鄧蓉， 謝麗芬， 成杏芳， 陳美艷， 陳偉堅， 聶曉莉，2

（1.南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，廣東廣州510515；2.南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院 中醫(yī)科，廣東廣州510515）

尿酸性腎?。╱ric acid nephropathy，UAN）是指由于尿酸鹽沉積于腎臟所引起的腎臟損傷.近年來隨著高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA）患病率逐年增高，UAN患病率也隨之升高［1］，然而目前國內(nèi)外尚無理想的治療藥物.褐藻多糖硫酸酯（fucoidan polysaccharide sulfate，F(xiàn)PS）是從海洋生物褐藻中提取的一種高度支鏈化的α-L-巖藻糖-4-硫酸酯聚合成的天然硫酸酯多糖，具有抗凝血、抗腫瘤、抗病毒、抗炎、抗氧化及免疫調(diào)節(jié)等作用［2］，在臨床治療慢性腎衰竭方面有較好的療效［3］，本課題組前期實驗表明FPS能改善單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎間質(zhì)纖維化［4］.但是 FPS防治UAN的研究仍然較少.因此，本研究采用氧嗪酸鉀和腺嘌呤聯(lián)合給藥建立UAN實驗大鼠模型，探討FPS對UAN大鼠腎保護的作用機制，為FPS防治UAN提供實驗依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑

褐藻多糖硫酸購自吉林輝南長龍生化藥業(yè)股份有限公司，別嘌呤醇、腺嘌呤、氧嗪酸鉀購自阿拉丁生化科技股份有限公司，TUNEL染色試劑盒購自Roche公司，大鼠活性氧（ROS）ELISA試劑盒購自北京拓英時代科技有限公司.

1.1.2 實驗動物

健康雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量（200±20）g，購于南方醫(yī)科大學實驗動物中心（動物許可證號：SYXK（粵）2011-0074），本研究通過南方醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會批準.

1.1.3 儀器

RS-20Ⅲ型低溫冷凍離心機購自日本TOMY SEIKO公司；貝克曼AU4802購自美國BECKMAN COULTER公司；透射電子顯微鏡購自日本HITACHI公司；正置光學顯微鏡、成像系統(tǒng)購自日本尼康公司；包埋機、凍臺、組織攤片機購自武漢俊杰電子有限公司；電鏡專用切片機購自武漢谷歌生物公司.

1.2 方法

1.2.1 UAN大鼠模型的制備、分組及給藥

大鼠適應性飼養(yǎng)7 d后隨機分為正常對照組、模型組、別嘌呤醇組、FPS低質(zhì)量分數(shù)組（每天給質(zhì)量分數(shù)50 mg/kg）、中質(zhì)量分數(shù)組（每天給質(zhì)量分數(shù)100 mg/kg）、高質(zhì)量分數(shù)組（每天給質(zhì)量分數(shù)200 mg/kg），每組10只，除正常對照組予以等體積蒸餾水外，其余4組均每天予以質(zhì)量分數(shù)100 mg/kg腺嘌呤和質(zhì)量分數(shù)250 mg/kg氧嗪酸鉀灌胃給藥，連續(xù)2周造模.別嘌呤醇組、FPS組大鼠在造模后同時分別每天給予別嘌呤醇（質(zhì)量分數(shù)5 mg/kg）、低中高質(zhì)量分數(shù) FPS灌胃，正常對照組和模型組大鼠同時予等量蒸餾水，連續(xù)給藥2周.

1.2.2 樣本采集

末次給藥后1 h，所有大鼠麻醉后腹腔靜脈采血，5 000×g離心10 min獲取血清樣本.在冰臺上迅速分離腎臟組織，于-80℃保存待測.

1.2.3 血清生化指標檢測

采用全自動生化分析儀檢測大鼠血尿酸（uric acid，UA）、血清肌酐 （serum creatinine，SCr）、血清尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）.

1.2.4 腎組織病理形態(tài)學觀察

經(jīng)體積分數(shù)為10%中性甲醛固定的腎組織常規(guī)脫水、透明、包埋，制成3μm切片，行蘇木素伊紅染色（haematoxylin-eosin stain，HE），光鏡下觀察腎臟病理改變情況.

