海梅榮，達布希拉圖，蔡金龍，耿仕嫻，王文祥

(1云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，昆明 650201；2云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，昆明 650201)

百合科黃精屬植物多花黃精(PolygonatumcyrtonemaHua.)是一種非常重要的野生中藥資源，與黃精(PolygonatumsibiricumRed.)、滇黃精(PolygonatumkingianumColl. et Hemsl.)一同收錄在《中國藥典》.多花黃精作為中藥黃精原生藥的一種，為藥食同源的多年生草本植物，是我國傳統(tǒng)的大宗藥材之一[1].對多花黃精的化學(xué)成分和藥理活性研究發(fā)現(xiàn)主要有多糖、皂苷、黃酮、木脂素、甾醇和揮發(fā)油等化學(xué)成分以及具有抗炎抗菌、抗衰老抗腫瘤和調(diào)節(jié)血糖血脂等藥理活性[2-5].

黃精多炮制后入藥，炮制可去除其刺激性，便于保存，炮制前后化學(xué)成分和藥理活性均有不同程度的變化[6].多花黃精經(jīng)“九蒸九制”臨床治療糖尿病的效果有顯著提高，然而對于多花黃精炮制品化學(xué)成分及藥理活性的具體研究尚不清楚，為此，本文研究了多花黃精“九蒸九制”后乙酸乙酯層化學(xué)成分及其生物活性.

1 儀器與材料

APIQSTAR飛行時間質(zhì)譜儀、Agilent 1260型高效液相色譜儀、BUCHI C615中壓液相色譜儀、BrukerAV600核磁共振波譜儀、柱層析硅膠(200～300目)、薄層色譜硅膠板、Sephadex LH-20(25～100μm)；石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇等有機溶劑均為工業(yè)純經(jīng)過重蒸后使用；純凈水購于娃哈哈集團有限公司；顯色劑為硫酸香草醛溶液.

小鼠單核巨噬細胞RAW264.7購自中科院上海細胞庫，DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自BI公司；Griess Reagent、LPS、對照藥物L(fēng)-NMMA、p-nitrophenyl butyrate(p-NPB)、Tris、Orlistat購自Sigma公司；豬胰脂肪酶(PPL)購自阿拉丁試劑公司；D-PBS購自Hyclone公司.

2 實驗方法

2.1 提取與分離

多花黃精九蒸九制產(chǎn)品5.0 kg，用95%乙醇浸提5次，首次48 h，其余各次均24 h，合并提取液并減壓濃縮得到浸膏. 將浸膏加水懸浮，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取. 乙酸乙酯層浸膏29.3 g 經(jīng)正相硅膠柱色譜分離，以石油醚-丙酮(1：0～0：1)梯度洗脫，得到Frs. A～G 共7個組分.Fr. D(5.2 g)經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜，以三氯甲烷-甲醇(1∶1)為流動相洗脫，得到Frs.D-1～8共8個亞組分.其中Frs.D-4～5分別經(jīng)過制備型HPLC，以乙腈/水(35%～65%)梯度洗脫，分別得到化合物1(5.2 mg)和8(3.8 mg).Fr. F(3.1 g)和 Fr. G(3.1 g)經(jīng)以上手段分離純化，分別得到Frs.F-1～6共6個亞組分和Frs.G-1～7共7個亞組分.其中Frs.F-3～4和Frs.G-5～6分別經(jīng)過制備型HPLC，以乙腈/水(30%～60%)梯度洗脫，分別得到化合物3(1.5 mg)、4(2.7 mg)、2(1.9 mg)和6(3.2mg).Fr. E(3.6 g)經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜，以甲醇為流動性洗脫，得到Frs.E-1～5共7個亞組分，F(xiàn)rs.4～5分別經(jīng)過制備型HPLC，以乙腈/水(35% ～ 65%)梯度洗脫，分別得到化合物5(5.3 mg)和化合物7(2.4 mg).化合物1～8的結(jié)構(gòu)式見圖1.

