晏濤， 郜玉忠

（錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨關(guān)節(jié)病區(qū)，遼寧錦州121001）

非創(chuàng)傷性股骨頭壞死（non-traumatic osteonecrosis of femoral head，NOFH）是一種進行性病理過程，由于股骨頭供血受阻、局部循環(huán)中斷和軟骨下骨供血受損導(dǎo)致骨壞死和塌陷，最終致髖關(guān)節(jié)功能受損和永久性殘疾［1-2］；早期癥狀不明顯，患者總是錯過最佳的治療時機［3］.此外，Weinstein［4］認(rèn)為股骨頭壞死不能逆轉(zhuǎn)，早期診斷和治療干預(yù)非常重要.非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的病因和發(fā)病機制尚不清楚，缺乏預(yù)防和早期診斷治療股骨頭壞死的有效方法.

股骨頭壞死病因?qū)W機制假說眾多，脂類代謝紊亂、凝血循環(huán)障礙、髓內(nèi)高壓、細(xì)胞功能障礙學(xué)說等，有研究表明，基因多態(tài)性與股骨頭壞死有關(guān)，Lin等［5］最新研究發(fā)現(xiàn)與免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)相關(guān)的Fcer1A和Il7R基因和與肌肉系統(tǒng)過程相關(guān)的Tnn2、Mylpf和Myl1基因可能與類固醇誘導(dǎo)的股骨頭壞死機制相關(guān).甲狀旁腺激素受體1（parathyroid hormone receptor 1，PTHR1）可能通過與維生素D受體（vitam in D receptor，VDR）相互作用而參與糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的股骨頭缺血壞死［6］.信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1（signal transducers and activators of transcription1，STAT1）-蛋白酶 3途徑在類固醇誘發(fā)的股骨頭壞死病程中通過上調(diào)蛋白酶3的表達和STAT1的激活發(fā)揮關(guān)鍵作用，并促使股骨頭壞死［7］.

本研究根據(jù)Liu等［8］公開發(fā)表的基因表達譜數(shù)據(jù)進行非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的生物信息學(xué)分析.篩選非創(chuàng)傷性股骨頭壞死和健康對照組織之間的差異表達基因，并對基因功能、信號通路及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)進行分析，可能有助了解非創(chuàng)傷性股骨頭壞死發(fā)病的分子機制及生物學(xué)信息.

1 材料與方法

1.1 材料

非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的基因芯片數(shù)據(jù)GSE74089（Liu等，2016）從公共數(shù)據(jù)庫GEO下載（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）.以 necrosis of femoral head為數(shù)據(jù)檢索關(guān)鍵詞，研究類型為Expression profiling by array，限制種屬為 Homo sapiens，是1個基于Agilent-026652全基因組微陣列4x44K v2的芯片平臺：GPL13497.此芯片共包含有8例股骨頭髖關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本.

1.2 數(shù)據(jù)的提取、處理及差異基因分析

基因表達譜的原始數(shù)據(jù)集利用Perl（practical extraction and report language）工具優(yōu)先基因ID轉(zhuǎn)換后，提取基因矩陣相關(guān)數(shù)據(jù).將整理后的數(shù)據(jù)用R語 言 的 limma包 （http：//bioconductor.org/biocLite.R）分析，嚴(yán)格按照RMA算法對原始數(shù)據(jù)進行背景校正、標(biāo)準(zhǔn)化及表達值計算，最終篩選出股骨頭壞死組與健康對照組之間差異表達基因，并繪制火山圖.差異表達基因需同時滿足以下篩選條件：（1）采用t檢驗，定義校正后P＜0.05；表示差異倍數(shù)（fold change）.

1.3 差異表達基因的富集分析

DAVID（database for annotation，visualization and integrated discovery）是在線生物信息學(xué)分析工具（https：//david.ncifcrf.gov/），擁有一系列功能注釋工具，可為大規(guī)模的基因進行生物功能富集分析.通過上傳差異表達基因進行基因本體論（gene ontology，GO）功能注釋分析.用 R語言的GOplot包進行差異基因功能可視化繪圖.設(shè)定P＜0.05和FDR＜0.05為顯著性基因富集的臨界值.用R語言的RSQLite、cluster Profiler包進行KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路的富集分析.應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)檢驗，設(shè)置條件：P＜0.005，找出與整個基因組背景相比，在差異表達基因中顯著性富集的通路.