1.2.5 腎小管上皮細胞透射電鏡觀察

經(jīng)體積分數(shù)為2.5%戊二醛溶液固定的腎臟組織用PBS沖洗3次，15 min/次，加入體積分數(shù)為1%餓酸處理直至樣品變黑后PBS沖洗3次，15min/次；4℃下，組織經(jīng)乙醇梯度脫水后于室溫中加入丙酮，作用3次，15 min/次，純丙酮+包埋液（體積比為2∶1）室溫包埋4 h后純丙酮+包埋液（體積比為2∶1）包埋24 h，之后用包埋液在37℃包埋3 h；37℃聚合過夜，45℃聚合12 h，60℃聚合48 h后切成60 nm切片，用體積分數(shù)為2%醋酸鈾、枸櫞酸鉛染色15 min，干燥后上機觀察.

1.2.6 TUNEL免疫組化染色觀察腎小管上皮細胞凋亡

經(jīng)體積分數(shù)為10%中性甲醛固定的腎組織常規(guī)脫水、透明、包埋，制成石蠟切片，按TUNEL說明書操作.光學顯微鏡下觀察每組腎小管上皮細胞凋亡情況，正常細胞核顯藍色，凋亡陽性細胞核呈棕黃色，應用Image-Pro Plus 6.0軟件（Media Cybernetics，Inc.，Rockville，MD，USA）分析圖片，計算每200倍放大視野凋亡陽性細胞數(shù)目與細胞總數(shù)的百分比（陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%）即為凋亡率（%）.

1.2.7 酶聯(lián)免疫法（ELISA）測定腎臟組織中ROS水平

腎臟組織質(zhì)量0.5 g置PBS中勻漿，在水浴中用勻漿器制備質(zhì)量比為1∶10的勻漿，4℃下12 000×g離心15 min，取上清液，按照試劑盒方法測定ROS的量.

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料以（均數(shù)±標準誤差）（±s）表示，均數(shù)比較采用t檢驗，多組間的比較用單因素方差分析，P＜0.05為有統(tǒng)計學差異.

2 結(jié)果

2.1 FPS對大鼠一般狀況及血尿酸、腎功能指標影響

實驗過程中模型組死亡大鼠4只，F(xiàn)PS低質(zhì)量分數(shù)組死亡2只，別嘌呤醇組、FPS中質(zhì)量分數(shù)組各死亡1只，正常對照組、FPS高質(zhì)量分數(shù)組無死亡（圖1）.與正常對照組相比，模型組大鼠精神萎靡，反應能力下降，飲水量和尿量增加，毛色欠光澤，檢測血清UA、BUN、SCr水平顯著升高（P＜0.01），表明UAN實驗大鼠模型造模成功.別嘌呤醇組和FPS中、高質(zhì)量分數(shù)組大鼠一般狀況較模型組顯著改善，且大鼠血清尿酸、尿素氮和肌酐水平較模型組均顯著降低（P＜0.01）.結(jié)果表明質(zhì)量分數(shù)為100 mg/kg的腺嘌呤和250 mg/kg的氧嗪酸鉀連續(xù)灌胃2周可建立UAN大鼠模型，F(xiàn)PS能降低UAN大鼠血清UA水平、改善腎功能損傷（表1）.

表1 FPS對UAN大鼠血尿酸、腎功能指標的的影響Table 1 Effect of FPS on SUA and renal function indexes in rats with UAN（±s）

表1 FPS對UAN大鼠血尿酸、腎功能指標的的影響Table 1 Effect of FPS on SUA and renal function indexes in rats with UAN（±s）

與模型組比較：1）P＜0.01；與正常對照組比較：2）P＜0.01，3）P＜0.05.

正常對照組 10 - 102.5±30.41） 4.0±1.01） 20.0±2.11）模型組 6 - 632.2±83.92） 8.6±2.12） 82.1±5.52）別嘌呤醇組 9 5 108.7±31.71） 4.4±2.51） 25.4±1.91）FPS低質(zhì)量分數(shù)組 8 100 130.4±28.31），3） 5.1±2.31） 27.6±3.51）FPS中質(zhì)量分數(shù)組 9 200 110.3±29.31） 4.7±1.71） 22.3±2.11）FPS高質(zhì)量分數(shù)組 10 300 103.3±17.91） 4.1±1.31） 20.1±1.61）

