王東霞，葉珊珊，李瑩潔，王再興

大皰性類天皰瘡(bullous pemphegoid, BP)是好發(fā)于老年人的自身免疫性大皰性皮膚病，發(fā)病機(jī)制尚不完全明確。近年來，趨化因子及其受體在自身免疫性疾病發(fā)病中的作用是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。研究[1-3]證實(shí)，趨化因子參與天皰瘡、系統(tǒng)性硬化癥和銀屑病等自身免疫性疾病發(fā)病過程。該研究應(yīng)用免疫組化方法觀察BP患者皮損中Th1/Th2趨化因子及其受體的表達(dá)，探討其與BP發(fā)病機(jī)制是否相關(guān)，以對(duì)BP的發(fā)病機(jī)制有更深入的了解。

1 材料與方法

1.1病例資料50 例BP患者來自2016年1月～2016年12月在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科門診就診和住院治療患者,所有病例經(jīng)臨床表現(xiàn)、組織病理、免疫熒光等檢查明確診斷為BP，其中女28例,男22例，年齡21～92(69.56±15.82)歲。30例對(duì)照組系我院皮膚科手術(shù)切除的健康人皮膚，女20例,男10例，年齡8～73(33.33±15.20)歲。

1.2方法

1.2.1主要試劑 兔抗人CXCL9多抗、兔抗人CXCL11多抗、兔抗人CCL17單克隆抗體、兔抗人CCL22多抗、小鼠抗人CXCR3單克隆抗體、兔抗人CCR4多抗，購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；二抗試劑盒(PV-6000)、DAB試劑盒，購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2.2實(shí)驗(yàn)方法 免疫組化SP法染色，按SP試劑盒說明操作。顯微鏡觀察所有染色切片趨化因子及其受體的表達(dá)，以細(xì)胞和細(xì)胞間質(zhì)呈現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)完整而不重復(fù)的顯微鏡下視野，應(yīng)用JEOR801D 圖像分析軟件測(cè)定每個(gè)視野下4種趨化因子及受體表達(dá)的光密度(OD)值，最后取其平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.14種趨化因子及其受體的表達(dá)部位對(duì)照組中4種趨化因子及其受體只在表皮基底細(xì)胞層中少量表達(dá)，細(xì)胞膜和細(xì)胞間質(zhì)可見棕黃色顆粒；BP患者皮損中4種趨化因子及其受體主要表達(dá)于表皮基底細(xì)胞層和中上部棘細(xì)胞層細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，尤其是淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)部位，在乳頭層血管內(nèi)皮細(xì)胞、水皰的皰頂及水皰間質(zhì)均有表達(dá)。見圖1。

2.24種趨化因子及其受體在BP患者及健康對(duì)照皮膚中的表達(dá)數(shù)量BP皮損中4種趨化因子及其受體陽(yáng)性表達(dá)的OD值均高于對(duì)照組。其中，BP皮損中Th1趨化因子CXCL9、CXCL11及其受體CXCR3表達(dá)的OD值分別為(0.55±0.09)、(0.38±0.06)和(0.37±0.04)，Th2趨化因子CCL17、CCL22及其受體CCR4表達(dá)的OD值分別為(0.42±0.10)、(0.35±0.04)和(0.42±0.05)。對(duì)照組中CXCL9、CXCL11及其受體CXCR3表達(dá)的OD值分別為(0.26±0.08)、(0.18±0.04)和(0.22±0.02)，CCL17、CCL22及其受體CCR4表達(dá)的OD值分別為(0.25±0.12)、(0.21±0.03)和(0.24±0.07)。4種趨化因子及其受體在BP皮損和對(duì)照組皮膚中的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)，見表1。

