器 Ⅳ型膠原酶購(gòu)自Sigma公司；低糖DMEM、胎牛血清、馬血清、青鏈霉素雙抗和胰酶購(gòu)自Gibco公司；TRIzol Reagent購(gòu)自Invitrogen 公司； miRcute miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit和miRcute Plus miRNA qPCR Detection Kit購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。熒光定量PCR儀為ABI Q7。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞分離和培養(yǎng) 用75%的乙醇對(duì)子宮進(jìn)行消毒處理，用手術(shù)剪剪開(kāi)子宮取出牛胎兒。用手術(shù)刀剝開(kāi)胎兒背部皮膚，取背最長(zhǎng)肌組織置于PBS中。

取約200 mg肌肉組織置于1.8 mL離心管中，用眼科剪將其剪成1 mm3大小的肉糜，加入1 mg·mL-1的IV型膠原酶(溶于低糖DMEM培養(yǎng)基)1 mL，放入37 ℃恒溫空氣浴搖床中進(jìn)行消化，每隔15 min取出離心管，用移液器進(jìn)行吹打。消化45 min后取出離心管，先用孔徑為100 μm的尼龍網(wǎng)篩過(guò)濾，再用孔徑為40 μm的尼龍網(wǎng)篩過(guò)濾，得到含有單細(xì)胞的懸液，1 000 r·min-1離心5 min，棄去上清液后得到細(xì)胞沉淀，加生長(zhǎng)培養(yǎng)基(10%胎牛血清+89% L-DMEM+1%青鏈霉素雙抗)后接種于培養(yǎng)皿中。

原代成肌細(xì)胞融合度達(dá)到約70%時(shí)，用0.25%的胰酶消化傳代，將細(xì)胞接種到細(xì)胞培養(yǎng)板中，每2 d更換1次培養(yǎng)基，在細(xì)胞融合度達(dá)到100%時(shí)，收取0 d的樣品，同時(shí)將其它細(xì)胞更換為分化培養(yǎng)基(5%馬血清+94% L-DMEM+1%青鏈霉素雙抗)，每2 d更換1次培養(yǎng)基，培養(yǎng)成肌細(xì)胞至分化終末，收取樣品于-80 ℃冰箱內(nèi)保存。

1.2.2 總RNA的提取、質(zhì)量檢測(cè)及測(cè)序文庫(kù)的建立 依照TRIzol試劑說(shuō)明書(shū)的操作步驟來(lái)提取總RNA，用分光光度計(jì)測(cè)定總RNA的濃度和純度。取總RNA進(jìn)行電泳，檢驗(yàn)所提取總RNA的完整性。利用Aglient 2100對(duì)樣品濃度精確定量。RNA樣品總量、濃度、RIN值、OD260 mm/OD280 mm都符合標(biāo)準(zhǔn)后，按照Small RNA Sample pre Kit說(shuō)明書(shū)步驟構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。

1.2.3 測(cè)序數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析

1.2.3.1 文庫(kù)上機(jī)測(cè)序和數(shù)據(jù)的預(yù)處理： 用illumina MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)構(gòu)建好的文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，然后對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估。原始數(shù)據(jù)文件經(jīng)過(guò)堿基識(shí)別分析轉(zhuǎn)化為原始測(cè)序序列，分別去除低質(zhì)量(質(zhì)量值Q≤5的堿基數(shù)占整個(gè)read的50%以上的reads)、有5′接頭污染、沒(méi)有3′接頭序列、沒(méi)有插入片段、長(zhǎng)度小于18 nt的reads，去除poly A的reads，最終得到clean reads。

1.2.3.2 序列分析和統(tǒng)計(jì)： 統(tǒng)計(jì)得到clean reads在長(zhǎng)度上的分布，將clean reads與Rfam(v10.0)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，統(tǒng)計(jì)rRNA、scRNA、snRNA、snoRNA及tRNA的比例，去除5類ncRNA(non-coding RNAs)后，再與?；蚪M(Bos_Taurus_Ensembl_release-80/Bos_taurus.UMD3.1)進(jìn)行比對(duì)，統(tǒng)計(jì)比對(duì)到基因組sRNA(small RNAs)的數(shù)量。用mirDeep2(v2.0.0.5)軟件檢測(cè)已知miRNA。用去除了5類ncRNA的sRNAs與miRbase(v19.0)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，檢測(cè)已知miRNA，并統(tǒng)計(jì)表達(dá)量。