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

STRING（search tool for the retrieval of interacting genes/proteins，https：//string-db.org/）數(shù)據(jù)庫是利用已知或預(yù)測的蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)組成的網(wǎng)絡(luò)資源，包括直接和間接的蛋白質(zhì)相互作用.通過STRING對壞死股骨頭軟骨差異表達基因進行蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)分析，核心蛋白是PPI網(wǎng)絡(luò)中蛋白質(zhì)作用的重要節(jié)點，為少數(shù)具有許多相互作用的中樞蛋白.設(shè)置條件：combined score＞0.9.用Cytoscape軟件可視化PPI網(wǎng)絡(luò)圖.將互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)用R語言barplot包繪圖，顯示前20個互作網(wǎng)絡(luò)中突出的中心節(jié)點蛋白并進一步GO功能富集分析.

2 結(jié)果

2.1 差異表達基因篩選結(jié)果

依據(jù)差異表達基因篩選條件，與健康對照組對比，股骨頭壞死組共獲得1 315個差異表達基因，其中上調(diào)基因809個，下調(diào)基因506個（圖1）.數(shù)據(jù)結(jié)果表明，用差異表達基因可以將股骨頭壞死組從健康對照組中區(qū)分開來.

2.2 差異表達基因GO分析結(jié)果

通過GO功能富集分析，809個上調(diào)基因中有14個基因富集呈顯著性（P＜0.05，F(xiàn)DR＜0.05），506個下調(diào)基因中有12個基因富集呈顯著性（P＜0.05，F(xiàn)DR＜0.05）.結(jié)果顯示，上調(diào)的差異表達基因主要涉及細(xì)胞外基質(zhì)、膠原纖維組織、蛋白質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)、膠原蛋白三聚體、膠原分解代謝過程、細(xì)胞外基質(zhì)組織、胞外空間、泛素-蛋白轉(zhuǎn)移酶活性（FBXW7、HACE1）、蛋白結(jié)合（FBXW7、HACE1）等功能類別；下調(diào)的差異表達基因主要涉及通過 MHCⅡ類抗原加工和呈遞肽或多糖抗原、MHCⅡ類蛋白復(fù)合物、MHCⅡ類受體活性、免疫球蛋白產(chǎn)生涉及免疫球蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜腔側(cè)的組成、干擾素-γ介導(dǎo)的信號通路、抗原加工和表現(xiàn)、通過MHCⅡ類抗原處理和呈遞外源肽抗原等功能類別（表 1）.采用DAVID進一步對股骨頭壞死樣本的全部1315個差異基因行GO功能富集分析顯示，6個GO功能富集顯著相關(guān)，主要涉及蛋白質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)（proteinaceous extracellular matrix）、胞外空間（extracellular space）、細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix）、膠原蛋白三聚體（collagen trimer）、細(xì)胞外基質(zhì)組織（extracellular matrix organization）、膠原纖維組織（collagen fibril organization）.從6類GO功能富集中選取顯著表達的40個差異基因，用R語言GOplot包繪制基因聚類分布情況（圖2）.

圖1 差異表達基因火山圖Fig.1 Volcano plot of differentially expressed genes

表1 上、下調(diào)差異表達基因前12個GO功能分析結(jié)果Table 1 The top 12 enriched GO terms of the UP-and down-regulated differentially expressed genes

BP（biological process，生物學(xué)過程）；CC（cellular component，細(xì)胞組分）；MP（molecular function，分子功能）；GO（gene ontology，基因本體論）.