3 討論

CD4+T細(xì)胞在適應(yīng)性免疫反應(yīng)過程中起關(guān)鍵作用，這些細(xì)胞需精確和協(xié)調(diào)地遷移至炎癥部位才能適當(dāng)發(fā)揮效應(yīng)功能。細(xì)胞歸巢由細(xì)胞膜上趨化因子受體的動(dòng)態(tài)表達(dá)來控制，不同CD4+T細(xì)胞子集根據(jù)其表達(dá)趨化因子受體不同，與特定趨化因子結(jié)合發(fā)生定向遷移[4]。Th1細(xì)胞表達(dá)的典型趨化因子受體是CXCR3，CXCR3軸是典型的炎癥軸，CXCR3在原始T細(xì)胞上不存在，而配體僅在細(xì)胞暴露于炎性刺激時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生。CXCL11是最有效的配體，其次是CXCL10和CXCL9[5]。 CXCR3對(duì)于Th1細(xì)胞的募集是至關(guān)重要的，在缺乏CXCR3的情況下，感染、自身免疫性疾病和許多癌癥中的Th1細(xì)胞遷移受到抑制[6]。Th2細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表達(dá)CCR4，特異性配體是CCL17和CCL22[7]。特應(yīng)性皮炎模型中，CCR4缺陷的Th2細(xì)胞不能遷移至炎癥部位，這對(duì)引發(fā)皮膚炎癥是必不可少的[8]。

圖1 BP患者皮損和對(duì)照組皮膚中4種趨化因子及其受體免疫組化結(jié)果 SP×200A：BP組；B：對(duì)照組；1：CXCL9；2：CXCL11；3：CCL17；4：CCL22；5：CXCR3；6：CCR4

表1 BP皮損和對(duì)照組皮膚中4種趨化因子及其受體的表達(dá)

BP180胞外跨膜結(jié)構(gòu)域-非膠原16A結(jié)構(gòu)域(NC16A)是自身抗體作用的主要靶點(diǎn)，BP180 NC16A特異性自身抗體主要是IgE和IgG，抗體血清水平與疾病活動(dòng)性相關(guān)[9]。多數(shù)BP患者體內(nèi)具有自身反應(yīng)性T細(xì)胞，主要與細(xì)胞膜上BP180NC16A位點(diǎn)結(jié)合，這些T淋巴細(xì)胞屬于CD4+T細(xì)胞，可以生成Th1/Th2混合細(xì)胞因子[10]。研究[11]認(rèn)為，Th1和Th2細(xì)胞因子的血清水平升高與BP患者的疾病活動(dòng)相關(guān)。Th1細(xì)胞因子(如IFN-γ)能夠誘導(dǎo)IgG1和IgG2的分泌，而Th2細(xì)胞因子(如IL-4，IL-5和IL-13)可以調(diào)節(jié)IgG4和IgE的分泌，BP患者血清中同種型抗BP180和抗BP230抗體IgG1、IgG4和IgE的檢測(cè)表明，自身反應(yīng)性Th1和Th2細(xì)胞參與了對(duì)BP靶抗原反應(yīng)的調(diào)節(jié)。

Kakinuma et al[12]通過檢測(cè)20例BP患者血清和皰液中CCL17水平及4例BP患者皮膚組織中CCL17表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)BP患者血清、皰液和皮損中CCL17水平升高，且血清CCL17水平與嗜酸性粒細(xì)胞水平及疾病活動(dòng)性呈正相關(guān)，治療后水平下降。Echigo et al[13]通過檢測(cè)27例BP患者血清中CXCL9和CCL17、CCL22的水平，發(fā)現(xiàn)它們的血清水平均升高，隨著病情緩解其水平下降。國(guó)內(nèi)耿士玲 等[14]應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)30例BP患者皮損中Th1 趨化因子 CXCL9、CXCL10、CXCL11和Th2型趨化因子CCL22及其受體CXCR3、CCR4的表達(dá)，結(jié)果顯示BP皮損中4種趨化因子及其受體的表達(dá)均高于對(duì)照組皮膚。本研究使用免疫組化方法，并首次應(yīng)用光密度(OD)技術(shù)檢測(cè)50例BP患者和30例對(duì)照組Th1趨化因子CXCL9、CXCL11和Th2趨化因子CCL17、CCL22及受體CXCR3 、CCR4的表達(dá)情況。研究結(jié)果顯示，BP患者和對(duì)照組中4種趨化因子及其受體僅表達(dá)于表皮層，細(xì)胞膜和細(xì)胞間質(zhì)可見棕黃色顆粒；BP患者皮損中4種趨化因子及其受體主要表達(dá)于表皮基底細(xì)胞層和中上部棘細(xì)胞層，尤其是淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)部位，在乳頭層血管內(nèi)皮細(xì)胞、水皰的皰頂及水皰間質(zhì)均有表達(dá)。對(duì)照組皮膚中只在表皮基底細(xì)胞層表達(dá)。BP患者皮損中4種趨化因子及其受體陽(yáng)性表達(dá)的OD值均高于對(duì)照組。證實(shí)BP患者皮損中Th1和Th2趨化因子表達(dá)水平均升高，提示其在BP患者體內(nèi)Th1和Th2細(xì)胞募集過程中起重要作用，從而參與BP發(fā)病過程。

