王躍幫，吳 娟，崔 倩，王 飛，常珊碧(宿遷市第一人民醫(yī)院檢驗科，江蘇宿遷 223800)

冠心病(coronary heart disease，CHD)目前已經(jīng)超過惡性腫瘤成為人類死亡的第一號殺手，2014年報道農(nóng)村和城市冠心病死亡率分別為143.72/10萬和136.21/10萬[1]。冠心病是一種炎癥性疾病，白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)作為重要的炎性細胞因子在冠心病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[2]，血液中IL-6濃度受其基因水平的調(diào)控，IL-6基因上游啟動子區(qū)域存在大量的基因多態(tài)性位點[3]，可能影響IL-6的表達，為進一步研究IL-6基因多態(tài)性與冠心病的關系，本文通過聚合酶鏈-限制性片段長度多態(tài)性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)方法，進一步研究IL-6-572C>G和-174G>C基因多態(tài)性與江蘇宿遷地區(qū)漢族人群冠心病的關系，為預防冠心病提供相關理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1 研究對象 收集2017年1～12月在宿遷市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科確診的冠心病患者266例，其中男性165例，女性101例，年齡64.57±11.02歲，冠心病診斷標準依據(jù)2010年衛(wèi)生部頒布冠心病診斷標準WS319-2010)：①有冠狀動脈搭橋的病史；②冠狀動脈管腔狹窄>50%。滿足以上任意一條即可。排除標準：對患有嚴重感染者、心肌病、惡性腫瘤、心臟瓣膜病、白血病和自身免疫性疾病等予以排除。對照組為同期我院體檢健康者192例，男性117例，女性75例，年齡62.74±10.93歲。研究對象均知情同意且無血緣關系，經(jīng)宿遷市第一人民醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 試劑和儀器 糖化血紅蛋白儀檢測試劑盒(美國伯樂公司)，三酰甘油(TG)測定試劑盒、總膽固醇(CHOL)測定試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)測定試劑盒、載脂蛋白A-I(ApoA-I)測定試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)測定試劑盒、載脂蛋白B(Apo-B)測定試劑盒、C反應蛋白(CRP)測定試劑盒、葡萄糖(Glu)測定試劑盒(美國貝克曼公司)，全血基因組DNA試劑盒(德國qiagen公司)，限制性內(nèi)切酶sfaNI，BsrBI(美國NEB公司)，PCR擴增試劑盒(近岸蛋白質(zhì)公司)；Beckman Coulter AU5800全自動生化分析儀(美國貝克曼公司)，F(xiàn)R-200A紫外分析儀(上海復日科技公司)，Bio-Rad糖化血紅蛋白儀，DNA電泳儀(美國伯樂公司)，Thermal Cycler PCR擴增儀(美國ABI公司)。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集：分別采集冠心病患者和健康體檢者空腹靜脈血各2管(禁食8～12 h)：3 ml EDTA-K2紫色抗凝管，提取全血基因組DNA，提取產(chǎn)物置-20℃冰箱冷凍保存；5 ml帶有分離膠的黃色促凝管3 000 r/min離心15 min，血清置-20℃冰箱冷凍保存。

1.3.2 生化指標檢測：各指標檢測嚴格按照ISO15189的相關要求和試劑說明書執(zhí)行，TG檢測采用甘油磷酸氧化酶-過氧化物酶法，HDL-C，LDL-C檢測采用直接法，ApoA-I，ApoB和CRP檢測采用免疫比濁法，CHOL檢測采用酶法，Glu檢測采用己糖激酶法，HbA1c檢測采用高效液相色譜法。

1.3.3 全血基因組DNA模板制備：全血基因組DNA提取完成后，用紫外分光光度計檢測A260 nm/A280nm吸光度，選取純度在1.8～2.0之間的樣品置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 聚合酶鏈-限制性片段長度多態(tài)性方法檢測基因多態(tài)性：應用聚合酶鏈-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法，分別檢測IL-6 -174G>C和-572C>G基因多態(tài)性。IL-6-174G>C引物參考文獻[4]，上游引物序列：5’-ATGCCAAAGTGCTGAGTCACTA-3’，下游引物序列：5’-TCGAGGGCAGAATGAGCCTC-3’，PCR產(chǎn)物大小為308bp，Tm 56 ℃；IL-6-572C>G引物參考文獻[5]，上游引物序列：5’-AGAGAGCAAAGTCCTCACTG-3’，下游引物序列：5’-ATGTTCTGAACTGAGTTTCC-3’，PCR產(chǎn)物大小321bp，Tm 58.5 ℃；兩種引物序列均由上海捷瑞公司設計合成。PCR反應體系：模板DNA(約100 ng)2 μl ，2×Taq Master Mix 25 μl，上、下游引物各1 μl，ddH2O 21 μl。-174G>C PCR循環(huán)參數(shù)：94℃預變性2 min，94 ℃變性20 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次，72 ℃再延伸5 min，4 ℃保存；-572C>G PCR循環(huán)參數(shù)：94℃預變性2min，94℃變性40s，58.5 ℃退火1 min，72℃延伸1 min，循環(huán)35次，72℃再延伸5 min，4℃保存。擴增產(chǎn)物鑒定和酶切分析：5 μl PCR產(chǎn)物直接瓊脂糖凝膠(15 g/L)電泳120 v，15 min；酶切反應體系：總體積50 μl，10×NEBuffer 3.1為5 μl，限制性內(nèi)切酶SfaNI GCATC(N)或BsrBI(CCGCTC)分別為2 μl，PCR產(chǎn)物8 μl，ddH2O 35 μl，37℃水浴酶切60 min，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠(25 g/L)電泳120 v，20 min，以DL2000 Maker為標準，F(xiàn)R-200A紫外分析儀拍照。