圖2 差異表達基因的前6個GO功能富集和弦圖（top40）Fig.2 The top 6 enriched GO terms of the 40 differentially distinctly expressed genes are enriched in the chord plot

2.3 差異表達基因KEGG通路富集分析

為了解差異基因參與的代謝通路及具體的生物學(xué)功能，進行KEGG通路分析.結(jié)果顯示上調(diào)差異表達基因主要富集了黏著斑（VEGFC）、蛋白質(zhì)消化吸收、松弛素信號通路、糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號通路、PI3K-Akt信號通路、Hippo信號通路、凋亡信號通路（如SGK1）、癌癥途徑、Hedgehog信號通路、轉(zhuǎn)化生長因子β信號通路等；而下調(diào)的差異表達基因主要富集途徑如抗原加工和表現(xiàn)（HLA-DRB4）、同種異體移植排斥反應(yīng)、移植物抗宿主病、造血細(xì)胞譜系、細(xì)胞粘附分子（CAMs）、HLA-DRB4、Th1/Th2細(xì)胞分化、Th17細(xì)胞分化、補體和凝血級聯(lián)反應(yīng)等（表2）.

表2 差異表達基因的KEGG通路分析Table 2 KEGG pathway analysis of differentially expressed genes

2.4 差異表達基因PPI分析

為闡釋涉及股骨頭壞死差異基因分子機制，通過STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，用cytoscape軟件繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖.PPI網(wǎng)絡(luò)由391個節(jié)點和1 213個交互組成（圖3）.紅色、綠色節(jié)點分別表示股骨頭壞死樣本相較于健康對照組高、低表達的基因.蛋白互作網(wǎng)絡(luò)交互密集的20個中心節(jié)點蛋白依次為：GNB5、GNG12、GNG13、GNG8、BTRC、ADCY7、BDKRB1、SAA1、UBE2N、SOCS3、UBE2B、DET1、FBXL4、FBXO32、FBXW7、GCGR、HACE1、HERC1、KBTBD13、KLHL2（圖4）.根據(jù)GO富集分析，這些差異表達基因主要參與蛋白質(zhì)泛素化（HACE1、FBXW7），異三聚體G蛋白復(fù)合物（GNG8）和泛素-蛋白轉(zhuǎn)移酶活性（HACE1、FBXW7）（表3）.

圖3 上、下調(diào)差異基因構(gòu)建的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Protein-protein interaction network constructed with the up-and down-regulated differentially expressed genes

3 討論

隨著新一代高通量基因芯片技術(shù)的發(fā)展，生物信息學(xué)正在改變?nèi)藗冄芯可镝t(yī)學(xué)的傳統(tǒng)方式，高通量測序技術(shù)以及數(shù)據(jù)分析技術(shù)已成為探索生物學(xué)底層機制和研究人類復(fù)雜疾病診斷、治療及預(yù)后的重要工具.本研究主要通過生物信息學(xué)技術(shù)對GEO數(shù)據(jù)庫下載的非創(chuàng)傷性股骨頭壞死基因芯片（GSE74089）進行數(shù)據(jù)分析，并使用R語言包挖掘數(shù)據(jù)，探索可作為股骨頭壞死診斷、發(fā)病機制的潛在關(guān)鍵基因，是NOFH中基于人關(guān)節(jié)軟骨的第一個基因表達譜生物信息學(xué)研究，本研究結(jié)果可能為NOFH的發(fā)病機制及治療措施提供新的選擇依據(jù).

在本研究中，共獲得809個上調(diào)差異表達基因和506個下調(diào)差異表達基因.根據(jù)GO顯著富集結(jié)果分析，差異表達基因主要參與細(xì)胞外基質(zhì)、胞外空間、膠原蛋白三聚體、膠原纖維組織等.這些顯著富集的細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因和膠原基因均為上調(diào)基因，有研究表明此類基因的突變可能與關(guān)節(jié)炎及股骨頭的壞死發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［8］.圖2中COL5A1編碼V型膠原的α鏈?zhǔn)墙Y(jié)締組織的次要組分.在動物研究中，發(fā)現(xiàn)COL5A1的功能障礙產(chǎn)生異常關(guān)節(jié)表型，如關(guān)節(jié)松弛和早發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎［9］.ASPN編碼軟骨細(xì)胞外蛋白質(zhì)，能夠通過阻斷軟骨細(xì)胞中轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β受體相互作用來負(fù)調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨的軟骨形成［10］.OGN編碼骨膠原能夠誘導(dǎo)異位骨形成和調(diào)節(jié)心血管發(fā)育［11-12］.CRTAC1編碼軟骨酸性蛋白1在關(guān)節(jié)軟骨的深部區(qū)域表達.CRTAC1作為區(qū)分軟骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞的生物標(biāo)志物［13］.