本研究結(jié)果表明趨化因子可能參與了BP發(fā)病過程，其與細(xì)胞因子及炎癥細(xì)胞相關(guān)作用機(jī)制還需進(jìn)一步探索。

[1] Timoteo R P, da Silva M V,Miguel C B,et al.Th1/Th17-related cytokines and chemokines and their implications in the pathogenesis of pemphigus vulgaris[J]. Mediators Inflamm,2017,2017:7151285.

[2] Hoffmann-Vold A M,Tennoe A H,Gaen T,et al.High level of chemokine ccl18 is associated with pulmonary function deterioration, lung fibrosis progression, and reduced survival in systemic sclerosis[J]. Chest,2016,150(2):299-306.

[3] Mabuchi T,Chang T W,Quinter S,et al.Chemokine receptors in the pathogenesis and therapy of psoriasis[J].J Dermatol Sci,2012 65(1):4-11.

[4] Nibbs R J, Graham G J. Immune regulation by atypical chemokine receptors[J].Nat Rev Immunol, 2013 ,13(11):815-29.

[5] Van Raemdonck K,Van den Steen PE,Liekens S,et al.CXCR3 ligands in disease and therapy[J].Cytokine Growth Factor Rev,2015,26(3):311-27.

[6] Groom J R,Luster A D.CXCR3 in T cell function[J].Exp Cell Res,2011,317(5):620-31.

[7] Sallusto F.Heterogeneity of human CD4(+) T cells against microbes[J].Annu Rev Immunol,2016 ,34:317-34.

[8] Oyoshi M K, Elkhal A,Scott J E,et al.Epicutaneous challenge of orally immunized mice redirects antigen-specific gut-homing T cells to the skin[J].J Clin Invest,2011, 121(6):2210-20.

[9] Kalowska M, Ciepiela O, Kowalewski C ,et al.Enzyme-linked immunoassay index for anti-NC16a IgG and IgE auto-antibodies correlates with severity and activity of bullous pemphigoid[J]. Acta Derm Venereol ,2016,96:191-6.

[10] Pickford W J , Gudi V, Haggart A M,et al.T cell participation in autoreactivity to NC16a epitopes in bullous pemphigoid[J].Clin Exp Immunol, 2015 ,180(2):189-200.

[11] Kasperkiewicz M,Zillikens D.The pathophysiology of bullous pemphigoid[J]. Clin Rev Allergy Immunol,2007, 33(1-2):67-77.

[12] Kakinuma T, Wakugawa M, Nakamura K,et al.High level of thymus and activation-regulated chemokine in blister fluid and sera of patients with bullous pemphigoid[J].Br J Dermatol,2003,148(2):203-10.

[13] Echigo T , Hasegawa M, Shimada Y,et al.Both Th1 and Th2 chemokines are elevated in sera of patients with autoimmune blistering diseases[J].Arch Dermatol Res, 2006 ,298(1):38-45.

[14] 耿士玲，單士軍，吳 劍，等.大皰性類天皰瘡皮損中 Th1/Th2 趨化因子及其受體的表達(dá)[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志, 2010, 26(3):270-2.