孫宏浩，梁玉芬,，趙曉雙，黃 玲，廖天作

(1湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院，湖北省工業(yè)發(fā)酵協(xié)同創(chuàng)新中心，發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430068;2江西中醫(yī)藥高等專科學(xué)校 醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)部，撫州344000)

NT-proBNP是由腦鈉肽原(pro-BNP)經(jīng)內(nèi)切酶酶切產(chǎn)生的一種無(wú)活性的N端多肽片段，主要存在于心肌細(xì)胞對(duì)心室壁的張力或局部缺血作出應(yīng)答所產(chǎn)生的分泌物中[1].大量研究表明：NT-proBNP半衰期較短，穩(wěn)定性強(qiáng)，可作為心力衰竭診斷測(cè)試的主要指標(biāo)，在疾病診斷及預(yù)后評(píng)估階段具有重要作用[2].在患有心力衰竭和其他心血管疾病的患者體內(nèi)，NT-proBNP的濃度明顯升高，且與心功能受損程度呈正相關(guān)[3].對(duì)于NT-proBNP的定量檢測(cè)，可用于心血管疾病的臨床診斷、預(yù)后判斷及治療效果評(píng)價(jià)[4].目前，定量檢測(cè)NT-proBNP的方法主要有：放射性免疫檢測(cè)技術(shù)[5]、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定[6]、電化學(xué)發(fā)光免疫分析[7]及熒光免疫層析技術(shù)[8].放射性免疫檢測(cè)技術(shù)成本較低，但存在潛在的放射污染可能，由于試劑具有半衰期，每次操作都要做標(biāo)準(zhǔn)曲線，逐漸被非放射標(biāo)記免疫測(cè)定技術(shù)所取代.酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定被廣泛應(yīng)用，但操作繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且準(zhǔn)確性和靈敏度較低.電化學(xué)發(fā)光免疫分析廣泛應(yīng)用于定量檢測(cè)NT-proBNP，其中，羅氏(Roche)Elecsys 電化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)具有高靈敏性和準(zhǔn)確性，常用于生物標(biāo)志物的快速檢測(cè)[9]，但需要大量樣本才能降低成本，不適用于中小型機(jī)構(gòu)及個(gè)人對(duì)NT-proBNP的定量和快速檢測(cè)檢測(cè).此外，昂貴的檢測(cè)設(shè)備及所需試劑使電化學(xué)發(fā)光免疫儀器在中小醫(yī)療機(jī)構(gòu)很難普及，更無(wú)法用于POCTs.目前，基于熒光標(biāo)記物的免疫層析技術(shù)發(fā)展迅速，各種熒光標(biāo)記物也不斷涌現(xiàn)，如金磁復(fù)合納米球MNP@SiO2@BSA@AuNPs用以定量檢測(cè)肌紅蛋白[10],熒光免疫層析技術(shù)與電化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)技術(shù)相比，該方法具有操作簡(jiǎn)單、成本低、檢測(cè)快速，但檢測(cè)靈敏度較低.

在NT-proBNP免疫層析檢測(cè)中，由于T線抗體和抗原-熒光微球復(fù)合體僅有15 s的作用時(shí)間, 因此在心力衰竭檢測(cè)中NT-proBNP的有效檢測(cè)限需要達(dá)到20 ng·L-1[11].在抗原濃度低、反應(yīng)時(shí)間極短的條件下，單一的免疫層析技術(shù)很難實(shí)現(xiàn)對(duì)低濃度NT-proBNP的準(zhǔn)確檢測(cè).利用生物素和鏈霉親和素之間高度特異性親和力以及多級(jí)放大效應(yīng)，可提高免疫結(jié)合和示蹤分析的靈敏度[12].目前，該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于追蹤抗原和抗體，定性和定量檢測(cè)以及追蹤定位等研究中.生物素與鏈霉親和素之間的結(jié)合力可達(dá)1015mol·L-1，且兩者結(jié)合快速，耐受性強(qiáng)，一旦形成高親和力，就不會(huì)受到極端pH、溫度、有機(jī)溶劑以及其他變性劑的影響，這些因素對(duì)于純化或檢測(cè)結(jié)合蛋白均具有重要作用[13].因此，本文采用生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)與熒光免疫層析技術(shù)相結(jié)合的方法，以期實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)便、快速、靈敏檢測(cè)NT-proBNP(原理圖見圖1).

