浩日瓦，娜日罕，周 紅，董 莉(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院檢驗科，呼和浩特 010050)

心力衰竭(hear failure，HF)是由各種心臟結(jié)構或功能性疾病所導致的心室功能受損，以器官、組織血液灌注不足為臨床表現(xiàn)的一組臨床癥狀。急性心肌梗死(acute myocardial infartcion AMI)是我國心力衰竭的主要病因[1]；擴張性心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)是一類以左心室或雙心室擴大伴收縮功能障礙為特征的心肌病，其終末期結(jié)果也為心力衰竭。因此對心衰的早期診斷尤為重要，而目前實驗室常用的N端腦鈉肽(NT-proBNP)、肌鈣蛋白(cTnT)，因其受到諸多因素影響，診斷意義有限。有報道認為，microRNA能夠調(diào)節(jié)多種心臟疾病的病理過程，并呈異常表達[2]，而microRNA126(血管內(nèi)皮細胞及血管功能密切相關)和microRNA1(心肌肥大相關)是否可以作為新的診斷標志物，現(xiàn)報告如下：

1材料與方法

1.1 研究對象 選取2015年9月～2017年1月在我院心內(nèi)科住院確診的AMI后心衰患者45例,(診斷依據(jù)2015年心梗后心衰診斷指南)，男性23例，女性22例，年齡45～82歲。擴心病后心衰患者30例(診斷依據(jù)2015年擴心病心衰診斷指南)，其中男性17例，女性13例，年齡47～77歲。選取同期在我院進行健康體檢的健康者20例為對照組，其中男性10例，女性10例，年齡40～83歲。

1.2 儀器與試劑 采用賽默飛世爾科技公司Series 4’ A2型實時熒光定量PCR擴增儀，美國伯樂公司的 CFX96 REAL-TIME system；miRcute miRNA提取分離、合成、熒光定量檢測試劑盒(天根生化科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 標本采集：兩組患者入院即刻使用抗凝分離膠管采集全血5 ml，于湘儀TDZ5-W5離心機3 000 r/min離心5 min分離血清，使用無RNA酶的離心管于-80℃冰箱，健康對照組標本采集及處理與上兩組標本相同。

1.3.2 miR-1，miR-126表達量檢測：采用qRT-PCR技術。

1.3.3 引物設計：miR-1，miR-126引物及內(nèi)參引物U6，外參均由天根生化科技(北京)有限公司提供。miR126引物序列：UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG，U6內(nèi)參引物序列：ATGGACTATCATATGCTTACCGTA；miR1引物序列：CTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAG，檢測外參引物序列：TAATACGACTCACTATAGGG。miR-1，miR-126，內(nèi)參基因為U6 RNA，miR-1及miR-126表達相對量為 2-[( CtmiR-1-CtU6)病例組-(CtmiR-1-CtU6) 對照組]，2-[( CtmiR-1-CtU6 )病例組-(CtmiR-1-CtU6) 對照組]。

1.4 NTproBNP，cTnT，LEVF檢測及診療記錄 血清NTproBNP，cTnT檢測使用羅氏全自動電化學發(fā)光儀，按說明書進行，所有檢測均在室內(nèi)質(zhì)控在控下進行。

2結(jié)果

2.1 血清miR-126，miR-1檢測結(jié)果 見表1。兩組患者血清miR-126，miR-1較對照組顯著下降(t=72.14,38.05,均P<0.001)。AMI組與DCM組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 DCM組及AMI組心衰患者mir-126及mir-1相對表達量

2．2 miR-126，miR-1與NTproBNP，cTnT，心胸比，射血分數(shù)相關性分析 見表2。

表2 心衰患者miR-126，miR-1與cTnT，NTproBNP，LVEF相關性

心衰患者血清miR-126，miR-1相對含量與NTproBNP，cTnT，心胸比呈負相關，與LVEF呈正相關，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.3 血清miR-126，miR-1對心衰的診斷效能 見表3。

表3 心衰患者miR-126，miR-1的診斷效率比較(%)

miR-126，miR-1靈敏度僅為55%，65.3%，低于cTNTt pro-BNP，差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)；但特異度為85%，78.2%，與cTnT，NTpro-BNP比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；陽性預測值為77.23%，78.44%低于cTnT和NTpro-BNP，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。陰性預測值和準確度，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)果顯示血清miR-126和miR-1對心衰有診斷意義。

