徐 鑫，郭旭夢(mèng)，劉松青，王曉婉，梁華兵，馬克恩，韋明英

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,生物技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430074)

水稻是世界上約一半人的主食. 近幾十年來(lái)，盡管由于高產(chǎn)品種的研發(fā)和栽培技術(shù)的改進(jìn)等使水稻產(chǎn)量翻倍，但仍不能滿足全球日益增加的對(duì)水稻的需要[1]. 稻瘟病是影響所有水稻產(chǎn)區(qū)的嚴(yán)重病害，不但會(huì)導(dǎo)致水稻產(chǎn)量降低10%～30%，并且降低稻米品質(zhì). 在常用控制疾病的方法中，宿主抗性的應(yīng)用是最經(jīng)濟(jì)和最環(huán)保的方法[2]. 水稻稻瘟病抗性通常分為真性抗性(也稱作完全抗性或者質(zhì)量抗性)和田間抗性(也稱作部分抗性或者數(shù)量抗性). 稻瘟病抗性基因Pi63來(lái)源于日本九州的陸稻品種“Kahei”，該基因有非常強(qiáng)的田間抗性[3]. 初步研究表明，Pi63的抗性與其表達(dá)量成正相關(guān)[4].

為研究Pi63的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，前期研究中利用生物信息學(xué)分析了Pi63的啟動(dòng)子區(qū)域和抗病相關(guān)順式作用元件的位置及分布，根據(jù)預(yù)測(cè)構(gòu)建了4個(gè)不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子區(qū)域[5]. 在此基礎(chǔ)上，將這些啟動(dòng)子缺失體連接Pi63全長(zhǎng)基因并轉(zhuǎn)化植物雙元表達(dá)載體pMDC99.

遺傳轉(zhuǎn)化是作物改良和新基因功能鑒定的常用方法， 但目的基因的表達(dá)水平和遺傳穩(wěn)定性與轉(zhuǎn)基因植物的外源基因的拷貝數(shù)有很大的關(guān)系. 因此，篩選出單拷貝或拷貝數(shù)少的轉(zhuǎn)基因株系對(duì)開(kāi)展進(jìn)一步的研究和應(yīng)用顯得尤為重要. 傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因植株拷貝數(shù)檢測(cè)采用 Southern 雜交法，但該方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，要用到放射性同位素等具有潛在危險(xiǎn)的藥品[6]. 近年來(lái)高通量、快速、靈敏的定量 PCR (qPCR)方法成為科研人員青睞的檢測(cè)方法之一[7].

本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得帶有不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子區(qū)域的Pi63全長(zhǎng)基因的轉(zhuǎn)基因水稻，選擇蔗糖磷酸合成酶基因(SPS) 作為內(nèi)源參照基因進(jìn)行拷貝數(shù)估算，通過(guò)qPCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株中Pi63基因的拷貝數(shù). 進(jìn)一步將單拷貝植株接種稻瘟病菌種007，比較接種前后Pi63基因的表達(dá)量變化，分析順式作用元件之間的相互作用以及對(duì)Pi63抗性的影響.

1 材料與方法

1.1 材料

植物雙元表達(dá)載體為pMDC99-P0、 pMDC99-P1、pMDC99-P2和pMDC99-P3；稻瘟病菌株為標(biāo)準(zhǔn)菌株007；轉(zhuǎn)基因受體水稻品種為日本晴.

1.2 試劑

rTaq酶、DNA分子量Marker、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq和其他分子生物學(xué)試劑均購(gòu)自大連寶生物公司.

1.3 方法

1.3.1 水稻遺傳轉(zhuǎn)化

按照文獻(xiàn)[8]的方法，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)4個(gè)表達(dá)載體進(jìn)行日本晴水稻的遺傳轉(zhuǎn)化.

1.3.2 轉(zhuǎn)基因植株陽(yáng)性鑒定

水稻DNA提取采用CTAB法[9]. 轉(zhuǎn)基因植株陽(yáng)性鑒定引物見(jiàn)表1. PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性 3 min；94 ℃變性 30 s，57 ℃退火 40 s，72 ℃延伸 1 min，34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存. PCR反應(yīng)體系為15 μL，上下游引物( 10 μmol / L ) 各0.1 μL，DNA模板( 30 ng / μL)2 μL.