KEGG通路分析中，黏著斑（focal adhesion）是細(xì)胞骨架中的一種重要的結(jié)構(gòu)，細(xì)胞依靠“黏著斑”特殊結(jié)構(gòu)來保持其正常形態(tài)和發(fā)揮其正常功能［14］.黏著斑可能參與骨壞死早期時調(diào)節(jié)細(xì)胞生長的過程.蛋白質(zhì)消化吸收（protein digestion and absorption）與股骨頭缺血壞死后期骨質(zhì)平衡破壞、關(guān)節(jié)軟骨塌陷有關(guān).松弛素信號通路（relaxin signaling pathway）具有多效性作用，包括血管擴張，抗纖維化和血管生成作用［15］.與股骨頭壞死患者微血管病變、血液循環(huán)障礙、凝血機制異常密切相關(guān).轉(zhuǎn)化生長因子 β信號通路（TGF-beta signaling pathway）中的轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）家族成員，包括TGF-β，激活素和骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP），廣泛調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖，凋亡，分化和遷移功能［16］.大量研究證實BMP有誘導(dǎo)成骨作用，其中BMP-2成骨誘導(dǎo)作用最強，是最有前途的骨誘導(dǎo)物質(zhì)［17］.類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis）系慢性自身免疫性關(guān)節(jié)疾病，本身就可以進展為股骨頭壞死，如有激素或類固醇的誘導(dǎo)，發(fā)生骨壞死的比率將明顯增加［18］.骨髓造血細(xì)胞為股骨頭骨組織的重要組成部分，造血細(xì)胞系（hematopoietic cell lineage）中骨髓造血細(xì)胞的病理改變可影響股骨頭壞死的發(fā)展.抗原加工和表現(xiàn)（antigen processing and presentation）、Th1和 Th2細(xì)胞分化（Th1 and Th2 cell differentiation）及 Th17細(xì)胞分化（Th17 cell differentiation）均涉及免疫系統(tǒng).Okazaki等［19］已經(jīng)證明股骨頭壞死與免疫系統(tǒng)的破壞有關(guān)，免疫失調(diào)可導(dǎo)致骨代謝異常，骨量減少及骨小梁塌陷，最終導(dǎo)致骨壞死.

從PPI網(wǎng)絡(luò)交互密集的20個中心節(jié)點蛋白進行潛在關(guān)節(jié)基因挖掘，發(fā)現(xiàn)了HACE1、FBXW7、GNG8、SAA1前4名潛在基因.在本研究中，上調(diào)的HACE1、FBXW7主要涉及蛋白質(zhì)泛素化.HACE1是HECT家族E3連接酶，通過介導(dǎo)Rac1的泛素化，激活泛素 -蛋白酶體途徑［20］.HACE1生物學(xué)功能廣泛，可通過介導(dǎo)核因子E2相關(guān)因子2（NRF2）發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用.氧化應(yīng)激是缺血性損傷的重要病理機制，Ichiseki等［21］研究發(fā)現(xiàn)，短暫氧化應(yīng)激即可加重骨壞死.Murata等［22］研究證實，激素可能通過氧化應(yīng)激途徑產(chǎn)生骨壞死.有研究報道HACE1的喪失可增加體內(nèi)外活性氧（ROS）水平，HACE1的喪失導(dǎo)致ROS依賴性谷氨酰胺成癮［23］.活性氧（ROS）增加可促進股骨頭壞死發(fā)生，而抗氧化劑的使用可在一定程度上抑制這一病理過程［24］.最近研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Rac1與Rac1依賴性NADPH氧化酶復(fù)合物結(jié)合時，HACE1特異性地靶向活化Rac1，以降低ROS產(chǎn)生［25］.FBXW7基因編碼的蛋白是F-box蛋白家族的一員.FBXW7可通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮Notch信號途徑控制血管形成［26］.同時FBXW7是脂肪細(xì)胞分化的負(fù)調(diào)節(jié)因子，F(xiàn)BXW7的上調(diào)有助于脂肪細(xì)胞肥大相關(guān)的 G0/G1期細(xì)胞周期停滯［27］.Onoyama等［28］研究認(rèn)為FBXW7在調(diào)節(jié)肝臟的脂肪生成和細(xì)胞增殖和分化中發(fā)揮著關(guān)鍵作用.目前沒有證據(jù)表明HACE1和FBXW7與股骨頭壞死的發(fā)病機制有關(guān).因此，推測HACE1和FBXW7可能通過蛋白質(zhì)泛素化過程參與股骨頭壞死的進展.

