張婷婷，李雪萍

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)、滑膜以及關(guān)節(jié)周?chē)M織退變?yōu)樘卣?，涉及生化、機(jī)械和遺傳因素的復(fù)雜作用疾病[1-2]。不僅包括細(xì)胞分解代謝反應(yīng)的增加，如II型膠原和I型膠原的凈分解代謝，以及細(xì)胞外基質(zhì)合成反應(yīng)的減少，從而使軟骨關(guān)節(jié)面出現(xiàn)纖維化，形成基質(zhì)裂縫和垂直裂隙[3]。低強(qiáng)度脈沖式超聲(Low intensity pulsed ultrasound, LIPUS)作為一種局部機(jī)械刺激，可增加軟骨細(xì)胞的遷移率和增殖率、外基質(zhì)蛋白多糖的合成以及促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化，具有軟骨保護(hù)作用[4-5]。吡格列酮是臨床上較為常用的降糖藥物，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝、能量平衡、炎癥反應(yīng)等[6]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)吡格列酮可以激活細(xì)胞過(guò)氧化物酶體增殖劑激活受體γ(Peroxisome proliferator activated receptors γ, PPARγ)，上調(diào)自噬相關(guān)蛋白(autophagy-related proteins,Agt)、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)等表達(dá)，促進(jìn)自噬活動(dòng)，減少炎性因子的累積，起到軟骨保護(hù)作用[7-8]。研究表明，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、多種白細(xì)胞介素(interleukin，IL)、脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)在體內(nèi)外中被認(rèn)為是軟骨組織中較為常見(jiàn)的促炎性細(xì)胞因子[9]，這些刺激物通過(guò)刺激軟骨細(xì)胞生成基質(zhì)蛋白酶及其他炎癥產(chǎn)物加速OA病理生理進(jìn)展過(guò)程。因此，本研究通過(guò)胰島素生長(zhǎng)因子1(insulin-like growth factor-1, IGF-1)/雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)/前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)途徑探討吡格列酮和LIPUS對(duì)LPS誘導(dǎo)的OA軟骨細(xì)胞的作用比較。

1 材料與方法

1.1 材料 ①實(shí)驗(yàn)細(xì)胞:所有軟骨標(biāo)本均取自健康新西蘭大白兔膝關(guān)節(jié)。②試劑與設(shè)備:胰蛋白酶、高糖完全DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM)培養(yǎng)基、II型膠原(Type Ⅱ Collagen,COL2)抗體(中國(guó) 武漢博士生物工程有限公司)、mTOR抗體、GAPDH抗體(Abcam公司)、實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(realtimepolymerase chain reaction,RT-PCR)相關(guān)試劑(美國(guó)Invitrogen公司)、細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒(Cell Counting Kit-8，CCK-8) 、IGF-1、PGE2酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒(中國(guó) 南京建成生物工程研究所)、免疫化學(xué)染色試劑盒(中國(guó) 福州邁新生物科技有限公司)、全蛋白提取試劑盒、LPS、吡格列酮(美國(guó)sigma公司)、Western電泳儀、濕式電轉(zhuǎn)移槽(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2 方法 ①軟骨細(xì)胞的分離和培養(yǎng)：取24只體質(zhì)量約為2.0～3.0kg的健康成年雄性新西蘭大白兔，從膝軟骨標(biāo)本表面完好部分提取正常軟骨細(xì)胞。將膝軟骨標(biāo)本用PBS液沖洗3次并切碎至1.0mm3的小碎片，移入15ml離心管，加入2ml 0.25%胰蛋白酶于37℃恒溫箱中消化30min，移去胰蛋白酶液，加入3ml 0.25% II型膠原酶和3ml完全高糖DMEM培養(yǎng)基(含10%的胎牛血清)，靜置于37℃恒溫箱中過(guò)夜。次日，取出上清，離心10min(轉(zhuǎn)速1200r/min)，棄上清，加入完全高糖DMEM培養(yǎng)基吹打均勻后將細(xì)胞種植于培養(yǎng)瓶中，置于37℃恒溫箱中。每天用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待細(xì)胞鋪滿(mǎn)瓶底90%左右時(shí)傳代[4]。②實(shí)驗(yàn)分組：選取最佳吡格列酮干預(yù)濃度：用1uM,10uM,50uM,100uM不同濃度的吡格列酮分別干預(yù)LPS誘導(dǎo)的OA軟骨細(xì)胞，應(yīng)用CCK-8檢測(cè)技術(shù)，測(cè)定各組軟骨細(xì)胞的增殖能力，選取增殖能力最強(qiáng)的吡格列酮干預(yù)濃度，用于下一步研究。實(shí)驗(yàn)分為4組，每組6只，正常組、LPS組、LIPUS組(LPS+LIPUS)、吡格列酮組(LPS+100uM吡格列酮,Pioglitazone組)4組,LIPUS組和Pioglitazone組干預(yù)前4h給予LPS預(yù)處理,劑量同LPS組(2ug/ml)。③LIPUS及吡格列酮干預(yù)軟骨細(xì)胞：將LIPUS探頭涂抹耦合劑后置于培養(yǎng)瓶底部，自由模式，通斷比20%，頻率為3MHz，強(qiáng)度為40mW/cm2,每次照射20min,1次/d,共7d[10-11]。吡格列酮干預(yù)的細(xì)胞在含有100uM吡格列酮培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)7天，每2天更換一次含有100uM吡格列酮的培養(yǎng)基。④LPS誘導(dǎo)OA軟骨細(xì)胞方法[12-13]。本研究使用含2ug/ml LPS加入培養(yǎng)基中培養(yǎng)軟骨細(xì)胞4h建立OA模型。