表1 PCR引物序列

Tab. 1 Primers sequences of PCR

引物編號(hào)引物名稱引物序列(5'-3')1Pi63-5'u-pst p0CATTAGCGTAGCTACT-GAGCC2Pi63-5'u-pst p1GCCATTACTGTGGATTGT-GG3Pi63-5'u-pst p2CCTTGTTCAGCAC-TAGAGAGC4Pi63-5'u-pst p3GGTGGAGCTTGTAGCAT-ACG5P0P1VRCTCGAACACATGGTACAT-GG6P2P3VRGGAATTGACTTGGAAGTT-GG7SPS-qHG-FCCTCTTCTAGCATCGAGGT-CAC8SPS-qHG-RCTCCCCGACGATCAGATA-CATG9Pi63-Copy-FCTAGTCGCCTCAACCATGT-GA10Pi63-Copy-RAGGTCTGTGATTCT-TCGAGGC11RUBQ1-FGGAGCTGCTGCTGT-TCTAGG12RUBQ1-RTTCAGACACCATCAAAC-CAGA13Pi63-FTCAATGAAGTAAGGCTA-ACGCT14Pi63-RTACTGTCCCTGTCTTCCCA-CA

1.3.3 轉(zhuǎn)基因T1代植株拷貝數(shù)鑒定

將P0、P1、P2、P3轉(zhuǎn)基因水稻T1代植株的陽(yáng)性苗利用CTAB法提取DNA，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù). 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻外源基因拷貝數(shù)[10]. 引物SPS-qHG-F和SPS-qHG-R為內(nèi)參引物，Pi63-Copy-F和Pi63-Copy-R為目的基因引物. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)程序：采用兩步法，第一步，95 ℃預(yù)變性10 s；第二步，95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，同時(shí)在退火過(guò)程中檢測(cè)熒光信號(hào)變化，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán). 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μL: SYBR Premix Ex TaqTM(2×) 10 μL，PCR上下游引物( 10 μmol / L ) 各0.3 μL，DNA模板( 30 ng / μL)2 μL.

Pi63啟動(dòng)子標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：帶有目的基因的質(zhì)粒DNA做5×109、5×108、5×107、5×106、5×105、5×104倍稀釋?zhuān)赃@些稀釋的DNA作為模版進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，得到各梯度的Ct值.SPS基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作是以水稻基因組DNA做2×105、2×104、2×103、2×102、2×101的梯度稀釋?zhuān)韵♂尯蟮腄NA作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR的模版. 以SPS基因和Pi63啟動(dòng)子的擴(kuò)增Ct值為縱坐標(biāo)，以起始模版數(shù)(S0和C0)的常用對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制SPS基因和Pi63啟動(dòng)子的實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線圖.

1.3.4 T1代轉(zhuǎn)基因植株目的基因的拷貝數(shù)計(jì)算

由1.3.3測(cè)得的樣品的Ct值，并由方程S0=10-(Ct-44.687)/3.8017計(jì)算出該樣品的SPS基因的起始模版數(shù)，并由方程C0=10-(Ct-31.445)/2.0357計(jì)算出該樣品的Pi63啟動(dòng)子的起始模版數(shù).

1.3.5 轉(zhuǎn)基因T1代植株表達(dá)量檢測(cè)

水稻種子播種在30 cm×20 cm×5 cm的盆中,放在溫室培養(yǎng). 共7排，每排15～20株.稻瘟病007菌種孢子在水稻幼苗4葉期接種. 接種前取第3片葉片用于提取RNA并反轉(zhuǎn)錄檢測(cè)接種前Pi63基因表達(dá)量. 使用噴槍將20 mL孢子懸浮液(105個(gè)孢子/ mL)分別噴到每盆水稻上，放置于相對(duì)濕度95%～100%和溫度的28 ℃的黑暗接種箱中保持24 h. 接種后轉(zhuǎn)移到28 °C的溫室，7 d后取樣. 選取病斑嚴(yán)重的第3片葉片用于提取RNA并反轉(zhuǎn)錄后檢測(cè)接種后表達(dá)量.RNA提取方法參照文獻(xiàn)[11] .引物RUBQ1-F和RUBQ1-R為內(nèi)參引物，Pi63-F和Pi63-R為目的基因引物. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)程序參見(jiàn)1.3.3.

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)基因T1代植株的陽(yáng)性鑒定

對(duì)不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子連接Pi63全長(zhǎng)基因(分別命名為P0、P1、P2、P3)的T1代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行陽(yáng)性鑒定. P0的PCR擴(kuò)增目的條帶長(zhǎng)度為1027 bp(圖1-a)，鑒定得到17棵陽(yáng)性苗；P1的PCR擴(kuò)增目的條帶長(zhǎng)度為278 bp(圖1-b)，鑒定得到15棵陽(yáng)性苗，P2的PCR擴(kuò)增目的條帶長(zhǎng)度為1131 bp(圖1-c)，鑒定得到18棵陽(yáng)性苗；P3的PCR擴(kuò)增目的條帶為915 bp(圖1-d)，鑒定得到17棵陽(yáng)性苗.

a) P0；b) P1；c) P2；d) P3M為分子標(biāo)記DL2000；數(shù)字為轉(zhuǎn)基因植株編號(hào)；N為陰性對(duì)照日本晴；K為陽(yáng)性對(duì)照Kahei圖1 T1代轉(zhuǎn)基因植株的陽(yáng)性鑒定Fig.1 Identification of T1 transgenic plants

2.2 轉(zhuǎn)基因植株拷貝數(shù)鑒定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

SPS基因和Pi63啟動(dòng)子的實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線圖如圖2. a圖是SPS基因標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，b圖是Pi63啟動(dòng)子標(biāo)準(zhǔn)曲線圖. 從中得到相關(guān)性方程S0=10-(Ct-44.687)/3.8017；C0=10-(Ct-31.445)/2.0326.SPS基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為R2=0.9922，Pi63啟動(dòng)子標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為R2=0.9978，相關(guān)性高.