1.2.3.3 差異表達(dá)miRNA的分析及其靶基因預(yù)測(cè)： 根據(jù)得到的成熟miRNA在各個(gè)文庫(kù)中的表達(dá)量，用edgeR(v3.20.1)軟件進(jìn)行miRNA的差異表達(dá)分析，得到成肌細(xì)胞分化始末差異表達(dá)的miRNA。依據(jù)miRNA與其靶位點(diǎn)的互補(bǔ)性、miRNA靶位點(diǎn)的保守性、miRNA-mRNA雙鏈之間的熱穩(wěn)定性及附近序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)等原則，綜合利用miRanda(v3.3a)和RNAhybrid來(lái)預(yù)測(cè)靶基因，統(tǒng)計(jì)差異表達(dá)miRNA的靶基因。用topGO(v2.30.0)軟件對(duì)差異表達(dá)miRNA對(duì)應(yīng)的靶基因進(jìn)行富集分析。

1.2.4 反轉(zhuǎn)錄和qPCR驗(yàn)證 為了驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，隨機(jī)選取8個(gè)表達(dá)量較高的差異表達(dá)miRNA，分別檢測(cè)其在成肌細(xì)胞分化始末的表達(dá)量。以U6作為內(nèi)參，分別根據(jù)miRNA的序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR的上游引物，下游引物由試劑盒提供(未列出)，引物信息見(jiàn)表1。引物由上海生工生物科技有限公司合成。

按照miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒(KR201)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成miRNA對(duì)應(yīng)的cDNA第一鏈。熒光定量PCR按照miRcute增強(qiáng)型miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒(FP411)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。反應(yīng)體系為20 μL：2×miRcute增強(qiáng)型miRNA定量預(yù)混試劑(含SYBR和ROX)10 μL，反向引物(10 μmol·L-1)0.4 μL，正向引物 (10 μL)0.4 μL，cDNA 2 μL，無(wú)核酶ddH2O補(bǔ)至20 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 min；94 ℃變性20 s，60 ℃退火延伸34 s，共40個(gè)循環(huán)。

表1RT-PCR正向引物序列

Table1RT-PCRforwardprimersequences

引物名稱Primername引物序列(5′→3′)Primersequencebta?miR?148a?FCGCCTCAGTGCACTACAGAACTTTGbta?miR?1?FCGCCGTGGAATGTAAAGAAGTATGTATbta?miR?34a?FCGTGGCAGTGTCTTAGCTGGTTGTbta?miR?7?FCGCTGGAAGACTAGTGATTTTGTTGTTbta?miR?27a?5p?FAGGGCTTAGCTGCTTGTGAGCAbta?miR?26a?FCGGTTCAAGTAATCCAGGATAGGCTbta?miR?199a?5p?FCGCCCAGTGTTCAGACTACCTGTTbta?miR?143?FGGTTGAGATGAAGCACTGTAGCTCGbta?U6?FCGCTTCACGAATTTGCGTGTCATbta?U6?RGCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 用SPSS 19.0軟件的t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P<0.01表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 牛胎兒骨骼成肌細(xì)胞培養(yǎng)及總RNA提取

用膠原酶消化法從4月齡的牛胎兒骨骼肌中分離成肌細(xì)胞，可以看到單個(gè)細(xì)胞呈纖維狀，形態(tài)比較一致，將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，約2 d后細(xì)胞融合度達(dá)到70%，傳代至六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種細(xì)胞約為1×105個(gè)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后(圖1A)更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)分化，5 d后(圖1B)可以看到，大量細(xì)胞融合形成長(zhǎng)條狀的肌管，肌管受到冷刺激時(shí)，可以進(jìn)行有節(jié)律的舒縮運(yùn)動(dòng)，表明肌管成熟，成肌細(xì)胞分化至終末階段。

提取總RNA，分光光度計(jì)檢測(cè)顯示，總RNA OD260 mm/OD280 mm>1.8，OD260 mm/OD230 mm>2.0，電泳結(jié)果顯示總RNA完整性良好(圖略)，無(wú)明顯降解。

圖1 牛胎兒骨骼肌來(lái)源的成肌細(xì)胞分化0(A)和5 d(B)的明場(chǎng)照片(標(biāo)尺：100 μm)Fig.1 Bright field pictures of myoblasts isolated from bovine fetal skeletal muscle differentiated on 0(A) and 5 d(B)(bar: 100 μm)

