吳莎莎，范曉云，梁雅雪，徐玉菲，王亞妮，管明龍

哮喘是以氣道高反應(yīng)性和氣道重構(gòu)為特征的一種常見的呼吸系統(tǒng)疾病，哮喘的本質(zhì)是慢性氣道炎癥。氣道上皮細(xì)胞(airway epithelial cell，AEC)是氣道、肺內(nèi)穩(wěn)態(tài)和炎癥的主要調(diào)節(jié)細(xì)胞，能夠通過抑制內(nèi)源性的PRR信號等機(jī)制抑制炎癥過程[1]，氣道上皮損傷及損傷后的異常凋亡在哮喘發(fā)病中起到了重要作用，損傷的氣道上皮細(xì)胞破壞了氣道的屏障功能，并且能夠合成釋放多種炎癥因子，調(diào)控哮喘氣道炎癥及氣道重塑的病理過程[2]。聚陽離子蛋白多聚左旋精氨酸(poly-L-arginine，PLA)能夠在不產(chǎn)生嚴(yán)重的上皮細(xì)胞毒性的情況下激活細(xì)胞內(nèi)的激酶或磷酸酶，改變大分子透膜電位，體外研究中PLA常被來誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞模擬哮喘炎癥反應(yīng)[3]。實(shí)驗(yàn)組前期研究[4]顯示體外 PLA 可引起氣道上皮細(xì)胞凋亡，但其具體信號通路及分子調(diào)控機(jī)制尚不清楚，該研究旨在探討c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)信號通路在此過程中的作用。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1細(xì)胞株 NCI-H292細(xì)胞屬人肺的黏液上皮樣癌細(xì)胞，由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫提供。

1.1.2主要試劑 胎牛血清(美國Gibco公司)； Western blot檢測試劑、RPMI 1640 培養(yǎng)液(美國 Thermo 公司)；多聚左旋精氨酸、SP600125-JNK 通路特異性抑制劑(美國 Sigma 公司)； 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白B淋巴細(xì)胞瘤-2蛋白(B-cell lymphoma-2，BCL-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein, BAX)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase-3)蛋白一抗(美國 CST 公司)；抗β-actin 抗體、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔/小鼠 IgG(H+L)(北京中杉金橋公司)；胰蛋白酶酶、Western blot 一抗稀釋液、RIPA 裂解液(江蘇碧云天公司)；流式 Annexin V-66FITC/PI雙染凋亡檢測試劑盒(上海貝博生物公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) NCI-H292細(xì)胞生長于10%胎牛血清+100 mg/L 青霉素+100 mg/L鏈霉素+12 mmol/L L-谷氨酰胺的RPMI1640培養(yǎng)液中，放置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)，每2～3 d換液1次。

1.2.2Western blot 法檢測PLA處理24 h后的NCI-H292細(xì)胞內(nèi)JNK及P-JNK 的表達(dá) 將加入PLA 的濃度梯度分5組: 0、10、20、40、60 mg/L，作用NCI-H292細(xì)胞24 h后提取各組細(xì)胞總蛋白，SDS-PAGE電泳分離蛋白并將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜上，室溫下在50 g/L的脫脂牛奶中封閉2 h，洗膜后孵化一抗過夜、再次洗膜后孵化二抗，最后將膜置于暗室中ECL顯影。以β-actin為內(nèi)參，Image J分析條帶灰度值，分析各組JNK磷酸化有無差異。

1.2.3流式細(xì)胞儀雙染色法檢測JNK信號通路特異性阻斷劑SP600125干預(yù)后PLA作用24 h的NCI-H292細(xì)胞凋亡率 設(shè)空白對照組、PLA 組、SP600125 組、PLA+ SP600125組，提前30 min用SP600125預(yù)處理NCI-H292細(xì)胞，然后按照分組要求加入PLA， 培養(yǎng)24 h后用胰酶消化轉(zhuǎn)移至15 ml離心管離心5 min(1 500 r/min)，棄上清液，PBS洗滌2次后離心5 min(1 500 r/min)；用400 μl 1×Annexin V結(jié)合液懸浮細(xì)胞，室溫下避光孵育15 min；再加入10 μl PI染色液，4 ℃下孵育 5 min，PBS洗滌重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀(BDFACSVERS，美國)檢測，F(xiàn)lowJo軟件分析結(jié)果。

1.2.4Western blot檢測抑制JNK信號通路后凋亡蛋白及信號通路蛋白的表達(dá) 采用Western blot法分別檢測空白對照組、PLA 組、PLA+ SP600125 組、SP600125 組中NCI-H292細(xì)胞內(nèi) Bax、Bcl-2、Casepase-3的表達(dá)和信號通路蛋白JNK、P-JNK的表達(dá)，具體操作方法同上。

