鄧旭坤,段 歡，劉 釗，舒廣文，江善青，余惠凡

(1 中南民族大學(xué) 藥學(xué)院, 武漢 430074;2 中南民族大學(xué) 學(xué)報(bào)編輯部，武漢 430074)

黃精為百合科植物滇黃精(PolygonatumkingianumColl. et Hemsl.)、黃精(PolygonatumsibiricumRed.)或多花黃精(PolygonatumcyrtonemaHua.)的干燥根莖，其味甘性平，歸脾肺腎經(jīng)，具有補(bǔ)氣健脾之功效，臨床用于脾胃氣虛等癥[1].黃精多糖是黃精的主要活性成分之一，具有抗腫瘤、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫、抗動(dòng)脈粥樣硬化等功能[2].環(huán)磷酰胺是治療腫瘤的常用藥物，它在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫功能低下，是制備免疫功能低下模型的理想藥物[3].已有研究報(bào)道：黃精多糖能通過(guò)增強(qiáng)小鼠細(xì)胞免疫功能，提高胸腺、脾臟指數(shù)，上調(diào)血清中IL-2 的量，提高機(jī)體免疫力[4].但黃精多糖對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)小鼠免疫抑制拮抗作用的研究并不多，研究黃精多糖改善環(huán)磷酰胺化療引起的免疫抑制具有重要的理論與實(shí)際意義.

1 材料和儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

7～9周齡SPF級(jí)昆明小鼠18～22 g，雌雄各半，購(gòu)自湖北省疾病預(yù)防控制中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可號(hào)：SCXK(鄂)2016-0003.小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后用于實(shí)驗(yàn).

1.2 藥物與試劑

黃精藥材采自湖北恩施來(lái)鳳縣，由中南民族大學(xué)藥學(xué)院鄧旭坤教授鑒定為黃精PolygonatumsibiricumRed. 的干燥根莖.RPMI-1640 培養(yǎng)液(Genom)，胎牛血清(Tissue Culture Biologicals)，注射用環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞醫(yī)藥)，中性紅、MTT(上海譜振生物科技)，刀豆蛋白ConA、LPS(Sigma)，IL-1β、IL-6、TNF-α 試劑盒(上海源葉生物科技)，其他試劑(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑).

1.3 主要儀器

酶標(biāo)儀(Spectra Max M3型，美國(guó)Dynex)，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(BB15型，美國(guó)Thermo)，電子天平(BL-600型，北京賽多利斯儀器系統(tǒng))，離心機(jī)(Suprafuge22型，日本Heraeus)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE52CS-1型，上海亞榮生化儀器).

2 方法

2.1 黃精多糖制備

將黃精藥材研磨成粉末，取細(xì)粉末100 g，95%乙醇60 ℃回流3 h，脫脂，80%乙醇60 ℃回流2 h，脫單糖和低聚糖，過(guò)濾，藥渣烘干(50 ℃)，加入蒸餾水(質(zhì)量/體積比為1∶25)，80 ℃熱回流提取3次，每次3 h.過(guò)濾濃縮，加入乙醇，使含醇量為80%. 4 ℃過(guò)夜，過(guò)濾，沉淀烘干，即得粗多糖[5].再加適量熱水溶解，流水透析48 h；取透析液經(jīng)真空冷凍干燥，即得黃精多糖.按照硫酸-蒽酮法測(cè)定多糖含量為96.9%[6].

2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組

取小鼠50只，隨機(jī)分為5組，分別為：正常組、模型組、黃精多糖組(50, 100, 150 mg·kg-1)，每組10只.正常組小鼠每天腹腔注射生理鹽水(0.01 mL·g-1)，其他各組小鼠每天腹腔注射2 mg環(huán)磷酰胺，連續(xù)3 d，建立環(huán)磷酰胺免疫抑制小鼠模型.第4 d開(kāi)始，正常組和模型組小鼠灌胃生理鹽水，黃精多糖組灌胃相應(yīng)劑量的黃精多糖溶液，連續(xù)1周.