2.2 測(cè)序結(jié)果及數(shù)據(jù)處理

2.2.1 高通量測(cè)序數(shù)據(jù) 將得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，去除污染和低質(zhì)量序列后，得到序列的基本信息見(jiàn)表2。統(tǒng)計(jì)6個(gè)sRNA文庫(kù)中的所有序列長(zhǎng)度分布，大部分序列集中分布在21～24 nt，形成主峰。其中，長(zhǎng)度為22 nt的序列頻率最高，其次為23 nt的序列(圖2)。

Clean reads與Rfam數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，將比對(duì)到數(shù)據(jù)庫(kù)中的sRNA進(jìn)行注釋，結(jié)果見(jiàn)圖3。miRNA所占的比例分別為37.39%和42.41%。

表2各文庫(kù)測(cè)序基本情況

Table2Generalinformationaboutlibraries

樣品名Samplename總數(shù)Totalreads高質(zhì)量序列數(shù)Cleanreads所占比例/%PercentageA0d155870051313915584．33A5d134035971180047088．08B0d152866101291049484．49B5d119509431000487683．75C0d150856401193093679．12C5d143179451255903787．75

圖2 小RNA的長(zhǎng)度分布Fig.2 Length distribution of sRNAs

圖3 成肌細(xì)胞分化0(A)和5 d(B)的小RNA分類注釋Fig.3 Annotation of sRNAs of myoblasts differentiated on 0 (A) and 5 d (B)

2.2.2 miRNA序列比對(duì)與統(tǒng)計(jì) 將過(guò)濾后的reads與牛的參考基因組比對(duì)，6個(gè)文庫(kù)的比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表3。其中，比對(duì)到基因組的序列比例都在70%以上，比對(duì)到基因組的sRNA種數(shù)都高于55%。

再將過(guò)濾后的reads與miRbase數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，用mirDeep2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，檢測(cè)到成熟miRNA共619個(gè)。

表3文庫(kù)中sRNA基因組比對(duì)結(jié)果

Table3GenomicalignmentofsRNAsfromlibraries

樣品名Samplename序列種類UniquesRNAs總數(shù)Totaluniquereads比對(duì)上的序列數(shù)Matcheduniquereads百分比/%Percentage序列數(shù)TotalsRNAs總數(shù)Totalreads比對(duì)上的序列數(shù)Matchedreads百分比/%PercentageA0d18245411889265．169258913864328993．35A5d1457868466358．079056538780365986．17B0d19018211963162．906552517547334983．53B5d1308237195755．007025041554293178．90C0d16529810153761．434852204361402474．48C5d1426908441559．1610264886884547786．17

2.3 牛胎兒成肌細(xì)胞分化始末差異表達(dá)miRNA的分析

統(tǒng)計(jì)在不同樣本間成熟miRNA的表達(dá)情況，用edgeR軟件進(jìn)行成肌細(xì)胞分化始末差異表達(dá)miRNA的分析，設(shè)定閾值P-value為0.05，F(xiàn)old-change為2，得到差異表達(dá)的miRNA共 150個(gè)，表達(dá)量最高的20個(gè)見(jiàn)表4。

熱圖結(jié)果顯示，成肌細(xì)胞分化0和5 d時(shí)，miRNA分別聚類到兩個(gè)不同的類群，表明成肌細(xì)胞分化始末表達(dá)的miRNA有顯著的差別(圖4)。

2.4 差異表達(dá)miRNA靶基因預(yù)測(cè)及靶基因的GO與KEGG通路分析

綜合利用miRanda和RNAhybrid兩款軟件進(jìn)行差異表達(dá)miRNA的靶基因預(yù)測(cè)，150個(gè)差異表達(dá)miRNAs共預(yù)測(cè)到8 821個(gè)靶基因。