圖1 化合物1～8的結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of compounds 1-8

2.2 一氧化氮(NO)生成抑制劑篩選

小鼠單核巨噬細胞RAW264.7用LPS脂多糖誘導(dǎo)一氧化氮合成酶的生成，同時加入待測化合物處理，吸取培養(yǎng)基通過Griess法在570 nm波長測吸光值來檢測亞硝酸鹽(NO2-). 將RAW264.7細胞接種至96孔板，用1 μg/mL LPS進行誘導(dǎo)刺激，同時加入待測化合物(終濃度25 μmol/L)處理，設(shè)置不含藥物組和L-NMMA陽性藥物組做對照.細胞過夜培養(yǎng)后取培養(yǎng)基檢測NO生成，在570 nm處測定吸光值.在剩余培養(yǎng)基中加入MTS進行細胞存活率檢測，排除化合物對細胞的毒性影響. NO生成抑制率(%)=(非藥物處理組OD570 nm-樣品組OD570 nm)/非藥物處理組OD570 nm× 100%. IC50按Reed-Muench法計算[7].

2.3 脂肪酶活性抑制劑的篩選

在96孔酶標(biāo)板上，將待測化合物與PPL溶液充分混合，每個濃度均設(shè)定3個重復(fù)孔，37 °C，15 min；加入p-NPB，混合均勻，37 °C，15 min，酶標(biāo)儀測定OD值(400 nm/630 nm)，檢測波長為400 nm，參考波長為630 nm. 實驗同時設(shè)置空白對照孔和Orlistat陽性對照孔.計算公式：PPL活性抑制率(%)= (1-樣品OD值/實驗對照孔OD值)× 100%. IC50按Reed-Muench法計算[8].

3 實驗結(jié)果

3.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

(1) 化合物1. 白色無定形粉末，分子式為C14H14O3，EI-MS m/z 286[M+H]+,1H NMR(CD3OD,400 MHz)：δ：7.27(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，6.70(1H，d，J=2.5 Hz，H-5′),6.61(1H，d，J=2.5 Hz，H-3′),6.37(1H，d，J=2.0 Hz，H-4),2.76(3H，s);13C NMR(CD3OD,125 MHz)：δ：25.8(CH3),102.0(C-4)，102.7(C-3′)，105.5(C-6)，110.9(C-1′)，118.5(C-5′)，139.8(C-1)，140.0(C-6′)，154.5(C-2′)，160.0(C-4′)，166.2(C-3)，166.9(C-5)，167.0(C-7). 上述數(shù)據(jù)與文獻[9]一致，故鑒定化合物1鑒定為交鏈孢酚.1H-1H COSY、HSQC、HMBC等二維核磁共振譜進一步證實了化合物1的結(jié)構(gòu).

(2)化合物2. 淡黃色粉末，分子式為C12H22N2O2，EI-MS m/z 227[M+H]+,1H NMR(Pyr-d5，600 MHz)δ：4.21(1H，m，Leu-α)，2.20(2H，m，Leu-β)，1.46(3H，m，Leu-γ)，0.93(3H，d，J=7.8 Hz，Leu-δ1)，0.90(3H，d，J=7.2 Hz，Leu-δ2)，4.30(1H，d，J=9.0 Hz，Ile-α)，2.34(1H，m，Ile-β)，1.89(2H，m，Ile-γ1)，1.20(3H，d，J=6.6 Hz，Ile-γ2)，0.97(3H，d，J=6.6 Hz，Ile-δ)，上述數(shù)據(jù)與文獻[10]一致，故鑒定化合物2鑒定為環(huán)(L-亮-L-異亮)二肽.