2 結(jié)果

2.1PLA作用于NCI-H292細(xì)胞內(nèi)的JNK磷酸化水平變化Western blot 法檢測不同濃度 PLA( 0、10、20、40、60 mg/L)作用于NCI-H292細(xì)胞后各組的 JNK、P-JNK、β-actin 蛋白含量，與空白對照組比較， 10 mg/L組JNK 磷酸化水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.179)，20、40、60 mg/L組的JNK 磷酸化水平均增加，且呈現(xiàn)濃度依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.239，P均<0.05)。見圖1。

2.2SP600125抑制PLA對NCI-H292細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用流式 Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測NCIH292細(xì)胞凋亡率結(jié)果顯示，空白對照組、PLA組、SP600125組、 PLA+SP600125組NCI-H292細(xì)胞凋亡率分別為(5.13±1.12)%、(22.62±1.66)%、(5.69±0.18)%、(8.99±1.74) %；采用單因素方差分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果，顯示各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=113.961，P<0.001)，與對照組相比，PLA 組NCI-H292細(xì)胞凋亡率增高(P<0.001)；與PLA組比較，PLA+SP組細(xì)胞凋亡率降低(P<0.001)。說明PLA作用后NCI-H292細(xì)胞凋亡率增加，而SP600125能抑制PLA對NCI-H292細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。見圖2。

圖1 Western blot法檢測 PLA作用24 h后NCI-H292細(xì)胞內(nèi)P-JNK/JNK的表達(dá)

1:0 mg/L PLA；2: 10 mg/L PLA； 3: 20 mg/L PLA； 4: 40 mg/L PLA； 5: 60 mg/L PLA；與對照組比較：*P<0.05

2.3SP600125對PLA誘導(dǎo)的NCI-H292細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)及JNK磷酸化的影響Western blot檢測對照組、PLA 組、PLA+ SP組、SP組的BCL- 2 /Bax和Caspase-3、P-JNK/JNK水平，與空白對照組比較，PLA組Bcl-2/Bax比值降低(F=21.077，P<0.01)； Caspase-3表達(dá)明顯升高(F=31.768，P<0.001)； P-JNK/JNK比值升高(F=31.778，P<0.001)。與PLA組比較，PLA+ SP組Bcl-2/Bax比值升高(P<0.001)； Caspase-3表達(dá)下降(P<0.001)； P-JNK/JNK比值降低(P<0.001)。見圖3。

3 討論

圖2 流式細(xì)胞儀檢測SP600125抑制PLA誘導(dǎo) NCI-H292細(xì)胞凋亡

A：對照組；B：PLA組；C： SP組；D：PLA+SP組；與對照組比較：***P<0.001；與PLA組比較：###P<0.001

在支氣管哮喘發(fā)病過程中氣道上皮細(xì)胞易受到各種致炎因素攻擊而發(fā)生凋亡[5]，Bucchieri et al[6]發(fā)現(xiàn)吸煙可通過Caspase依賴途徑引起哮喘氣道上皮凋亡增多；Lin et al[7]研究證實(shí)來源于屋塵螨的吸入性變應(yīng)原Der p2誘導(dǎo)支氣管上皮BEAS-2B細(xì)胞株凋亡，本課題組前期研究[8]顯示PLA可誘導(dǎo)NCI-H292細(xì)胞凋亡，說明外界刺激可引起哮喘患者氣道上皮細(xì)胞調(diào)亡，氣道上皮細(xì)胞異常凋亡可能是導(dǎo)致哮喘發(fā)病及氣道重構(gòu)的重要機(jī)制。JNK通路是MAPK家族代表性成員之一，可被應(yīng)激刺激、細(xì)胞因子、氧化損傷等激活，是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)靶點(diǎn)，Lai et al[9]發(fā)現(xiàn)海洛因可通過激活JNK通路使原代培養(yǎng)的小腦顆粒細(xì)胞凋亡增多，使用JNK抑制劑SP600125，Caspase抑制劑z-VAD，或聯(lián)合使用SP600125和z-VAD后該凋亡作用受到明顯抑制。許多研究[10]證實(shí)JNK通路參與調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞、 心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞及癌細(xì)胞的凋亡，但JNK在氣道上皮細(xì)胞凋亡中作用的研究并不多見。本實(shí)驗(yàn)中，利用Western blot法檢測不同濃度PLA( 0、10、20、40、60 mg/L)作用及使用JNK抑制劑SP600125后NCI-H292細(xì)胞中JNK的磷酸化水平，結(jié)果顯示PLA誘導(dǎo)NCI-H292 細(xì)胞JNK磷酸化水平增加(P<0.001)，且呈濃度依賴性，SP600125抑制PLA 誘導(dǎo)JNK 磷酸化(P<0.001)，揭示PLA可能介導(dǎo)JNK信號通路引起氣道上皮NCI-H292細(xì)胞凋亡水平增加。

圖3 Western blot法檢測SP600125抑制PLA誘導(dǎo) NCI-H292細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、Bax、Caspase-3及P-JNK/JNK的表達(dá)