此外，在 PPI網(wǎng)絡(luò)模塊中，下調(diào)的GNG8、SAA1分別涉及異三聚體G蛋白復(fù)合物與炎癥反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)過程.GNG8（鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白8）是細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移過程中一個極為重要的趨化因子.GNG8通過細(xì)胞膜G蛋白磷酸化和去磷酸化參與多細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［29］.G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）在內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，以及成血管細(xì)胞的遷移、分化等過程中發(fā)揮作用［30-31］.Li等［32］發(fā)現(xiàn) FIZZ1（炎癥區(qū)域分子 1）可以通過上調(diào)GNG8、ATG9A和P13K/Akt通路基因表達來提高大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成能力.目前，改善股骨頭及其周圍血液循環(huán)、促再血管化及促成骨是早期股骨頭壞死治療的研究熱點.SAA1（血清淀粉樣蛋白1）是一種新的促炎性脂肪細(xì)胞因子，也是一種炎癥信號的觸發(fā)劑.Wang等［33］研究發(fā)現(xiàn)SAA1是動脈粥樣硬化和心肌梗死的候選基因.最近幾項研究報道了SAA1基因多態(tài)性與頸動脈粥樣硬化癥［34］、脂質(zhì)水平［35］、尿酸水平［36］和外周動脈疾病［37］的關(guān)系.Xu等［38］也報道SAA1基因多態(tài)性與脂質(zhì)水平相關(guān).SAA1基因多態(tài)性也與中國人群的骨質(zhì)疏松有關(guān)，與SAA基因多態(tài)性引起的脂質(zhì)紊亂有關(guān)［39］.本研究中，兩個基因富集于血管生成及脂質(zhì)代謝過程，GNG8、SAA1之間的相互作用可能在股骨頭壞死發(fā)展中起重要作用.

綜上，采用生物信息學(xué)的方法在股骨頭壞死樣品中共鑒定出809個上調(diào)與506個下調(diào)差異表達基因.HACE1、FBXW7、GNG8和SAA1等基因以及松弛素信號通路、轉(zhuǎn)化生長因子β信號通路等可能與非創(chuàng)傷性股骨頭缺血壞死的病理機制密切相關(guān).為股骨頭缺血壞死發(fā)病機制的研究與治療提供參考.

［1］CHAN K L，MOK CC.Glucocorticoid-induced avascular bone necrosis：diagnosis and management［J］.Open Orthopaedics Journal，2012，6（1）：449.

［2］WEINSTEIN R S. Clinical practice. Glucocorticoidinduced bone disease［J］.New England Journal of Medicine，2011，365（1）：62-70.

［3］WU B，DONG Z，Li S，et al.Steroid-induced ischemic bone necrosis of femoral head：treatment strategies［J］.Pakistan Journal of Medical Sciences，2015，31（2）：471.

［4］WEINSTEIN R S.Glucocorticoid-induced osteoporosis and osteonecrosis［J］.Endocrinology＆ Metabolism Clinics of North America，2012，41（3）：595.