2.3 巨噬細(xì)胞懸液制備

小鼠腹腔內(nèi)注射5 mL的RPMI-1640 培養(yǎng)液，然后輕輕揉搓小鼠腹部，15 min后回抽腹部的培養(yǎng)液，用培養(yǎng)液漂洗2次.再用RPMI-1640完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色，細(xì)胞存活率應(yīng)大于95%.

2.4 脾臟/胸腺指數(shù)測(cè)定和細(xì)胞懸液制備

處死各實(shí)驗(yàn)組小鼠，酒精消毒，取出脾臟與胸腺，稱(chēng)重并計(jì)算胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)[6]：脾臟(胸腺)指數(shù)=脾臟(胸腺)質(zhì)量(mg)/小鼠體重(g).取適量脾臟或胸腺組織，用 RPMI-1640培養(yǎng)液清洗，剪碎組織，玻璃勻漿器研磨，過(guò)200目不銹鋼細(xì)胞篩，經(jīng)紅細(xì)胞裂解液(0.83% NH4Cl，pH 7.2)除去紅細(xì)胞后，得脾臟或胸腺的單細(xì)胞懸液，備用.

2.5 巨噬細(xì)胞吞噬能力檢測(cè)

將各實(shí)驗(yàn)組小鼠的巨噬細(xì)胞懸液接種到96孔板中，使細(xì)胞密度為2×105個(gè)/孔，于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，倒掉上層培養(yǎng)液，用 PBS清洗，每孔中加入100 μL 0. 04%的中性紅生理鹽水，繼續(xù)培養(yǎng)，4 h后棄上清液，用生理鹽水清洗3次，每孔加入200 μL乙醇-乙酸(體積比為1∶1)混合液，靜置12 h.酶標(biāo)儀測(cè)定OD570值，計(jì)算巨噬細(xì)胞的吞噬能力.

2.6 協(xié)同ConA刺激脾臟和胸腺細(xì)胞增殖檢測(cè)

將各實(shí)驗(yàn)組小鼠的脾臟或胸腺細(xì)胞懸液，用紅細(xì)胞裂解液除去紅細(xì)胞后，接種于96孔板中，使細(xì)胞密度為5×105個(gè)/孔，培養(yǎng)24 h.除空白對(duì)照空外，向其他孔中加入100 μL含有ConA(2 μg·mL-1)的RPMI-1640 培養(yǎng)液，培養(yǎng)72 h后，每孔加入10 μL MTT.繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加150 μL DMSO，測(cè)定OD570值.按以下公式計(jì)算：ConA刺激脾臟或胸腺細(xì)胞的增殖指數(shù)=實(shí)驗(yàn)孔OD值/空白孔OD值[7].

2.7 巨噬細(xì)胞IL-1β, IL-6, TNF-α 分泌檢測(cè)

將各實(shí)驗(yàn)組小鼠的巨噬細(xì)胞接種于24孔板中，使細(xì)胞密度為1×106個(gè)/孔，除陰性對(duì)照組外，其他各組加入20 μg·mL-1的LPS.培養(yǎng)24 h 后收集上清液，按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)IL-1β, IL-6, TNF-α 含量.

2.8 體外培養(yǎng)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖檢測(cè)

取正常小鼠的脾臟，獲取脾細(xì)胞懸液，去除紅細(xì)胞后，接種于96孔板中，使細(xì)胞密度為2×105個(gè)/孔，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔.設(shè)黃精多糖組：加入不同濃度的黃精多糖溶液使其終濃度為0, 25, 50, 100, 200, 400 μg/mL.黃精多糖與ConA協(xié)同作用組：每孔加入50 μg·mL-1ConA 10 μL，和不同濃度的黃精多糖溶液使其終濃度為0, 25, 50, 100, 200, 400 μg·mL-1.培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加150 μL DMSO，測(cè)定OD570值，以各實(shí)驗(yàn)組與空白組OD值的比值計(jì)算脾細(xì)胞增殖指數(shù).