A：統(tǒng)計(jì)分析Bcl-2與Bax條帶灰度值比值；B：統(tǒng)計(jì)分析Caspase-3與β-actin條帶灰度值比值；C：統(tǒng)計(jì)分析P-JNK與JNK條帶灰度值比值；1:對照組；2: PLA 組；3: PLA+ SP組；4: SP組；與對照組比較：**P<0.01，***P<0.001；與PLA組比較：###P<0.001

Bcl-2是Bcl-2家族中抗凋亡的關(guān)鍵性蛋白，可通過抑制線粒體膜通透性減少由紫外線、自由基和生長因子缺乏等多種應(yīng)激作用引起的細(xì)胞凋亡，研究[11]顯示過敏性刺激后，支氣管肺泡灌洗液Bcl-2蛋白表達(dá)增多，而Bcl-2抑制劑ABT-737和ABT-199可減少激素不敏感型哮喘的氣道炎癥反應(yīng)，提示Bcl-2是哮喘氣道炎癥及氣道上皮凋亡的調(diào)控因子。與之作用相反，Bcl-2家族另一成員Bax則誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[12]，Bax可通過BH3結(jié)構(gòu)域與Bcl-2蛋白結(jié)合形成異二聚體，從而抑制 Bcl-2蛋白的抗凋亡作用。Caspase-3蛋白酶的激活是細(xì)胞凋亡過程中的核心步驟，在線粒體依賴的細(xì)胞凋亡途徑激活后，Caspase-3通過細(xì)胞色素C介導(dǎo)引起DNA的降解或分裂，還可經(jīng)Fas/FasL 介導(dǎo)的死亡受體細(xì)胞凋亡信號途徑降解Bcl-2蛋白，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Rouabhia et al[13]研究表明電子煙煙霧通過Caspase-3途徑誘導(dǎo)人牙齦上皮細(xì)胞凋亡。所以Bcl-2/Bax及Caspase-3均是反映細(xì)胞凋亡狀態(tài)的重要指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)中加入JNK抑制劑SP600125，PLA+SP組與PLA組相比Bcl-2/Bax升高，Caspase-3降低，說明PLA可能通過調(diào)控NCI-H292細(xì)胞內(nèi)Bcl-2/Bax及Caspase-3水平誘導(dǎo)NCI-H292細(xì)胞胞凋亡。

[1] Weitnauer M, Mijoek V, Dalpke A H. Control of local immunity by airway epithelial cells[J]. Mucosal Immunol, 2016, 9(2): 287-98.

[2] Whitsett J A, Alenghat T. Respiratory epithelial cells orchestrate pulmonary innate immunity[J]. Nat Immunol, 2015, 16: 27e35.

[3] 陸兆雙, 范曉云, 陳 冰, 等. 多聚左旋精氨酸通過p38/MAPK信號通路誘導(dǎo)NCI-H292細(xì)胞分泌IL-6、IL-8[J]. 安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 49(12): 1693-6.

[4] 張玲玲，范曉云，吳莎莎, 等. 多聚左旋精氨酸誘導(dǎo)NCI-H292細(xì)胞凋亡及其可能機(jī)制的分析[J]. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2016,32(10):1135-9.

[5] Gon Y, Hashimoto S. Role of airway epithelial barrier dysfunction in pathogenesis of asthma[J]. Allergol Int, 2018, 67(1):12-7.

[6] Bucchieri F, Marino Gammazza A, Pitruzzella A, et al. Cigarette smoke causes caspase independent apoptosis of bronchial epithelial cells from asthmatic donors[J]. PLoS One, 2015,10(3): e0120510.

[7] Lin C H, Hong Y C, Kao S H. Aeroallergen Der p 2 induces apoptosis of bronchial epithelial BEAS-2B cellsviaactivation of both intrinsic and extrinsic pathway[J]. Cell Biosci, 2015, 5:71.

[8] Fan X Y, Chen B, Lu Z S, et al. Poly-L-arginine acts synergistically with LPS to promote the release of IL-6 and IL-8viap38/ERK signaling pathways in NCI-H292 cells[J]. Inflammation, 2016, 39(1): 47-53.

[9] Lai B, Pu H, Cao Q, et al. Activation of caspase-3 and c-Jun NH2-terminal kinase signaling pathways involving heroin-induced neuronal apoptosis[J]. Neurosci Lett, 2011, 502(3): 209-13.

[10] 熊方圓, 唐松濤, 蘇 歡, 等. 褪黑素對糖尿病大鼠心肌細(xì)胞凋亡及MAPK通路的影響[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2017, 52 (5): 634- 8.

[11] Tian B P, Xia L X, Bao Z Q, et al. Bcl-2 inhibitors reduce steroid-insensitive airway inflammation[J]. J Allergy Clin Immunol, 2017, 140(2): 418-30.

[12] Tsai C J, Liu S, Hung C L,et al. BAX-induced apoptosis can be initiated through a conformational selection mechanism[J]. Structure, 2015, 23(1): 139-48.

[13] Rouabhia M, Park H J, Semlali A, et al. E-cigarette vapor induces an apoptotic response in human gingival epithelial cells through the Caspase-3 pathway[J]. J Cell Physiol, 2017, 232(6): 1539-47.