GO分析結(jié)果表明，差異表達(dá)miRNA的靶基因在生物學(xué)過(guò)程中主要參與了機(jī)體代謝和細(xì)胞代謝過(guò)程，占到靶基因總數(shù)的63.5%，其次是參與調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)質(zhì)量、細(xì)胞增殖分化和RNA轉(zhuǎn)錄等；在分子功能上，靶基因主要作用于蛋白質(zhì)結(jié)合、酶催化和陰離子結(jié)合等；在細(xì)胞組成中，靶基因產(chǎn)物主要集中位于細(xì)胞內(nèi)部，分別位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器膜和細(xì)胞核等(圖5)。KEGG通路分析結(jié)果表明，差異表達(dá)miRNA的靶基因主要集中在MAPK信號(hào)通路、鈣離子信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、縫隙連接和TRP通道介導(dǎo)的炎癥調(diào)節(jié)過(guò)程等(圖6)。

圖4 差異表達(dá)miRNA的熱圖Fig.4 Heat map of differentially expressed miRNAs

2.5 qPCR對(duì)高通量測(cè)序準(zhǔn)確性的驗(yàn)證

隨機(jī)選取8個(gè)差異表達(dá)的miRNAs，進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證，測(cè)序和熒光定量PCR得到的相對(duì)表達(dá)量如圖7所示。可以看到，兩種結(jié)果顯示，miRNA的變化趨勢(shì)完全一致，其中bta-miR-148a、bta-miR-143、bta-miR-1、bta-miR-34a、bta-miR-26a、bta-miR-199a-5p在分化5天的表達(dá)水平顯著升高，bta-miR-7、bta-miR-27a-5p在分化5天的表達(dá)水平顯著降低。熔解曲線都為單峰，引物特異性良好。

3 討 論

當(dāng)前，二代測(cè)序技術(shù)已經(jīng)非常成熟，其通量高和信息量大的特點(diǎn)使其被廣泛應(yīng)用于畜禽基因組學(xué)研究中[19]。本研究利用illumina測(cè)序平臺(tái)，對(duì)牛胎兒骨骼肌來(lái)源的成肌細(xì)胞miRNA進(jìn)行高通量測(cè)序，鑒定已知miRNA 619個(gè)，分化始末差異表達(dá)miRNA共150個(gè)。對(duì)于高通量測(cè)序結(jié)果隨機(jī)選取8個(gè)表達(dá)量相對(duì)較高的差異表達(dá)miRNAs，用加Poly A尾的方法合成cDNA，并用熒光定量PCR技術(shù)來(lái)檢測(cè)miRNA的表達(dá)量，檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果完全一致，表明了測(cè)序結(jié)果具有較高的準(zhǔn)確性和可靠性。這些結(jié)果將為后續(xù)研究miRNA和成肌細(xì)胞分化的工作提供試驗(yàn)依據(jù)。

miRNA是表觀遺傳學(xué)研究的重要內(nèi)容之一，其通過(guò)作用于mRNA來(lái)抑制靶基因的表達(dá)[19-20]。胎兒肌肉的發(fā)育對(duì)肉牛出生后的表型會(huì)產(chǎn)生極為重要的影響，然而目前人們對(duì)miRNA在牛胎兒骨骼肌發(fā)育過(guò)程中的角色并不完全清楚[21]。通過(guò)對(duì)牛胎兒成肌細(xì)胞體外培養(yǎng)分化過(guò)程中差異表達(dá)miRNA的鑒定，能夠更好的理解骨骼肌發(fā)育的機(jī)制。

miRNA廣泛存在于各個(gè)物種，并且具有一定的保守性，這為驗(yàn)證試驗(yàn)得到的miRNA提供了一定的參考[22]。在鑒別出的差異表達(dá)miRNA中，有一些已經(jīng)在?；蚱渌锓N肌肉的相關(guān)研究中有過(guò)報(bào)道。miR-199a-5p可以通過(guò)靶向作用于WNT2，調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞的增殖和分化，在平滑肌肥大和器官重塑上有潛在的應(yīng)用價(jià)值[23]。Zuo等[24]對(duì)豬肌肉miRNA表達(dá)譜分析后發(fā)現(xiàn)，miR-143通過(guò)HDAC4-MEF2通路調(diào)控MYH7的表達(dá)，進(jìn)而影響肌纖維的類型，miR-1可以影響肌球蛋白的含量、肌纖維的類型和肌肉性能。miR-26a在C2C12細(xì)胞系、小鼠和人的原代骨骼肌細(xì)胞成肌分化過(guò)程中表達(dá)量都呈上升趨勢(shì)，這與本研究結(jié)果一致[25]。miR-26a通過(guò)作用于轉(zhuǎn)錄因子Smad1和Smad4，調(diào)控TGF-β/BMP信號(hào)通路，促進(jìn)肌細(xì)胞分化，給乳鼠注射miR-26a的特異性拮抗物，能夠抑制乳鼠骨骼肌的分化[25]。miR-148a在C2C12細(xì)胞分化過(guò)程中表達(dá)上升，其靶向作用于ROCK1基因從而促進(jìn)肌原細(xì)胞分化[26]。在正常細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)miR-148a可以促進(jìn)肌原細(xì)胞的分化，同時(shí)使細(xì)胞周期停滯。用干擾劑抑制miR-148a的表達(dá)時(shí)，C2C12分化被抑制，MHC和MyoG表達(dá)量顯著下降[26]。