2.4 心衰患者12個月預后COX回歸分析 對兩組病人12個月預后進行生存分析，發(fā)現(xiàn)校正心肌標志物后miR-126 的12個月相對危險度為0.53，(95% CI 0.451～1.452，P=0.052)，0.73(95% CI 0.516～1.529，P=0.062)，差異無統(tǒng)計學意義。miR-1的12個月生存分析其相對危險度分別為1.35(95% CI 0.542～1.893，P=0.073)，2.35(95% CI 0.432～1.939，P=0.053)，差異無統(tǒng)計學意義。

3討論MicroRNAs(miRNAs)是內(nèi)源性非編碼小RNA，長約18～23個核苷酸序列，可通過結(jié)合mRNA的3’非翻譯區(qū)抑制轉(zhuǎn)錄和翻譯過程[3]，調(diào)節(jié)基因的表達。miRNAs多數(shù)存在于組織細胞中，并與心肌發(fā)育、細胞肥大、纖維化等有關[4]；其中部分miRNAs存在于外周循環(huán)，可用于外周血的檢測，為我們實驗的可行性提供了依據(jù)。

miR-1 是心臟和肌肉特異性的miRNA，也是心臟中含量最豐富的miRNA，miR-1通過Ca/CaM(Ca與CaM的比值為心肌肥大信號通路的重要介質(zhì))途徑引起心肌肥大繼而導致心衰[5]，心衰時miR-1下調(diào)，可引起心肌細胞肥大，其原因在于：miR-1下調(diào)后使靶基因鈣調(diào)蛋白(calmodulin，CaM)和肌細胞增強因子-2(myocyte enhancer factor，Mef2)表達增加，Ca與CaM比值下調(diào)活化鈣神經(jīng)素，進一步引起轉(zhuǎn)錄因子激活T細胞核因子(nuclear factor of activated T cells，NFAT)的活化，CN-NFAT通路激活導致心肌細胞肥大[6]。

miR-126能夠通過調(diào)控Spred-1，VCAM-1，HoxA9，v-Crk，EGFL-7和VEGF等基因的表達，參與調(diào)節(jié)血管發(fā)育、新生血管形成以及血管炎癥反應等血管的生理和病理生理過程[7，8]。其機理是：miR126以VCAM-1為靶基因調(diào)節(jié)血管炎癥反應[9](此作用只能在翻譯水平進行，因VCAM-1的3’UTR區(qū)沒有能與miR126精確配對區(qū)域，無法在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)VACM-1的含量[4])；VCAM-1是由活化內(nèi)皮細胞分泌的一種細胞因子，可以使活化的血管內(nèi)皮與炎癥細胞黏附，當miR126含量下降時，其對VCAM-1的抑制作用減弱，使白細胞和血管內(nèi)皮細胞的黏附加強。因此，檢測循環(huán)miR-126可以推測血管炎癥程度，評估心衰及預后[6，10]，對臨床有重要意義。此為內(nèi)源性microRNA126的降低促進白細胞與血管內(nèi)皮細胞的黏附的原因[5]。

我們的研究發(fā)現(xiàn)：兩組心衰患者中miR-1，miR-126與對照相比顯著下調(diào)；而兩組患者間差異均無統(tǒng)計學意義。這種差異表達使其有潛力用于心衰的診斷，但不能作為區(qū)分心梗后心衰與擴心病心衰的依據(jù)。

我們的研究結(jié)果與Gidldf等[5，11]的研究結(jié)果相同，即：miR-126顯著下調(diào)。但Gidldf等[5]的研究發(fā)現(xiàn)其上調(diào)和下調(diào)與時間相關，同時其不同時間點的表達曲線與cTNT表達曲線一致，但無相關性；而我們的結(jié)果是miR-126相對含量與cTnT濃度呈負相關。存在出入可能原因是：miR-126 是血管特異性的miRNA，在AMI梗死處血管內(nèi)濃度最高，如直接取材與梗死處濃度必然高于外周血。外周循環(huán)中受循環(huán)血量、心率、相關生化指標等的影響；也可能與我們標本收集只來源于我們醫(yī)院(局限性)，對照組例數(shù)少有關。