圖1 生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)結(jié)合熒光免疫層析技術(shù)檢測(cè)NT-proBNP的原理圖Fig.1 Schematic diagrams of biotin-streptavidin system combined with fluorescenceimmunochromatography for detecting NT-proBNP

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

MES緩沖液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、PB(磷酸鹽溶液)均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，抗體5B6、抗體15F11、抗體15C4、抗體13G12、抗體24E11、抗體29D12、抗體18H5、抗體16E6、NT-proBNP(Hytest Ltd)，牛血清白蛋白(BSA, Roche)，生物素、鏈霉親和素(Sigma Aldic)，羊抗鼠IgG(Abcam)，400 nm熒光微球(北京華泰昕生物醫(yī)療)，PVC底板、樣品墊、吸水紙、硝酸纖維膜均(上海金標(biāo)生物技術(shù)).

噴金劃膜儀(XYZ-3050，美國(guó)BIO-DOT)，切條機(jī)(HGS201，杭州峰航科技)，離心機(jī)(H-2050R，湖南長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器)，超聲清洗器(DH-120DTN，上海狄昊實(shí)業(yè))，旋轉(zhuǎn)混勻儀(MX-RD-E，Biologix Group Ltd.)，熒光快速檢測(cè)儀(HG-98，上海互幗科學(xué)儀器)，快速免疫分析儀(AQT90 FLEX，雷度米特醫(yī)療設(shè)備).

1.2 抗體對(duì)的篩選

以抗體5B6為偶聯(lián)抗體，選擇合適抗體與5B6配對(duì)構(gòu)成雙抗體夾心模型.以5B6作為標(biāo)記抗體，抗體15C4、抗體13G12、抗體24E11、抗體15F11、抗體29D12、抗體18H5、抗體16E6分別作為T線抗體，制備免疫層析試紙條，分別對(duì)濃度為30000,9000, 0 ng·L-1的NT-proBNP進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算T/C值，繪制柱形圖.

1.3 制備抗體5B6標(biāo)記的熒光微球

1.4 生物素化抗體的制備

1.5 免疫層析試紙條的制備

在聚氯乙烯板上使用樣品墊、硝酸纖維膜及吸水紙組裝免疫層析試紙條，在NC膜上，以0.6g·L-1抗體15F11作為T線，0.1g·L-1羊抗鼠IgG作為C線.切割為4 mm的條狀，將試紙條置于卡殼中常溫干燥保存.

1.6 生物素-鏈霉親和素聯(lián)合免疫層析試紙條的制備

1.7 NT-proBNP的定量檢測(cè)

使用1.5中制備的免疫層析試紙條，在樣品墊處分別滴加濃度為30, 20, 9,5, 3, 1.5, 0.9, 0.5, 0.2, 0.15, 0.02 μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)樣品，并與1.3制備的熒光微球0.5L反應(yīng)1 min，取pH 7.4的PB緩沖溶液作為層析液，分別檢測(cè)T線及C線的熒光強(qiáng)度，計(jì)算T/C值.繪制T/C-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線.

使用1.6中制備的新型試紙條，將1.3制備的熒光微球0.125L與1.4中制備的生物素化抗體2L混合，滴加至結(jié)合墊處，以200 mM pH 7.4的PB緩沖溶液作為層析液，分別取濃度為30, 20, 9, 5, 3, 1.5, 0.9, 0.5, 0.2, 0.15, 0.02 μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)樣品添加至樣品墊處，反應(yīng)1 min.檢測(cè)T線及C線的熒光強(qiáng)度，計(jì)算T/C值，繪制T/C-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.8 全血檢測(cè)

使用1.6中制備的新型試紙條對(duì)4組血液樣本(編號(hào)A1，A2，A3，A4)進(jìn)行免疫層析檢測(cè)，并根據(jù)1.7中標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血液樣本中NT-proBNP濃度.運(yùn)用雷度快速免疫分析儀對(duì)相同血液樣本進(jìn)行檢測(cè)，比較兩者所測(cè)結(jié)果.

2 結(jié)果與分析

2.1 抗體對(duì)的篩選結(jié)果

以5B6作為標(biāo)記抗體，選擇7個(gè)不同的抗體對(duì)進(jìn)行免疫層析試驗(yàn)，并針對(duì)不同濃度NT-proBNP進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)層析結(jié)果，計(jì)算每組的T/C值，結(jié)果如圖2.由圖2可知：以5B6作為標(biāo)記抗體，15F11作為劃線抗體時(shí)，不同濃度T/C值區(qū)分度較大，故而選擇5B6-15F11為最佳抗體對(duì).