表4高表達(dá)的差異表達(dá)miRNAs

Table4ThedifferentiallyexpressedmiRNAswithhighexpressionlevel

微小RANmicroRNAP值P?value錯(cuò)誤檢出率FDRA5dTPM值A(chǔ)5d＿TPMB5dTPM值B5d＿TPMC5dTPM值C5d＿TPMA0dTPM值A(chǔ)0d＿TPMB0dTPM值B0d＿TPMC0dTPM值C0d＿TPMbta?miR?21?5p2．53E?050．0005362200321746082375771694996537828335bta?miR?199a?5p0．0025280．014098422853159143873335652326114721bta?miR?199a?3p1．11E?067．62E?0529100195672540910027101065590bta?miR?199c1．45E?067．89E?0529100195662540810027101065590bta?miR?1430．0026160．0142411743719049210721542676168483bta?let?7f0．0037960．018309106117158105541156339471730bta?miR?424?5p0．0007720．00600310161511312364849733431590bta?miR?3780．0091150．0343852814322144288859119297927bta?miR?1360．0016010．010163654679559555821532032077bta?miR?26a0．0019520．011807809849259584631442662158bta?miR?148a1．20E?067．62E?05118385151946343841151371bta?miR?199b0．0100430．03625524126794596420125561483bta?miR?2210．0052080．022808159011721739632235402819bta?miR?320a0．0054040．022992152614601442394448553695bta?miR?1520．0002920．00358336362844335031311174515bta?miR?10．0008940．006627145596363981827880189bta?miR?3810．0019040．01169813249513732177128685bta?miR?30a?5p0．000140．0020571499196122561560578168bta?miR?26b0．0030870．01625191972921951619623303bta?miR?30d0．0022930．0134391353131216751393752394

圖5 差異表達(dá)miRNA預(yù)測(cè)靶基因的GO分析Fig.5 Gene Ontology analysis of predicted target genes for differentially expressed miRNAs

圖6 差異表達(dá)miRNA預(yù)測(cè)靶基因的KEGG通路分析Fig.6 KEGG pathway analysis of predicted target genes for differentially expressed miRNAs

不同miRNAs表達(dá)量間相比，*. P<0.05,**. P<0.01*.P<0.05,**.P<0.01 among expression levels of miRNAs

圖7 miRNA的測(cè)序及qPCR檢測(cè)結(jié)果Fig.7 Expression of miRNAs quantified by sequencing and qPCR

KEGG通路分析表明，本研究篩選的差異表達(dá)miRNA的靶基因富集到了多個(gè)與肌肉發(fā)育相關(guān)的通路。如p38 MAPK信號(hào)通路是參與骨骼肌發(fā)育的重要調(diào)控通路。MAPK能夠激活轉(zhuǎn)錄因子MyoD基因和MEF2家族成員的表達(dá)，促進(jìn)成肌分化[27]。鈣離子信號(hào)通路對(duì)骨骼肌的生成、穩(wěn)態(tài)維持和再生至關(guān)重要，鈣離子有可能對(duì)肌衛(wèi)星細(xì)胞產(chǎn)生直接作用，控制其處于靜止?fàn)顟B(tài)或是增殖分化成為不同功能的肌肉[28]。細(xì)胞炎性因子TNF-α能夠通過(guò)作用于p38 MAPK抑制骨骼肌的分化[29]。用TNF-α處理人成肌細(xì)胞，細(xì)胞miRNA的表達(dá)受到了影響，進(jìn)而影響到多個(gè)細(xì)胞進(jìn)程，最終對(duì)肌管形成產(chǎn)生抑制作用[30]。IGF-1/Akt信號(hào)通路在骨骼肌生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮著核心作用，能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、增加肌肉量[31]。美國(guó)康乃狄克州的研究人員發(fā)現(xiàn)，瞬時(shí)電位通道(TRP channels)的增多促進(jìn)了心肌的纖維化，鈣離子通透型的瞬時(shí)電位通道可能成為治療心肌纖維化的新靶點(diǎn)[32]。瞬時(shí)電位通道可能與心肌肥大和心律失常相關(guān)[33]。將C2C12細(xì)胞培養(yǎng)在極低頻率磁場(chǎng)中，細(xì)胞的間隙連接增加，C2C12融合和分化的速度加快，可能為肌肉功能紊亂找到新的治療方法[34]。