(3) 化合物3.黃色針狀結(jié)晶，分子式為C18H18O5，EI-MS m/z 315[M+H]+,1H NMR(CDCl3,600 MHz)：δ：12.39(1H,s,5-OH)，7.11(1H，d，J=8.4 Hz，H-2′,H-6′)，6.80(1H，d，J=8.4 Hz，H-3′,H-5′)，4.29(1H，dd，J=3.6，10.8 Hz，H-2b)，4.11(1H，dd，J=7.2，10.8Hz，H-2a)，3.17(1H，dd，J=4.2，14.4 Hz，H-9b)，2.69(1H，dd，J=11.4，14.4 Hz，H-9a)，2.78(1H，m，H-3)，2.07(3H，s，6-CH3)，2.03(1H，s，8-CH3).13C NMR(CDCl3,150 MHz)：δ：7.0(8-CH3)，7.5(6-CH3)，32.1(C-9)，7.04(C-3)，9.06(C-2)，101.7(C-4a，102.4(C-8)，103.0(C-6)，115.7(C-3′，C-5′)，130.5(C-2′，C-6′)，154.6(C-4′)，157.8(C-8a)，159.7(C-5)，160.8(C-7)，198.6(C-4). 上述數(shù)據(jù)與文獻[11]一致，故鑒定化合物3鑒定為5,7-二羥基-6,8-二甲基-3-(4′-羥基苯基)chroman-4-酮.1H-1H COSY、HSQC、HMBC等二維核磁共振譜進一步證實了化合物3的結(jié)構(gòu).

(4) 化合物4.黃色粉末，分子式為C18H18O6，EI-MS m/z 331[M+H]+,1H NMR(CDCl3,600 MHz)：δ：12.25(1H,s,5-OH)，7f.11(1H，d，J=8.4 Hz，H-2′,H-6′)，6.80(1H，d，J=8.4 Hz，H-3′,H-5′)，4.33(1H，dd，J=3.6，10.8 Hz，H-2b)，4.18(1H，dd，J=7.2，10.8 Hz，H-2a)，3.85(3H，s，8- OCH3)，3.18(1H，dd，J=4.2，14.4 Hz，H-9b)，2.71(1H，dd，J=11.4，14.4 Hz，H-9a)，2.83(1H，m，H-3)，2.17(3H，s，6-CH3).13C NMR(CDCl3,150 MHz)：δ：7.2(6-CH3)，32.0(C-9)，46.9(C-3)，61.5(8-OCH3)，69.3(C-2)，101.9(C-4a)，104.3(C-6)，115.5(C-3′，C-5′)，130.0(C-8)，130.3(C-2′，C-6′)，150.6(C-4′)，154.5(C-8a)，156.0(C-5)，158.1(C-7)，198.0(C-4). 上述數(shù)據(jù)與文獻[12]一致，故鑒定化合物4鑒定為5,7-二羥基-6-甲基-8-甲氧基-3-(4′-羥基苯基)chroman-4-酮.

(5)化合物5. 白色針狀結(jié)晶，分子式為C21H38O4，EI-MS m/z 355[M+H]+，1H NMR (500 MHz，CDCl3)δ：0.89 (3H，t，J=6.75 Hz，亞油酸甲基)，1.2-1.42 (14H，m，7×CH2)，1.55-1.70 (2H ，t，J=7.1Hz，CO2CH2CH2CH2)，2.04(4H，m，CH2CH=CHCH2CH=CHCH2)，2.35 (2H，t，J=7.55 Hz，CO2CH2CH2CH2)，2.77 (2H，t，J =5.1 Hz，CH=CHCH2CH=CH)，3.58 (2H，dd，J=5.8，11.1 Hz，OCH2CHCH2O)，3.70 (2H，dd，J=3.9，11.5 Hz，OCH2CHCH2O)，4.11-4.25 (m,1H,CH2CHOCH2)，5.29-5.47 (4H，m，烯烴次甲基). 上述數(shù)據(jù)與文獻[13]一致，故化合物5鑒定為3-(9,12-十八碳二烯?；?甘油.

