徐悅?cè)?鄒宛樺 秦文 王麗穎 劉佳 金作林

人牙周膜間充質(zhì)干細(xì)胞(human periodontal mesenchymal stem cells，hPDLSCs)是一種特異來源于人牙周組織的間充質(zhì)干細(xì)胞，是修復(fù)牙周缺損的細(xì)胞來源［1］。但是，炎癥微環(huán)境下的 hPDLSCs(periodontal mesenchymal stem cells from periodontitis patients，PPDLSCs)的成骨分化能力明顯下降［2－3］。探索影響PPDLSCs成骨分化的因素，提高其成骨分化潛能，成為研究的方向。近年發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA(long noncoding RNAs)可能參與骨形成調(diào)控［4］。

實(shí)驗(yàn)組前期研究采用Arraystar人類LncRNA芯片(v3.0)成功的篩選出了健康微環(huán)境來源的牙周膜間充質(zhì)干細(xì)胞(periodontal mesenchymal stem cells from healthy microenvironment，HPDLSCs)與 PPDLSCs中差異表達(dá)的lncRNA［5］。本實(shí)驗(yàn)選取位于第7號(hào)染色體19159555～19161539，長度為 692 bp的 lncRNA7460為研究對(duì)象。在細(xì)胞水平觀察其調(diào)控能力，為改善PPDLSCs成骨分化能力，發(fā)展牙周再生治療探尋新的方向。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

1.1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑 胎牛血清、α-MEM 培養(yǎng)基(Gibco，美國);0.25%胰蛋白酶、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、地塞米松、I型膠原酶、茜素紅、Polybrene(Sigma，美國);Trizol Reagent Life(Technologies，美國);RNase A(Invitrogen，美國);PrimeScriptTMRT Master Mix(TAKARA No.RR036A，美國);SYBR(TAKARA No.RR820A，美國);引物(上海銳博公司);lncRNA-7460過表達(dá)、抑制慢病毒、Enhanced Infection Solution(上海吉?jiǎng)P基因公司);堿性磷酸酶測(cè)試劑盒(南京建成生物有限公司);堿性磷酸酶染色試劑盒(碧云天)。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器 YJ-875型超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠);二氧化碳恒溫孵箱(Forma，美國);倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)、倒置熒光顯微鏡(Olympus，日本);離心機(jī)(Kubota2l00，日本);紫外線分光光度儀(Eppendorf，德國);Real-time PCR(Applied Biosystems，美國)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 選取 HPDLSCs、PPDLSCs樣本，原代培養(yǎng) 自10位31～41歲的健康志愿者取得HPDLSCs的牙齒樣本，PPDLSCs牙齒樣本取自28～40歲的10位慢性牙周炎志愿者，牙槽骨吸收大于根長1/2。離心收集根中1/3牙周膜組織塊，I型膠原酶37℃消化1 h。含10%胎牛血清的α-MEM于37℃、5%CO2條件孵箱培養(yǎng)。原代細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞融合達(dá)80%時(shí)，低密度傳代。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng) 據(jù)Trizol試劑說明抽提細(xì)胞總RNA，控制RNA濃度在300～500 ng/μl，A260/A280為1.8 ～2.0。據(jù)試劑說明書反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，進(jìn)行qPCR檢測(cè)。qPCR反應(yīng)條件:預(yù)變性:95℃，30 s，1 Cycle;PCR反應(yīng):95℃ 5 s，60℃ 20 s，40 Cycles;融解曲線分析:95℃ 0 s，65℃ 15 s，95℃ 0 s。實(shí)驗(yàn)所用引物序列如表1所示。

1.2.3 lncRNA-7460過表達(dá)、抑制慢病毒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞lncRNA-7460過表達(dá)、抑制慢病毒委托上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建，根據(jù)轉(zhuǎn)染說明行PPDLSCs轉(zhuǎn)染。3 d后倒置熒光顯微鏡觀察，提取細(xì)胞RNA，RT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果及成骨基因表達(dá)情況。行成骨誘導(dǎo)，7 d后分別行RT-PCR驗(yàn)證成骨基因表達(dá)情況、ALP染色及活性檢測(cè)。成骨誘導(dǎo)21 d行茜素紅染色及定量測(cè)定。

1.2.4 成骨分化試驗(yàn)及茜素紅染色 成骨培養(yǎng)液:含10%胎牛血清α-MEM培養(yǎng)基，加 β-甘油磷酸鈉10 mmol/L、抗壞血酸 50 g/ml、地塞米松 1 × 10 mol/L。PPDLSCs成骨培養(yǎng)第1、7、14、21天提取細(xì)胞總RNA，21 d開始茜素紅染色;茜素紅染液:1 g茜素紅溶于100 ml蒸餾水。成骨誘導(dǎo)21 d PPDLSCs，多聚甲醛(4%)于室溫固定，茜素紅染液染色20 min。觀察并定量分析;茜素紅定量:六孔板每孔加入1.0 ml SDS。30 min后，吸取0.10 ml于520 nm分析吸光度。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequences

1.2.5 ALP染色以及 ALP活性測(cè)定 多聚甲醛(4%)于室溫固定成骨誘導(dǎo)7 d的PPDLSCs，ALP染液染色，37℃，5%CO2，30 min避光孵育后觀察;成骨誘導(dǎo)7 d的PPDLSCs破碎，與ALP活性測(cè)定工作液一起加入96孔板，37℃，5%CO2孵育30 min，加顯色液。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀520 nm檢測(cè)樣品吸光度，記錄數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)均以珋x±s表示，用SPSS 13.0軟件(SPSS，Inc.，Chicago，IL，USA)進(jìn)行處理。單向方差分析法分析數(shù)據(jù)，P＜0.05表示統(tǒng)計(jì)學(xué)上存在顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 確定 lncRNA-7460為 PPDLSCs成骨分化相關(guān)lncRNA

據(jù)本研究組前期基因芯片結(jié)果，選6個(gè)PPDLSCs中表達(dá)明顯下調(diào)的lncRNA為篩選目標(biāo)。qPCR檢測(cè)成骨培養(yǎng)7 d后各lncRNA表達(dá)變化(圖1)，發(fā)現(xiàn)lncRNA-7460上調(diào)10倍以上，將其作為研究目標(biāo)。

圖1 PPDLSCs成骨誘導(dǎo)7 d lncRNAs的變化Fig 1 lncRNA expression of PPDLSCs after osteogenic differentiation for 7 d

2.2 lncRNA-7460在PPDLSCs成骨分化不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)觀察PPDLSCs成骨誘導(dǎo)1～21 d的表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)lncRNA-7460的表達(dá)在成骨誘導(dǎo)后的1、7 d不斷升高，14、21 d的表達(dá)量雖下降，但仍高于成骨前(圖 2)。

圖2 PPDLSCs成骨誘導(dǎo)過程中l(wèi)ncRNA-7460的表達(dá)變化Fig 2 The expression of lncRNA-7460 at different time of osteogenic induction in PPDLSCs

2.3 lncRNA-7460過表達(dá)慢病毒感染PPDLSCs

轉(zhuǎn)染3 d后，熒光顯微鏡可觀察到PPDLSCs中綠色熒光染色(圖 3A)。qPCR顯示 PPDLSCs感染 lncRNA-7460過表達(dá)慢病毒后，lncRNA-7460的表達(dá)相對(duì)空病毒轉(zhuǎn)染組升高達(dá)10.08倍(圖3B)。

2.4 lncRNA-7460下調(diào)慢病毒可以成功轉(zhuǎn)染 PPDLSCs

為篩選高效lncRNA-7460下調(diào)慢病毒，構(gòu)建了3個(gè)lncRNA-7460下調(diào)慢病毒，分別是58380-1、58381-1、58382-1。轉(zhuǎn)染 3 d后(圖 4A)qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，58382-1抑制效率最高(圖4B)，用于后續(xù)試驗(yàn)。

A:熒光顯微鏡觀察(×200);B:量化分析圖3 lncRNA-7460過表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染效率A:Fluorescence microscope observation(×200);B:Quantitative analysisFig 3 The infection efficiency of lncRNA-7460-overexpressing lentiviral into PPDLSCs

2.5 lncRNA-7460可以在體外培養(yǎng)條件下，促進(jìn)PPDLSCs的成骨分化

PPDLSCs轉(zhuǎn)染lncRNA-7460過表達(dá)慢病毒后，成骨培養(yǎng)7 d，qPCR檢測(cè)成骨相關(guān)基因表達(dá)情況。3個(gè)標(biāo)志基因Runx2，ALP，OCN的mRNA均明顯升高(圖5A)。ALP染色和ALP活性檢測(cè)證明過表達(dá)組的ALP含量高于對(duì)照組(圖5C、5D)。成骨誘導(dǎo)21 d后，過表達(dá)組形成更多的鈣結(jié)節(jié)(圖5C、5E)。

相反，lncRNA-7460下調(diào)組PPDLSCs的成骨相關(guān)基因下調(diào)(圖5B);ALP表達(dá)量和鈣結(jié)節(jié)的形成量也明顯下降(圖5C～5E)。

3 討論

牙周炎是由細(xì)菌引起的牙周組織慢性感染性疾病，是導(dǎo)致成年人牙齒喪失的主要原因［6］。修復(fù)重建已被破壞的牙周組織的牙周再生治療依賴干細(xì)胞，生長因子以及細(xì)胞外基質(zhì)支架［7］。

hPDLSCs是一種來源于牙周膜組織的間充質(zhì)干細(xì)胞，特定培養(yǎng)條件下可向骨組織、脂肪組織、軟骨組織、神經(jīng)組織等分化［1］，是再生牙周缺損最具潛力的種子細(xì)胞。但是，牙周炎癥條件引起hPDLSCs的成骨分化能力下降，是牙周再生困難的重要原因［8］。Liu等［2］首次發(fā)現(xiàn)，從慢性牙周炎癥組織中分離培養(yǎng)的PPDLSCs增殖能力增強(qiáng)，而成骨分化能力減弱。