圖2 SPS和Pi63啟動(dòng)子標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.2 The standard curve of SPS and Pi63 promoter

2.2.2 T1代轉(zhuǎn)基因植株目的基因的拷貝數(shù)計(jì)算

由2.2.1得到的相關(guān)性方程計(jì)算出SPS基因的起始模板數(shù)和樣品的Pi63啟動(dòng)子的起始模板數(shù). 由于水稻內(nèi)參基因SPS是純合二倍體，因此Pi63啟動(dòng)子的起始模版數(shù)除以SPS基因的起始模版數(shù)，再乘以2就是目的基因在水稻中基因組中的拷貝數(shù). 其中P0有7個(gè)單拷貝，2個(gè)假陽(yáng)性；P1有4個(gè)單拷貝，1個(gè)假陽(yáng)性；P2有7個(gè)單拷貝，2個(gè)假陽(yáng)性；P1有8個(gè)單拷貝，1個(gè)假陽(yáng)性(表2).

表2 轉(zhuǎn)基因植株目的基因拷貝數(shù)的估算Tab.2 Estimation of copy number of target gene in each transgenic line

2.3 轉(zhuǎn)基因T1代植株接種稻瘟病菌株前后Pi63基因表達(dá)量變化

如圖3，接種007菌種7 d后P1的啟動(dòng)能力最強(qiáng)，Pi63基因表達(dá)量比其他3個(gè)缺失體的都高，其次是P0，P2和P3的啟動(dòng)能力最弱. 比較接種前后表達(dá)量的變化，可以看出P1在稻瘟病菌種誘導(dǎo)后表達(dá)量增加最多，其次是P0，而P2和P3在稻瘟病誘導(dǎo)前后表達(dá)量變化不明顯. 推測(cè)可能是抗病相關(guān)的順式作用元件處于P1與P2中間的區(qū)域，P0到P1的區(qū)域存在負(fù)調(diào)控元件.

圖3 T1代轉(zhuǎn)基因植株接種007菌株前后Pi63 表達(dá)量比較Fig.3 Expression of Pi63 in T1 progeny before and after inoculation with fungus strain 007

3 討論

通常轉(zhuǎn)基因受體植物中整合拷貝數(shù)為 1～2 的外源基因有較高的表達(dá)水平，而整合拷貝數(shù)較高的外源基因則會(huì)因出現(xiàn)基因沉默現(xiàn)象導(dǎo)致表達(dá)水平較低[12]. 為排除定量PCR法鑒定拷貝數(shù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中微小的變化對(duì)結(jié)果的可能影響，本研究中設(shè)置了多個(gè)重復(fù)來(lái)比較驗(yàn)證，用外源基因的Ct值減去內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的Ct值，將樣品DNA 濃度均一化[3]，保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性. 本研究中轉(zhuǎn)基因材料為T(mén)1代轉(zhuǎn)基因植株，拷貝數(shù)鑒定結(jié)果不能準(zhǔn)確區(qū)分純合單拷貝和雜合雙拷貝，因此我們均選用雜合單拷貝用于后續(xù)基因表達(dá)量的分析.

植物的抗病能力與順式作用元件的調(diào)控密切相關(guān). 如脫落酸的信號(hào)通路正負(fù)調(diào)控因子WRKY蛋白特異性結(jié)合含有TGAC序列的順式作用元件[14, 15]；作為WRKY家族成員的WRKY45在真菌以及細(xì)菌引起的植物病理反應(yīng)中也起著很重要的抗性作用[16].實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明P1與P2中間的區(qū)域存在抗病相關(guān)的正調(diào)控，P0到P1的區(qū)域存在負(fù)調(diào)控元件，而整體分布在啟動(dòng)子前端的是GCCCORE和CATATGGMSAUR分布在啟動(dòng)子末端的是CPBCSPOR，是否是這幾個(gè)順式作用元件存在的位置和順式作用元件的相互影響來(lái)共同調(diào)控啟動(dòng)子的啟動(dòng)抗病能力還需進(jìn)一步驗(yàn)證.LUO等研究表明如BIHD1OS順式作用元件是OsBIHD1的結(jié)合位點(diǎn)，OsBIHD1能激活BTH基因進(jìn)而調(diào)控植物抗病反應(yīng)[17]， 是否Pi63的啟動(dòng)子順式作用元件之間也有類(lèi)似的相互作用還待進(jìn)一步研究.

參 考 文 獻(xiàn)

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