1.3 檢測(cè)指標(biāo) ①CCK-8檢測(cè)增值率：取各組軟骨細(xì)胞進(jìn)行消化、計(jì)數(shù)，配制細(xì)胞懸液1.2×105個(gè)/ml， 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入100μl細(xì)胞懸液。根據(jù)CCK-8試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行增殖率測(cè)定。②ELISA檢測(cè)IGF-1和PGE2的濃度：取各組軟骨細(xì)胞培養(yǎng)上清液，分別根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行濃度測(cè)定。③免疫化學(xué)染色法測(cè)定COL2表達(dá)：每張爬片滴加2滴3% H2O2-甲醇溶液,室溫封閉10min。滴加即用型山羊血清,室溫孵育20min。滴加COL2抗體(1∶100稀釋)50～100ul,室溫孵育2h，PBS浸洗3次。滴加增強(qiáng)劑,室溫濕盒孵育30min。PBS浸洗3次。滴加通用型IgG抗體-Fab段-HRP多聚體50ul,室溫孵育30min。PBS浸洗3次。每張片子加2滴新鮮配制的二氨基聯(lián)苯胺溶液。自來(lái)水沖洗,將切片放入蘇木素染液,染色10min,蒸餾水沖洗，用二甲苯浸泡10min。晾干后在切片上加中性樹(shù)膠,加蓋玻片。光學(xué)顯微鏡下觀察軟骨細(xì)胞中COL2的表達(dá)情況,拍照保存。④免疫蛋白印跡法測(cè)定mTOR含量：提取細(xì)胞蛋白：取出長(zhǎng)滿(mǎn)軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)皿，去除培養(yǎng)液，用PBS洗一遍，在培養(yǎng)皿中加入1ml的裂解液，充分晃動(dòng)均勻，使裂解液和細(xì)胞充分接觸。在冰上裂解20min后用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下，將細(xì)胞移入EP管，放入4℃離心機(jī)，15min，12000轉(zhuǎn)。取上清至新的EP管，加入5xSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。混合后，放入100℃，加熱15min。用于下一步聚丙烯酰胺凝膠電泳。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕式電泳槽轉(zhuǎn)膜,聚偏二氟乙烯膜在5%的封閉液中常溫震蕩封閉2h，分別加mTOR抗體、GAPDH抗體(1∶1000),4℃孵育過(guò)夜,緩沖液洗膜3次，加二抗，常溫孵育2h,緩沖液洗膜3次，顯影液顯影,機(jī)器曝光。⑤RT-PCR測(cè)定mTOR含量。按照PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行軟骨細(xì)胞的mTOR，GAPDH的RT-PCR檢測(cè)。GAPDH作為內(nèi)參基因。利用 2-ΔΔCT法進(jìn)行分析軟骨細(xì)胞mTOR基因表達(dá)。引物信息見(jiàn)表1。

表1 RT-PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 正常組與模型組軟骨細(xì)胞比較與鑒定 免疫細(xì)胞化學(xué)染色示正常軟骨細(xì)胞COL2染色均成陽(yáng)性,細(xì)胞胞漿內(nèi)有棕黃色顆粒,胞核基本無(wú)著色(圖1A)。LPS組LPS誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞COL2呈弱陽(yáng)性,細(xì)胞胞漿內(nèi)顆粒少且淡黃,胞核基本無(wú)著色(圖1B)。