基于上述已有研究，可以看到測(cè)序結(jié)果中的部分miRNA對(duì)成肌細(xì)胞分化的影響已經(jīng)被印證，但是肌肉發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及到非常復(fù)雜的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的變化，所以miRNA在其中的作用機(jī)制還有很多待挖掘的地方。并且，miRNA在物種之間存在一定的差異，牛的物種特異性的調(diào)控機(jī)制也有待進(jìn)一步研究。因此，本試驗(yàn)結(jié)果將為以后的相關(guān)研究提供重要的參考。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析，鑒定出了150個(gè)在牛胎兒骨骼肌來(lái)源的成肌細(xì)胞分化過(guò)程中差異表達(dá)的miRNAs，這些miRNAs有可能參與了牛胎兒期骨骼肌的分化。靶基因預(yù)測(cè)和功能分析表明，差異表達(dá)miRNA可能在動(dòng)物肌肉發(fā)育相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)通路中起作用，為進(jìn)一步研究miRNA調(diào)控家畜骨骼肌發(fā)育奠定理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)(References)：

[1] LEE E A,KIM J M,LIM K S,et al.Effects of variation in porcineMYOD1 gene on muscle fiber characteristics,lean meat production,and meat quality traits[J].MeatSci,2012,92(1):36-43.

[2] KARUNARATNE J F,ASHTON C J,STICKLAND N C.Fetal programming of fat and collagen in porcine skeletal muscles[J].JAnat,2005,207(6):763-768.

[3] BUCKINGHAM M,RIGBY P W J.Gene regulatory networks and transcriptional mechanisms that control myogenesis[J].DevCell,2014,28(3):225-238.

[4] CHEN J F,MANDEL E M,THOMSON J M,et al.The role of microRNA-1 and microRNA-133 in skeletal muscle proliferation and differentiation[J].NatGenet,2006,38(2):228-233.

[5] BARTEL D P.microRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,and function[J].Cell,2004,116(2):281-297.

[6] CARTHEW R W,SONTHEIMER E J.Origins and mechanisms of miRNAs and siRNAs[J].Cell,2009,136(4):642-655.

[7] DALMAY T.Mechanism of miRNA-mediated repression of mRNA translation[J].EssaysBiochem,2013,54:29-38.

[8] ZHOU H B,XIAO J,WU N,et al.microRNA-223 Regulates the differentiation and function of intestinal dendritic cells and macrophages by targeting C/EBPβ[J].CellRep,2015,13(6):1149-1160.

[9] ALVAREZ-GARCIA I,MISKA E A.microRNA functions in animal development and human disease[J].Development,2005,132(21):4653-4662.

[10] PARK J K,LIU X,STRAUSS T J,et al.The miRNA pathway intrinsically controls self-renewal ofDrosophilagermlinestem cells[J].CurrBiol,2007,17(6):533-538.

[11] GOEDEKE L,WAGSCHAL A,FERNNDEZ-HERNANDO C,et al.miRNA regulation of LDL-cholesterol metabolism[J].BiochimBiophysActa,2016,1861(12):2047-2052.

[12] PIPAN V,ZORC M,KUNEJ T.microRNA polymorphisms in cancer:a literature analysis[J].Cancers(Basel),2015,7(3):1806-1814.

[13] GE Y J,CHEN J.microRNAs in skeletal myogenesis[J].CellCycle,2011,10(3):441-448.

[14] CRIST C G,MONTARRAS D,PALLAFACCHINA G,et al.Muscle stem cell behavior is modified by microRNA-27 regulation of Pax3 expression[J].ProcNatlAcadSciUSA,2009,106(32):13383-13387.