［5］LIN Z，LIN Y.Identification of potential crucial genes associated with steroid-induced necrosis of femoral head based on gene expression profile［J］.Gene，2017，627：322.

［6］HUANG G，WEIY，ZHAO G，et al.Microarray-based screening of differentially expressed genes in glucocorticoid？induced avascular necrosis［J］.Mol Med Rep，2017，15（6）：3583-3590.

［7］XU X，WEN H，HU Y，et al.STAT1-caspase 3 pathway in the apoptotic process associated with steroid-induced necrosis of the femoral head［J］.Journal of Molecular Histology，2014，45（4）：473-485.

［8］LIU R，LIU Q，WANG K，et al.Comparative analysis of gene expression profiles in normal hip human cartilage and cartilage from patients with necrosis of the femoral head［J］.Arthritis Research＆Therapy，2016，18（1）：98.

［9］SUN M，CONNIZZO B K，ADAMSSM，et al.Targeted deletion of collagen V in tendons and ligaments results in a classic ehlers-danlos syndrome joint phenotype［J］.American Journal of Pathology，2015，185（5）：1436.

［10］NAKAJIMA M， KIZAWA H， SAITOH M， et al.Mechanisms for asporin function and regulation in articular cartilage［J］.Journal of Biological Chemistry，2007，282（44）：32185-32192.

［11］TANAKA K，MATSUMOTO E，HIGASHIMAKI Y，et al.Role of osteoglycin in the linkage between muscle and bone［J］.Journal of Biological Chemistry，2012，287（15）：11616-11628.

［12］PETRETTO E， SARWAR R， GRIEVE I， et al.Integrated genomic approaches implicate osteoglycin（Ogn）in the regulation of left ventricular mass［J］.Nature Genetics，2008，40（5）：546-552.

［13］STECK E，BRAUN J，PELTTARIK，et al.Chondrocyte secreted crtac1：a glycosylated extracellular matrix molecule of human articular cartilage［J］. Matrix Biology，2007，26（1）：30.

［14］DJINOVIC-CARUGO K，GAUTEL M，YLANNE J，et al. The spectrin repeat： a structural platform for cytoskeletal protein assemblies［J］.Febs Letters，2002，513（1）：119.

［15］SAMUEL CS，HEWITSON TD，UNEMORIEN，et al.Drugs of the future：the hormone relaxin［J］.Cellular＆Molecular Life Sciences Cmls，2007，64（12）：1539-1557.

［16］MIYAZONO K，KUSANAGI K，INOUE H.Divergence and convergence of TGF-beta/BMP signaling［J］.Journal of Cellular Physiology，2001，187（3）：265.

［17］SEKIYA I，LARSON B L，VUORISTO J T，et al.Adipogenic differentiation of human adult stem cells from bonemarrow stroma（MSCs）？［J］.Journal of Bone＆Mineral Research the Official Journal of the American Society for Bone＆ Mineral Research，2004，19（2）：256.

［18］VUGT R M V，SIJBRANDIJ E S，BIJLSMA JW J.Magnetic resonance imaging of the femoral head to detect avascular necrosis in active rheumatoid arthritis treated with methylprednisolone pulse therapy［J］.Scandinavian Journal of Rheumatology，1996，25（2）：74.

［19］OKAZAKI S， NISHITANI Y， NAGOYA S， et al.Femoral head osteonecrosis can be caused by disruption of the systemic immune response via the toll-like receptor 4 signalling pathway［J］.Rheumatology，2009，48（3）：227.

［20］GACON G，METTOUCHIA，LEMICHEZ E.The tumor suppressor HACE1 targets Rac1 to ubiquitin-mediated proteasomal degradation［J］.Med Sci，2012，28（1）：39-41.

［21］ICHISEKI T， KANEUJI A， UEDA Y， et al.Osteonecrosis development in a novel rat model characterized by a single application of oxidative stress［J］.Arthritis＆Rheumatism，2011，63（7）：2138.