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 黃精多糖對(duì)免疫抑制小鼠脾臟指數(shù)和脾細(xì)胞ConA 刺激指數(shù)的影響

黃精多糖對(duì)免疫抑制小鼠脾指數(shù)和協(xié)同ConA 刺激小鼠脾細(xì)胞增殖的影響結(jié)果見(jiàn)表1.如表1所示：與正常組相比，模型組小鼠脾臟指數(shù)降低39.1%，ConA刺激指數(shù)降低30.9%(P<0.05).相對(duì)于模型組小鼠，黃精多糖不同劑量組小鼠的脾臟指數(shù)、ConA刺激指數(shù)均明顯增加，且呈現(xiàn)良好的劑量正相關(guān)性；其中，黃精多糖高劑量(150 mg·kg-1)組小鼠的脾臟指數(shù)增加79.0%(P<0.01)，協(xié)同ConA刺激指數(shù)增加43.3%(P<0.05).

表1 黃精多糖對(duì)免疫低下小鼠脾臟指數(shù)和ConA 刺激脾細(xì)胞增殖的影響Tab.1 Effects of PSP on spleen index and proliferation ofsplenocyte stimulated by ConA in immunosuppression mice

注：與正常組比較，△P<0.05；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

3.2 黃精多糖對(duì)免疫抑制小鼠胸腺指數(shù)和胸腺細(xì)胞協(xié)同ConA 刺激指數(shù)的影響

黃精多糖對(duì)免疫低下小鼠胸腺指數(shù)及ConA刺激胸腺細(xì)胞增殖的影響結(jié)果見(jiàn)表2.如表2所示：模型組小鼠的胸腺指數(shù)和ConA刺激指數(shù)與正常組相比分別降低了52.2%和34.5%(P<0.05).而黃精多糖不同劑量組小鼠與模型組小鼠相比，其胸腺指數(shù)均有不同程度的升高，且呈現(xiàn)良好的劑量正相關(guān)性.其中黃精多糖高劑量組(150 mg·kg-1)小鼠的胸腺指數(shù)較模型組升高148.3%(P<0.01)，協(xié)同ConA刺激指數(shù)較之升高48.5%(P<0.05).

表2 黃精多糖對(duì)免疫低下小鼠胸腺指數(shù)及ConA刺激胸腺細(xì)胞增殖的影響

注：與正常組比較，△P<0.05；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

3.3 黃精多糖對(duì)免疫抑制小鼠巨噬細(xì)胞分泌IL-1β, IL-6,TNF-α 的影響

黃精多糖對(duì)免疫低下小鼠巨噬細(xì)胞分泌IL-1β, IL-6, TNF-α 的影響結(jié)果見(jiàn)表3.如表3 所示：與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠巨噬細(xì)胞分泌IL-6 和TNF-α 的含量降低(P<0.05).與模型組比較，黃精多糖不同劑量組小鼠巨噬細(xì)胞分泌IL-6 和TNF-α的量均有不同程度地升高，其中黃精多糖高劑量組(150 mg·kg-1)小鼠的巨噬細(xì)胞分泌IL-6 和TNF-α顯著升高(P<0.01).

表3 黃精多糖對(duì)免疫低下小鼠巨噬細(xì)胞分泌IL-1β, IL-6, TNF-α 的影響Tab.3 Effects of PSP on the secretion of IL-1β, IL-6, TNF-α in macrophages of immunosuppression mice

注：與正常組比較,△P<0.05，△△P<0.01；與模型組比較,*P<0.05，**P<0.01

3.4 黃精多糖對(duì)免疫抑制小鼠巨噬細(xì)胞吞噬活力的影響

黃精多糖對(duì)免疫低下小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響結(jié)果見(jiàn)圖1.如圖1所示：與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)顯著降低(P<0.01)，說(shuō)明造模成功.與模型組小鼠比較，黃精多糖低、中、高劑量組小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)均有所升高，并且呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系，其中高劑量組升高作用具有顯著性意義(P<0.05).