[15] GAMBARDELLA S,RINALDI F,LEPORE S M,et al.Overexpression of microRNA-206 in the skeletal muscle from myotonic dystrophy type 1 patients[J].JTranslMed,2010,8:48.

[16] MCCARTHY J J.microRNA-206:the skeletal muscle-specific myomiR[J].BiochimBiophysActa,2008,1779(11):682-691.

[17] GE Y J,SUN Y T,CHEN J.IGF-II is regulated by microRNA-125b in skeletal myogenesis[J].JCellBiol,2011,192(1):69-81.

[18] SUN J J,LI M J,LI Z J.et al.Identification and profiling of conserved and novel microRNAs from Chinese Qinchuan bovine longissimus thoracis[J].BMCGenomics,2013,14:42.

[19] MOTAMENY S,WOLTERS S,NüRNBERG P,et al.Next generation sequencing of miRNAs-strategies,resources and methods[J].Genes(Basel),2010,1(1):70-84.

[20] DE NIGRIS F.Epigenetic regulators:polycomb-miRNA circuits in cancer[J].BiochimBiophysActa,2016,1859(5):697-704.

[21] MIRETTI S,MARTIGNANI E,TAULLI R,et al.Differential expression of microRNA-206 in skeletal muscle of female Piedmontese and Friesian cattle[J].VetJ,2011,190(3):412-413.

[22] 羅 艷,張 群,梁宇君,等.動(dòng)物中microRNA的保守性和進(jìn)化歷程[J].中國(guó)科學(xué):生命科學(xué),2012,42(2):96-106.

LUO Y,ZHANG Q,LIANG Y J,et al.Conservation and evolution of microRNAs in animals[J].ScientiaSinicaVitae,2012,42(2):96-106.(in Chinese)

[23] HASHEMI GHEINANI A,BURKHARD F C,REHRAUER H,et al.microRNA MiR-199a-5p regulates smooth muscle cell proliferation and morphology by targeting WNT2 signaling pathway[J].JBiolChem,2015,290(11):7067-7086.

[24] ZUO J J,WU F,LIU Y H,et al.microRNA transcriptome profile analysis in porcine muscle and the effect of miR-143 on the MYH7 gene and protein[J].PLoSOne,2015,10(4):e0124873.

[25] DEY B K,GAGAN J,YAN Z,et al.miR-26a is required for skeletal muscle differentiation and regeneration in mice[J].GenesDev,2012,26(19):2180-2191.

[26] ZHANG J,YING Z Z,TANG Z L,et al.microRNA-148a promotes myogenic differentiation by targeting the ROCK1 gene[J].JBiolChem,2012,287(25):21093-21101.

[27] KEREN A,TAMIR Y,BENGAL E.The p38 MAPK signaling pathway:a major regulator of skeletal muscle development[J].MolCellEndocrinol,2006,252(1-2):224-230.

[28] TU M K,LEVIN J B,HAMILTON A M,et al.Calcium signaling in skeletal muscle development,maintenance and regeneration[J].CellCalcium,2016,59(2-3):91-97.

[29] CHEN S E,JIN B W,LI Y P.TNF-α regulates myogenesis and muscle regeneration by activating p38 MAPK[J].AmJPhysiolCellPhysiol,2007,292(5):C1660-C1671.

[30] MEYER S U,THIRION C,POLESSKAYA A,et al.TNF-α and IGF1 modify the microRNA signature in skeletal muscle cell differentiation[J].CellCommunSignal,2015,13:4.

[31] HITACHI K,TSUCHIDA K.Role of microRNAs in skeletal muscle hypertrophy[J].FrontPhysiol,2014,4:408.

[32] YUE Z C,ZHANG Y H,XIE J,et al.Transient receptor potential (TRP) channels and cardiac fibrosis[J].CurrTopMedChem,2013,13(3):270-282.

[33] WATANABE H,IINO K,OHBA T,et al.Possible involvement of TRP channels in cardiac hypertrophy and arrhythmia[J].CurrTopMedChem,2013,13(3):283-294.

[34] MORABITO C,STEIMBERG N,ROVETTA F,et al.Extremely low-frequency electromagnetic fields affect myogenic processes in C2C12 myoblasts:role of gap-junction-mediated intercellular communication[J].BiomedResInt,2017,2017:2460215.