［22］MURATA M， KUMAGAI K， MIYATA N， et al.Osteonecrosis in stroke-prone spontaneously hypertensive rats：effect of glucocorticoid［J］.Journal of Orthopaedic Science，2007，12（3）：289-295.

［23］CETINBASN，DAUGAARD M，MULLEN A R，et al.Loss of the tumor suppressor Hace1 leads to ROS-dependent glutamine addiction［J］.Oncogene，2015，34（30）：4005-4010.

［24］LIU H，YANG X，ZHANGY，et al.Fullerolantagonizes dexamethasone-induced oxidative stress and adipogenesis while enhancing osteogenesis in a cloned bone marrow mesenchymal stem cell［J］.Journal of Orthopaedic Research，2012，30（7）：1051-1057.

［25］DAUGAARD M，NITSCH R，RAZAGHI B，et al.Hace1 controls ROS generation of vertebrate Rac1-dependent NADPH oxidase complexes［J］. Nature Communications，2013，4（4）：2180.

［26］IZUMI N，HELKER C，EHLING M，et al.Fbxw7 controls angiogenesis by regulating endothelial notch activity［J］.Plos One，2012，7（7）：e41116.

［27］NAKATSUKA A，WADA J，HIDA K，et al.RXR antagonism induces G0/G1 cell cycle arrest and ameliorates obesity by up-regulating the p53-p21（Cip1）pathway in adipocytes［J］.Journal of Pathology，2012，226（5）：784.

［28］ONOYAMA I，SUZUKI A，MATSUMOTO A，et al.Fbxw7 regulates lipid metabolism and cell fate decisions in the mouse liver［J］.Journal of Clinical Investigation，2011，121（1）：342-354.

［29］RYBA N J，TIRINDELLI R.A novel GTP-binding protein gamma-subunit，G gamma 8，is expressed during neurogenesis in the olfactory and vomeronasal neuroepithelia［J］.Journal of Biological Chemistry，1995，270（12）：6757-6767.

［30］SILLE F C，THOMAS R，SMITH M T，et al.Post-GWAS functional characterization of susceptibility variants for chronic lymphocytic leukemia［J］.PLoS One.2012，7（1）：e29632.

［31］HERBERT SP，STAINIER D Y R.Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis［J］.Nature Reviews Molecular Cell Biology，2011，12（9）：551-564.

［32］LIX，YANG Y，F(xiàn)ANG J，et al.FIZZ1 could enhance the angiogenic ability of rat aortic endothelial cells［J］.International Journal of Clinical＆Experimental Pathology，2013，6（9）：1847-1853.

［33］WANG B Y，HANG JY，ZHONG Y，et al.Association of genetic polymorphisms of SAA1（rs12218） with myocardial infarction in a Chinese population［J］.Genetics＆ Molecular Research Gmr，2014，13（2）：3693-3696.

［34］XIANG X，MA Y T，YANG Y N，et al.Polymorphisms in the SAA1/2 gene are associated with carotid intima media thickness in healthy han chinese subjects：the cardiovascular risk survey［J］.Plos One，2010，5（11）：e13997.

［35］XIE X，MA Y T，YANG Y N，et al.Association of genetic polymorphisms of serum amyloid protein A1 with plasma high density lipoproteins cholesterol［J］.Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2010，90（26）：1824-1826.

［36］XIE X，MA Y T，YANG Y N，et al.Serum uric acid levels are associated with polymorphism in the SAA1 gene in chinese subjects［J］.Plos One，2012，7（6）：1634-1634.

［37］XIE X，MA Y T，YANG Y N，et al.Polymorphisms in the SAA1 gene are associated with ankle-to-brachial index in han chinese healthy subjects［J］.Blood Press，2011，20（4）：232-238.

［38］XU X L，SUN X T，PANG L，et al.Rs12218 In SAA1 gene was associated with serum lipid levels［J］.Lipids in Health＆Disease，2013，12（1）：1-4.

［39］FENG Z P，LI X Y，RONG J，et al.Associations of SAA1 gene polymorphism with lipid lelvels and osteoporosis in chinese women［J］.Lipids in Health＆Disease，2013，12（1）：1-5.