A:熒光顯微鏡觀察(×200);B:量化分析圖4 lncRNA-7460抑制慢病毒轉(zhuǎn)染效率A:Fluorescence microscope observation(×200);B:Quatitative analysisFig 4 The efficiency of lncRNA-7460-knockdown lentivirus into PPDLSCs

A、B:qPCR檢測(cè)成骨相關(guān)基因;C:茜素紅、ALP染色檢測(cè)細(xì)胞成骨分化能力;D:ALP活性測(cè)定;E:茜素紅定量圖5 lncRNA-7460對(duì)PPDLSCs成骨分化的調(diào)節(jié)作用。A:Expression of osteogenic differentiation related mRNAs in PPDLSCs infected by lncRNA-7460-overexpressing lentivirus;B:Expression of osteogenic differentiation related mRNAs in PPDLSCs infected by lncRNA-7460-downregulating lentivirus;C:Osteogenic differentiation determined by Alizarin Red Sand ALPstaining;D:ALPactivity;E:Quantitative analysis of Alizarin red stainingFig 5 lncRNA-7460 promotes osteogenic differentiation of PPDLSCs

lncRNA在廣泛的生物途徑和細(xì)胞過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，包括染色體失活［9］和分化［10］，干細(xì)胞多能性重編程［11］和細(xì)胞凋亡［12］。同時(shí)還參與了包括神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、炎癥和癌癥等疾病的發(fā)生發(fā)展［13－14］。許多研究認(rèn)為lncRNA參與調(diào)控了干細(xì)胞成骨能力。Huang等［4］比較MSC成骨誘導(dǎo)分化前后的lncRNA，發(fā)現(xiàn) H19可以剪切產(chǎn)生 miR-675，通過H19/miR-675/TGF-β1/Smad3/HDAC通路促進(jìn) MSC成骨分化。還有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA-ANCR通過抑制經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路，抑制hPDLSCs成骨分化能力［15］。lncRNA-ANCR同樣可以在 MSC中結(jié)合EZH蛋白，抑制關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Runx2從而抑制成骨分化［16］。

本實(shí)驗(yàn)組前期研究應(yīng)用Arraystar人類lncRNA芯片(v3.0)，對(duì)PPDLSCs和 HPDLSCs中差異表達(dá)的lncRNA進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)共有89個(gè)lncRNA和387個(gè)mRNA 差異表達(dá)(Change Fold ＞2，P ＜0.05)［5］。

本研究首次發(fā)現(xiàn)lncRNA-7460參與調(diào)控PPDLSCs成骨分化。芯片結(jié)果顯示，lncRNA-7460在HPDLSCs、PPDLSCs中均有較高的基礎(chǔ)表達(dá)，且在PPDLSCs明顯下調(diào)。是否是lncRNA-7460減少導(dǎo)致了PPDLSCs成骨能力的下降?本實(shí)驗(yàn)利用qPCR檢測(cè)PPDLSCs成骨誘導(dǎo)前、成骨誘導(dǎo)1、7、14、21 d的 lncRNA-7460表達(dá)，發(fā)現(xiàn)成骨誘導(dǎo)后均發(fā)生了上調(diào);據(jù)此推測(cè)lncRNA-7460可能與PPDLSCs成骨誘導(dǎo)過程相關(guān)。

該研究實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)構(gòu)建了lncRNA-7460過表達(dá)和下調(diào)慢病毒，上調(diào)或下調(diào)lncRNA-7460的表達(dá)，并通過多種體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了對(duì)細(xì)胞成骨分化的影響。qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PPDLSCs在成骨誘導(dǎo)7 d后，成骨相關(guān)基因Runx2，ALP，OCN的mRNA表達(dá)量均較成骨誘導(dǎo)前有明顯升高。同時(shí)，lncRNA-7460上調(diào)組成骨相關(guān)基因表達(dá)水平較對(duì)照組上升更為明顯，而lncRNA-7460下調(diào)組的成骨相關(guān)mRNA升高不明顯。同樣，ALP染色、ALP活性測(cè)定以及茜素紅染色、定量等實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明，lncRNA-7460上調(diào)組成骨能力增強(qiáng)，而下調(diào)組成骨能力減弱。本研究證實(shí)，lncRNA-7460可在體外條件下促進(jìn)PPDLSCs的成骨分化過程，lncRNA-7460能否在體內(nèi)環(huán)境下調(diào)節(jié)成骨分化需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

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