2結果

2.1 一般資料比較 見表1。

表1 CHD組和對照組一般資料比較

與對照組相比，性別、血糖、BMI和年齡在兩組間差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，吸煙、TG，CHOL，HDL-C，LDL-C，DBP，SBP，CRP，HbA1c，ApoA-I和ApoB在兩組間差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。

2.2 基因型結果 PCR擴增產(chǎn)物片段酶切結果分別見圖1和圖2。

注：M是DL2000maker標記物；1是PCR擴增產(chǎn)物；2，3 是CG基因型；4，5是GG基因型；6是CC基因型。

2.3 基因型和等位基因頻率比較 見表2，表3。宿遷漢族人群IL-6-572C>G基因多態(tài)性可見CC，CG和GG型，與CC型相比，CG和GG基因型和等位基因頻率在兩組間的差異均有統(tǒng)計學意義(χ2=11.1，19.5，22.4，均P<0.05)。IL-6-174G>C基因多態(tài)性可見GG和GC型，未見CC型，基因型和等位基因頻率在兩組間的差異均無統(tǒng)計學意義(χ2=0.024， 0.027，均P>0.05)。

表2 IL-6-572C>G基因型和等位基因頻率分布[n(%)]

表4 IL-6-174G>C基因型和等位基因頻率分布[n(%)]

3討論近年來，我國冠心病的發(fā)病率逐年遞增，日益加重了我國公共衛(wèi)生負擔，威脅居民生命健康，嚴重制約社會經(jīng)濟發(fā)展。大量研究表明炎癥因子在動脈粥樣硬化、冠心病的發(fā)生中起重要作用[6]，IL-6作為重要的炎性細胞因子，主要通過細胞因子網(wǎng)絡促進冠狀動脈粥樣硬化的發(fā)生[7]，血清中IL-6的濃度與冠心病的嚴重程度緊密相關[8]，IL-6上游啟動子區(qū)域存在大量的基因多態(tài)性位點，影響IL-6的表達。

本研究一般資料結果表明：性別、血糖、BMI和年齡在冠心病組和對照組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，冠心病患者的收縮壓、舒張壓、TG，CRP和HbA1c與對照組相比明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，吸煙在兩組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而HDL-C，ApoB，CHOL，ApoA-I和LDL-C比對照組明顯減低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，本研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖在兩組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。冠心病組血清中LDL-C濃度明顯低于對照組，其主要原因是本研究中的冠心病患者基本存在5～10年的患病史，40%的患者并發(fā)有高血壓和糖尿病病史，患者長期服用降血壓、降血糖和降血脂等治療藥物并且長期低脂飲食。

本研究結果表明，兩者基因多態(tài)性頻率分布均符合H-W遺傳平衡原理，具有群體代表性，江蘇宿遷地區(qū)漢族人群IL-6-572C>G基因型主要為CC型和CG型，其次為GG型，基因型頻率分別為32.3%，51.9%，15.8%(CHD組)和52.1%，42.7%，5.2%(健康對照組)，C，G等位基因頻率分別為58.3%，41.7%和73.4%，26.6%，G等位基因頻率明顯高于C等位基因頻率，與對照組相比冠心病組CG和GG基因型頻率明顯升高，研究結果與陳丹等[5，9]人研究結果一致。本研究中冠心病組GG型(突變型)和GC型(雜合突變型)發(fā)病風險分別是CC型(野生型)的4.88倍(95%CI：2.31～10.31)和1.96倍(95% CI：1.32～2.91)，-572G等位基因可能是宿遷漢族冠心病人群的易感基因，Mao等[10]人對河南地區(qū)人群研究發(fā)現(xiàn)-572C>G與冠心病沒有相關性，其研究對象長期生活在中部地區(qū)，環(huán)境、氣候、飲食結構與本研究地區(qū)差異較大，且其沒有限制種族的納入；IL-6-174G>C基因型主要見于GG，GC型，未見CC型，與對照組相比，冠心病組基因型和等位基因差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，研究結果與Bhanushali等[11]人的研究結果一致。

冠心病是多基因遺傳性疾病，易受基因和環(huán)境多重因素的影響[12]，種族、地域的差別，其基因多態(tài)性亦不相同，本實驗結果表明，IL-6基因啟動子區(qū)域-572G等位基因是冠心病的易感基因，而-174位點基因多態(tài)性與宿遷地區(qū)漢族冠心病人群無相關性。本研究由于病例數(shù)量的限制，未能夠進一步分析IL-6基因多態(tài)性和冠心病嚴重程度之間的關系。

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