(6) 化合物6. 白色無定形粉末，分子式為C12H10O6，EI-MS m/z 251[M+H]+,1H NMR (500 MHz，CD3OD)δ：7.90(1H，d，J=1.1 Hz，H-2′,H-2″)，7.56(1H，d，J=3.3 Hz，H-4′,H-4″)，6.72(1H，dd，J=1.7，3.65 Hz，H-3′,H-3″)，5.33(1H，s，H-2，H-3)；13C NMR(CD3OD,125 MHz)：δ：77.0(C-2，C-3)，113.7(C-3′，C-3″)，120.7(C-2′，C-2″)，149.0(C-4′，C-4″)，152.0(C-1′，C-1″)，188.0(C-1,C-4).上述數(shù)據(jù)與文獻[14]一致，故化合物6鑒定為1,4-二呋喃基-2,3-二羥基-1,4-丁二酮.

(7) 化合物7. 黃色油狀物，分子式為C6H6O3，EI-MS m/z 127[M+H]+,1H NMR(CDCl3,600 MHz)：δ：9.60(1H，s，H-6)，7.21(1H，d，J=3.5 Hz，H-3)，6.51(1H，d，J=3.5 Hz，H-4)，4.72(2H，s，H2-7)；13C NMR(CDCl3,125 MHz)：δ：57.7(C-7)，110.1(C-3，C-4)，120.1(C-4)，152.4(C-24)，160.3(C-5)，177. 7(C-6). 上述數(shù)據(jù)與文獻[15]一致，故化合物7鑒定為5-羥甲基2-呋喃糠醛.

(8) 化合物8.白色粉末，分子式為C9H8O3，EI-MS m/z 165[M+H]+,1H NMR (500 MHz，CD3OD)δ：7.30(1H，d，J=7.95 Hz，H-7)，7.01(1H，dd，J=1.6 Hz，7.95 Hz，H-6)，6.84(1H，d，J=7.95 Hz，H-5)，4.57(2H，t，J=6.5 Hz，H2-2)，2.79(2H，t，J=6.5 Hz，H2-3)；13C NMR(CD3OD,125 MHz)：δ：38.74(C-3)，68.60(C-2)，117.94(C-5)，122.06(C-6)，122.36(C-7)，123.09(C-4a)，147.78(C-8)，152.15(C-8a)，194.34(C-4). 上述數(shù)據(jù)與文獻[16]一致，故化合物8鑒定為8-羥基色原酮.

3.2 化合物的活性篩選

一氧化氮(NO)具有廣泛而重要的生物學(xué)調(diào)控功能，在炎癥、腫瘤及心血管系統(tǒng)等均有重要作用. 當(dāng)免疫細胞遭受微生物內(nèi)毒素、炎癥介質(zhì)等刺激時，會生成大量的誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(induced NO synthase，iNOS)，產(chǎn)生NO進行免疫應(yīng)答，因此抑制NO生成是化合物抗炎活性的直接指標(biāo).對化合物6的一氧化氮(NO)生成抑制活性和抑制活性進行評價.結(jié)果顯示在25 μmol/L濃度下，化合物6具有一定的抗炎活性，抑制率為44.8%，IC50值為35.5 μmol/L(對照品為57.9%，IC50值為26.5). 而化合物6在25 μmol/L濃度下沒有明顯的體外胰脂肪酶抑制活性.

4 結(jié)語

新鮮的黃精具麻味，服用生品時，刺激咽喉，因而黃精多炮制后食用.黃精的炮制品在臨床上對糖尿病的緩解和治療有一定的療效，很多專家學(xué)者認為是黃精中的皂苷和多糖在起作用，從本研究的結(jié)果看，在其乙酸乙酯層中的單體化合物并沒有明顯的抗糖尿病活性，因此有必要深入研究該樣品正丁醇層的化學(xué)成分，以期從中能夠找出具有抗糖尿病的化合物單體或者組分.

參 考 文 獻

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