2.2 FPS對UAN大鼠腎臟外觀及組織病理學影響

肉眼觀察可見，模型組大鼠腎臟體積增大，顏色蒼白，表面顆粒狀較多，與模型組相比，F(xiàn)PS中、高質(zhì)量分數(shù)組及別嘌呤醇組腎臟體積略小，表面顆粒減少，而FPS低質(zhì)量分數(shù)組與模型組相似.HE染色組織病理學可見，模型組腎小管內(nèi)皮細胞萎縮，管腔擴大，腎小管內(nèi)大量黃褐色尿酸鹽結(jié)晶沉積，腎小管間質(zhì)較多炎性細胞浸潤，腎間質(zhì)纖維增生樣改變.與模型組相比，F(xiàn)PS中、高質(zhì)量分數(shù)組及別嘌呤醇組炎性細胞浸潤、腎小管萎縮及腎間質(zhì)纖維化有不同程度減輕，而FPS低質(zhì)量分數(shù)組改善不明顯.結(jié)果表明UAN大鼠主要表現(xiàn)為腎小管損傷，F(xiàn)PS可以顯著改善腎小管損傷（圖2，圖3）.

圖2 各組大鼠腎臟外觀觀察（×20）Fig.2 Appearance observation on kidney of rats in each group（×20）

2.3 FPS對腎小管上皮細胞凋亡的影響

與正常對照組比較，模型組腎小管上皮細胞凋亡明顯（P＜0.01）.與模型組比較，F(xiàn)PS低、中、高質(zhì)量分數(shù)組和別嘌呤醇組腎小管上皮細胞凋亡均有顯著減少（P＜0.01，P＜0.05，圖4、表 2）.結(jié)果表明腎小管上皮細胞凋亡是UAN大鼠腎臟損傷重要的病理機制，F(xiàn)PS可顯著抑制UAN大鼠腎小管上皮細胞凋亡.

圖4 FPS對UAN大鼠腎小管上皮細胞凋亡的影響（×20）Fig.4 Effect of FPS on apoptosis of renal tubular cells in rats with UAN（×20）

表2 FPS對UAN大鼠腎小管上皮細胞凋亡的的影響Table 2 Effect of FPS on apoptotic indexes of renal tubular cells in rats with UAN（±s）

表2 FPS對UAN大鼠腎小管上皮細胞凋亡的的影響Table 2 Effect of FPS on apoptotic indexes of renal tubular cells in rats with UAN（±s）

與模型組比較：1）P＜0.01；與正常對照組比較：2）P＜0.01，3）P＜0.05.

正常對照組 10 - 1.3±0.21）模型組 6 - 7.8±0.32）別嘌呤醇組 9 5 3.5±0.41），3）FPS低質(zhì)量分數(shù)組 8 100 3.1±0.31），3）FPS中質(zhì)量分數(shù)組 9 200 2.5±0.41）FPS高質(zhì)量分數(shù)組 10 300 1.4±0.31）

2.4 FPS對UAN大鼠腎小管上皮細胞微結(jié)構(gòu)的影響

電鏡觀察可見，模型組腎小管上皮細胞膜結(jié)構(gòu)不清，微絨毛排列紊亂，線粒體腫脹，基底部可見大量溶酶體和自噬體形成.與模型組相比，F(xiàn)PS各治療組腎小管上皮細胞微結(jié)構(gòu)損害均有不同程度恢復（圖5）.結(jié)果表明HUA可誘導UAN大鼠腎小管上皮細胞線粒體損傷、細胞過度自噬，而FPS顯著改善腎小管上皮細胞線粒體損傷及細胞過度自噬.

圖5 各組大鼠腎小管上皮細胞電鏡觀察（×20 000）Fig.5 Electron Microscope observation on renal tubular epithelial cells of rats in each group（×20 000）

2.5 FPS對腎臟組織ROS水平影響

與正常對照組比較，模型組大鼠腎組織ROS水平顯著升高（P＜0.01），而 FPS低、中、高質(zhì)量分數(shù)組和別嘌呤醇組ROS較模型組均顯著降低（P＜0.01）.結(jié)果表明FPS可顯著降低腎臟組織中ROS水平（表3）.

表3 FPS對UAN大鼠腎臟組織ROS的影響Table 3 Effect of FPS on ROS of kidney tissues in rats with UAN（±s）

表3 FPS對UAN大鼠腎臟組織ROS的影響Table 3 Effect of FPS on ROS of kidney tissues in rats with UAN（±s）

與模型組比較：1）P＜0.01；與正常對照組比較：2）P＜0.01.