圖2 不同抗體對(duì)的免疫層析試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Immunochromatographic test results of different antibody pairs

2.2 免疫層析方法檢測(cè)NT-proBNP

用免疫層析方法檢測(cè)NT-proBNP結(jié)果見圖3.由圖3可知：當(dāng)濃度為0.02～0.5 μg·L-1時(shí)，T線無(wú)熒光信號(hào)；濃度為0.5～9 μg·L-1時(shí)，T線熒光強(qiáng)度較低，且T/C值區(qū)分度差；濃度為20～30 μg·L-1時(shí)，T線熒光強(qiáng)度較高.

圖3 免疫層析法檢測(cè)NT-proBNP的熒光光譜Fig.3 NT-proBNP fluorescence spectra by immunochromatographic assay

NT-proBNP濃度與T/C值的關(guān)系曲線見圖4.由圖4可知：在較低濃度下，T/C區(qū)分度較低，且與濃度無(wú)明顯相關(guān)性，故在較低濃度范圍內(nèi)，常規(guī)免疫層析方法并不能在T線實(shí)現(xiàn)對(duì)抗原-抗體的快速捕捉，無(wú)法對(duì)低濃度NT-proBNP進(jìn)行定量檢測(cè).

圖4 NT-proBNP濃度與T/C值的關(guān)系曲線Fig.4 Relationship curve of NT-proBNP concentration and T/C value

2.3 生物素-鏈霉親和素聯(lián)合免疫層析檢測(cè)NT-proBNP

生物素-鏈霉親和素聯(lián)合免疫層析檢測(cè)NT-proBNP檢測(cè)結(jié)果見圖5.圖5顯示：在不同NT-proBNP濃度下，檢測(cè)線和質(zhì)控線的熒光強(qiáng)度區(qū)分度良好，且在較低濃度范圍(0.02～0.2 μg·L-1)內(nèi)，該方法仍能實(shí)現(xiàn)T線鏈霉親和素對(duì)生物素-15F11-抗原- 5B6-熒光微球復(fù)合體的高效捕獲.

圖5 生物素-鏈霉親和素聯(lián)合免疫層析檢測(cè)NT-proBNP的熒光光譜Fig.5 NT-proBNP fluorescence spectra by biotin-streptavidin system combined with immunochromatographic assay

為進(jìn)一步證明聯(lián)合檢測(cè)方法的可行性，繪制T/C值與抗原濃度的關(guān)系曲線結(jié)果見圖6.如圖6所示，兩者呈較好的線性關(guān)系.

圖6 NT-proBNP濃度與T/C值的關(guān)系曲線 Fig.6 Relationship curve of NT-proBNPconcentration and T/C value

2.4 全血層析結(jié)果

使用新型免疫層析試紙條對(duì)A1, A2, A3, A4四組血樣進(jìn)行NT-proBNP快速檢測(cè)，并運(yùn)用雷度快速免疫分析儀對(duì)相同血樣進(jìn)行定量檢測(cè)，對(duì)比兩者檢測(cè)結(jié)果，如表1所示. 由表1可知：針對(duì)不同全血樣品，對(duì)比本試驗(yàn)研制的新型免疫層析試紙條所測(cè)NT-proBNP濃度與雷度快速免疫分析儀定量檢測(cè)結(jié)果，兩者差異較小.因此，生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)結(jié)合免疫層析技術(shù)制備的試紙條可用于臨床快速檢測(cè)中.

表1 全血檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)語(yǔ)

本試驗(yàn)利用生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)的高親和力以及多級(jí)放大效應(yīng)，結(jié)合免疫熒光技術(shù)制備新型免疫熒光試紙條.試驗(yàn)結(jié)果表明，相較于常規(guī)免疫層析技術(shù)，新型免疫層析試紙條NT-proBNP在低濃度下(0.02 ～ 0.2 μg·L-1)仍具有較好的區(qū)分度，T/C值與抗原濃度呈良好的線性關(guān)系.在全血檢測(cè)中，對(duì)比新型免疫層析試紙條檢測(cè)結(jié)果與雷度檢測(cè)結(jié)果，兩者相差較小.生物素鏈霉親和素系統(tǒng)聯(lián)合免疫層析技術(shù)優(yōu)于常規(guī)免疫層析檢測(cè)技術(shù)，可廣泛應(yīng)用于床旁檢驗(yàn)(POCTs)等臨床診斷階段.

參 考 文 獻(xiàn)

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