Qian等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)生心衰的整個過程中，miR-1非全程減少，在心衰發(fā)生的初始階段，miR-1可輕微上調(diào)，而我們的降低結(jié)果是否時間點掌握不夠？是否有必要進行連續(xù)觀察？有待于我們后期研究進行完善。

通過miR-126和miR-1檢測效能的分析，其靈敏度不夠理想，但特異度相當，與cTnT，NTpro-BNP相比，無顯著性差異；同時，cTnT，NTpro-BNP檢測受峰值、采樣時間點、NTpro-BNP半衰期、患者腎功能等因素影響就更加凸顯出miR-126和miR-1檢測的價值。而將其與NTpro-BNP，cTnT聯(lián)合檢測其靈敏度、特異度分別為69.3%和92.6%。但miR-126和miR-1 并非心衰患者1年內(nèi)發(fā)生主要不良心臟事件的獨立危險因子。

本次實驗并未對心衰等級做劃分(NYHA III&IV級)，今后我們的研究實驗會在進一步增加健康對照的同時，注意標本收集后心衰的等級劃分，充分利用循環(huán)miR-126，miR-1濃度的不同，對疾病進行盡量準確的診斷，指導臨床治療。

總之，miR-126，miR-1可用于心衰的診斷，但不能用于心衰病因的區(qū)分，且對患者1年的預后及不良事件預測無意義。

參考文獻：

[1] 胡春松，吳清華，胡大一．中國心血管現(xiàn)狀：挑戰(zhàn)與對策[J]．中華高血壓雜志，2015，23(7)：625-626．

Hu CS，Wu QH，Hu DY．China’s cardiovascular status：challenges and countermeasures[J]．Chinese Journal of Hypertension，2015，23(7)：625-626．

[2] 王 菲，Saumya Das．基于循環(huán)血微小

RNA預測心臟再同步化治療療效[J]．上海大學學報(自然科學版)，2016，22(3)：265-269．

Wang F，Das S．Circulating miRNA predict response to cardiac resynchronization therapy[J]．Journal of Shangghai University(Natural Science)，2016，22(3)：265-269．

[3] Xu C，Hu Y，Hou L，et al．B-Blocker carvedilol protects cardiomvocytes against oxidative stress-induced apoptosis by up-regulating miR-133 expression[J]．J Mol Cell Cardiol，2014，75：111-121．

[6] Devaux Y，Vausort M，McCann G，et al．MicroRNA-150：a novelmarker of left ventricular remodeling after acuting myocardial infarctio[J]．Circ Cardioval Genet，2013，6(3)：290-298．

[7] Long G，Wang F，Duan Q，et al．Human circulating microRNA-1 and microRNA-126，microRNA-150-1 as potential novel indicators for acute myocardial infarction and other descase[J]．Int J Biol Sci，2012，8(6)：813-818．

[8] Dong H，Dong S，Zhang L，et al．MicroRNA-214 exerts a cardio-protective effect by inhibition of fibrosis[J]．Anat Rec (Hoboken)，2016，299(10)：1348-1357．

[9] 肖 星，潘旭東，馬愛軍，等．微小RNA對內(nèi)皮細胞炎性反應過程中血管內(nèi)皮細胞黏附分子1表達的影響[J]．中華老年心腦血管病雜志，2016，18(5)：522-526．

Xiao X，Pan XD，Ma AJ，et al．Effect of microRNA on expression of VCAM-1 in inflammatory reaction of HUVEC[J]．Chinese Journal of Geriatric Heart Brain and Vessel Disease，2016，18(5)：522-526．

[10] Gupta MK，Halley C，Duan ZH，et al．miRNA-548c：a specific signature in circulating PBMCs from dilated cardiomyopathy patients[J]．J Mol Cell Cardiol，2013，62：131-141．

[11] 程 濤，黃 剛．血清miRNA-21，MiRNA-126表達在診斷PCI術后冠狀動脈再狹窄的臨床應用價值[J]．現(xiàn)代檢驗醫(yī)學雜志，2018，33(1)：59-62，66．

Cheng T，Huang G．Clinical value of serum miRNA-21 and miRNA-126 expression in diagnosis of the coronary artery restenosis after PCI[J]．Journal of Modern Laboratory Medicine，2018，33(1)：59-62，66．

[12] Qian L，van Laake LW，Huang Y，et al．MiR-24 inhibitis apoptosis and represses bim in mouse cardiomyocytes[J]．J Exp Med，2011，208(3)：549-560．