與正常組比較，△△P<0.01；與模型組比較，*P<0.05圖1 黃精多糖對(duì)免疫低下小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響Fig.1 Effect of PSP on phagocytosis of macrophages in immunosuppression mice

3.5 黃精多糖對(duì)正常小鼠脾細(xì)胞增殖活性的促進(jìn)作用

黃精多糖對(duì)正常小鼠脾細(xì)胞增殖活性的促進(jìn)作用結(jié)果見(jiàn)表4.如表4所示：與空白組相比，黃精多糖單獨(dú)作用和協(xié)同ConA作用均可促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞增殖，且呈良好的劑量依賴(lài)關(guān)系；其中200, 400 μg·mL-1劑量組均可以極顯著地促進(jìn)脾細(xì)胞增殖(P<0.001)，協(xié)同ConA時(shí)的最大增殖促進(jìn)率達(dá)到了760%.

Tab.4 Effect of PSP on the proliferation activity of spleen cells in normal mice

黃精多糖濃度/(μg?mL-1)脾細(xì)胞增殖指數(shù)黃精多糖組ConA+黃精多糖組01.00±0.131.42±0.10251.09±0.351.83±0.19501.24±0.123.57±0.37*1001.76±0.30* 4.14±0.43**200 2.19±0.57** 7.39±0.76***400 4.32±0.87*** 7.60±1.05***

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

4 討論

機(jī)體的免疫系統(tǒng)是由免疫器官、免疫細(xì)胞和免疫分子組成，胸腺是機(jī)體主要的中樞免疫器官，它對(duì)外周免疫器官及免疫細(xì)胞起重要的調(diào)節(jié)作用.脾臟作為機(jī)體最大的外周免疫器官，其通過(guò)巨噬細(xì)胞的吞噬作用、T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫作用和B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫作用行使免疫功能[8].本實(shí)驗(yàn)中，小鼠經(jīng)注射環(huán)磷酰胺后，與正常組小鼠相比，胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均明顯下降，經(jīng)ConA 刺激的模型小鼠脾臟和胸腺細(xì)胞增殖也同時(shí)受到抑制，說(shuō)明環(huán)磷酰胺致小鼠免疫抑制模型構(gòu)建成功.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：黃精多糖能使免疫抑制小鼠降低的脾臟與胸腺指數(shù)得到改善甚至完全恢復(fù)，并顯著提高 ConA 協(xié)同刺激下的模型小鼠脾臟與胸腺淋巴細(xì)胞的體外增殖能力.巨噬細(xì)胞能分泌多種生物活性物質(zhì)，激活其他免疫細(xì)胞，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[9,10].中性紅吞噬試驗(yàn)結(jié)果顯示：環(huán)磷酰胺致免疫抑制模型組小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力較正常組顯著降低，而黃精多糖不同劑量組均能不同程度地增強(qiáng)免疫低下小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力，且呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系.TNF-α, IL-1β, IL-6是主要參與炎癥和機(jī)體免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子，主要由巨噬細(xì)胞分泌[8,11]，在LPS的刺激下，環(huán)磷酰胺所致免疫抑制模型小鼠的巨噬細(xì)胞分泌IL-6和TNF-α的能力降低，而黃精多糖則能劑量依賴(lài)性地拮抗這種抑制作用.

綜上所述，黃精多糖能通過(guò)提高環(huán)磷酰胺所致免疫功能低下小鼠的脾臟、胸腺指數(shù)，單獨(dú)或協(xié)助增強(qiáng)ConA刺激下的脾臟和胸腺細(xì)胞的增殖能力，上調(diào)巨噬細(xì)胞的吞噬能力，和增強(qiáng)IL-6和TNF-α的分泌，顯著緩解了環(huán)磷酰胺所致小鼠的免疫低下，本研究為黃精多糖改善腫瘤化療患者免疫功能低下的臨床應(yīng)用及其產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供了科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù).

參 考 文 獻(xiàn)

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