正常對照組 10 - 10.2±1.41）模型組 6 - 13.1±2.82）別嘌呤醇組 9 5 11.1±1.31）FPS低質(zhì)量分數(shù)組 8 100 11.0±1.41）FPS中質(zhì)量分數(shù)組 9 200 10.8±1.21）FPS高質(zhì)量分數(shù)組 10 300 10.1±1.31）

3 討論

HUA是由于人體內(nèi)嘌呤生成代謝紊亂所致機體內(nèi)血尿酸生成過多的一種代謝性疾病.流行病學調(diào)查顯示，血尿酸水平是慢性腎臟病、心血管疾病、高血壓及代謝綜合征等疾病進展的獨立危險因素［5］.目前臨床上用于治療HUA的藥物如別嘌醇、苯溴馬隆等藥物具有明確的降尿酸作用，但常出現(xiàn)藥物過敏、肝腎損害等副作用［6］，而新型降尿酸藥物由于價格昂貴、缺乏足夠的試驗數(shù)據(jù)，其療效和安全性需要進一步完善，所以并沒有在臨床上廣泛使用［7］.因此，探尋更為安全有效的降尿酸藥物具有重大的臨床及社會意義.

研究表明褐藻多糖硫酸酯具有廣泛的生物學活性，如抗凝血、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、降血脂等，而且各種活性之間相互關(guān)聯(lián)，可通過多途徑、多靶點發(fā)揮腎臟保護作用［8］.Wu等［9］發(fā)現(xiàn) FPS可通過促進腎組織中表面有機陽離子轉(zhuǎn)運蛋白-2表達，上調(diào)蛋白激酶表達，抑制腎臟細胞凋亡，明顯減輕經(jīng)腺嘌呤誘導的 UAN，減輕腎損傷.Wang［10］研究發(fā)現(xiàn)FPS具有抗氧化作用，通過提高抗氧化酶活性，可抑制細胞脂質(zhì)過氧化，并有效緩解腺嘌呤誘導的腎小管間質(zhì)及腎小球系膜區(qū)域的病理損害.Josephine等［11］研究發(fā)現(xiàn)FPS能抑制細胞中ROS生成，降低氧化應激反應，減輕細胞內(nèi)線粒體損傷，緩解環(huán)孢霉素A誘導的腎小管損傷.本實驗采用氧嗪酸鉀聯(lián)合腺嘌呤誘導建立UAN大鼠模型，并用不同濃度的FPS進行干預，結(jié)果表明FPS具有確切有效地降低UAN大鼠血尿酸水平、改善腎功能的作用.

細胞凋亡是細胞在生理或病理狀態(tài)下發(fā)生的一種自發(fā)性、程序性死亡的過程，與細胞增殖共同維持正常的生命活動，兩者調(diào)節(jié)失控可引起多種疾病發(fā)生［12］.腎臟損傷時由內(nèi)源或浸潤細胞線粒體損傷會產(chǎn)生過量ROS可導致生物膜和大分子物質(zhì)發(fā)生脂質(zhì)過氧化損傷，引起組織病變及多器官功能的損傷［13］.研究表明，HUA大鼠多種組織細胞均有氧化應激加強，線粒體功能障礙，ATP水平降低［14-15］，而高尿酸體外培養(yǎng)腎小管上皮細胞可上調(diào)NADPH氧化酶 NOX4蛋白表達，促進ROS生成，誘導細腎小管細胞凋亡［16］，并且ROS的增加可能是誘導Parkin/PINK1依賴性線粒體自噬的重要因素［17］.UAN腎臟損傷的主要病理基礎是腎小管上皮細胞損傷，本研究中腎臟組織免疫組化、電鏡觀察及ELISA檢測ROS含量等結(jié)果進一步提示，UAN大鼠腎小管上皮細胞線粒體損傷導致細胞中ROS生成過多，大量ROS可誘導UAN大鼠腎小管上皮細胞發(fā)生程序性凋亡、自噬相關(guān)性死亡等病理變化，而FPS可顯著減輕UAN腎小管上皮細胞線粒體損傷、減少細胞過度自噬、抑制腎小管上皮細胞凋亡，這提示FPS改善UAN腎損傷的作用機制與調(diào)控細胞凋亡及自噬過度相關(guān).

綜上所述，UAN的發(fā)生發(fā)展與HUA損傷腎小管上皮細胞線粒體，產(chǎn)生大量ROS誘導細胞凋亡及自噬性死亡相關(guān)，而FPS可通過降低ROS水平、減輕細胞線粒體損傷、抗腎小管上皮細胞凋亡等作用，從而有效減輕UAN腎小管上皮細胞損害，本研究為FPS防治UAN提供了基礎藥理學依據(jù)，下一步將在FPS防治UAN的分子機制進行深入研究.

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