2.2 CCK-8證實(shí)吡格列酮促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖 與正常組相比，1uM組軟骨細(xì)胞增殖活力無(wú)明顯變化，10uM組，50uM組，100uM組軟骨細(xì)胞增殖活力較強(qiáng)(均P<0.05)。其中，100uM組軟骨細(xì)胞增殖活力較10uM、50uM組強(qiáng)(均P<0.05)(圖2A)。因此，本研究選取100uM吡格列酮與LIPUS進(jìn)行研究對(duì)比。

圖1A正常組軟骨細(xì)胞COL2染色形態(tài)學(xué)表現(xiàn)(×400)

圖1BLPS組軟骨細(xì)胞COL2染色形態(tài)學(xué)表現(xiàn)(×400)

(軟骨細(xì)胞核用黑色箭頭表示,細(xì)胞內(nèi)外所表達(dá)的COL2染色陽(yáng)性用紅色箭頭表示)

2.3 ELISA證實(shí)吡格列酮和LIPUS對(duì)LPS誘導(dǎo)的OA軟骨細(xì)胞IGF-1、PGE2的表達(dá)作用 干預(yù)后，與正常組相比,LPS組的IGF-1表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，而LIPUS組的IGF-1表達(dá)水平明顯上升(P<0.05)，而Pioglitazone組無(wú)明顯變化。與LPS組相比,Pioglitazone組和LIPUS組的軟骨細(xì)胞IGF-1表達(dá)水平均上升(均P<0.05)。與LIPUS組相比，Pioglitazone組IGF-1水平明顯下降(P<0.05)(圖2B)。與正常組對(duì)比,其余各組PGE2均升高,但僅LPS組和LIPUS組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。與LPS組相比,LIPUS組和Pioglitazone組的軟骨細(xì)胞PGE2表達(dá)水平明顯下降(均P<0.05)；與LIPUS組相比，Pioglitazone組PGE2明顯下降(P<0.05)(圖2C)。

2.4 RT-PCR和Western blot證實(shí)LIPUS、吡格列酮對(duì)LPS誘導(dǎo)的OA軟骨細(xì)胞mTOR的作用 干預(yù)后，與正常組對(duì)比,LPS組和LIPUS組軟骨細(xì)胞mTOR mRNA水平和蛋白含量均升高(均P<0.05)，Pioglitazone組的軟骨細(xì)胞mTOR mRNA水平和蛋白含量降低(均P<0.05)；與LPS組相比,LIPUS組和Pioglitazone組的軟骨細(xì)胞mTOR mRNA水平和蛋白含量明顯下降(均P<0.05)；與LIPUS組相比，Pioglitazone組mTOR mRNA水平和蛋白含量明顯下降(均P<0.05)(表2，圖3，圖4)。

組別nmTOR 正常組60．37±0．05 LPS組60．82±0．10a LIPUS組60．66±0．05ab Pioglitazone組60．22±0．02abc

與正常組比較，aP<0.05；與LPS組比較，bP<0.05；與LIPUS組比較，cP<0.05

圖2 各組軟骨細(xì)胞增殖活力以及IGF1、PGE2表達(dá)水平

(*表示與正常組比較，P<0.05,#表示與LPS組比較，P<0.05,+表示與Pioglitazone組比較，P<0.05)

圖3RT-PCR檢測(cè)各組軟骨細(xì)胞mTOR的mRNA表達(dá)水平比較

(所有數(shù)據(jù)均以GAPDH為參數(shù))

圖4Western blot檢測(cè)各組軟骨細(xì)胞mTOR蛋白含量比較

(所有數(shù)據(jù)均以GAPDH為參數(shù))

3 討論

本研究結(jié)果顯示，LIPUS可以增加LPS誘導(dǎo)的OA軟骨細(xì)胞IGF-1的表達(dá)增高，且作用較吡格列酮強(qiáng)。IGF-1作為軟骨細(xì)胞的合成性細(xì)胞因子，是各種生長(zhǎng)因子中第一個(gè)被確認(rèn)對(duì)關(guān)節(jié)軟骨中有分泌調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，發(fā)揮合成代謝作用，在促進(jìn)細(xì)胞的生存、生長(zhǎng)和代謝中起著至關(guān)重要的作用，其分泌減少與OA的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[14-15]。IGF-1在軟骨組織工程研究中起到相當(dāng)重要的角色，主要與抑制軟骨細(xì)胞內(nèi)多個(gè)信號(hào)通路，如：磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinases,PI3K)/ 蛋白激酶(Akt)/mTOR和Ras/Raf-1/ERK信號(hào)通路，通過(guò)有絲分裂、抗凋亡作用和刺激軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的合成有關(guān)[16-17]。Li等[18]用3D技術(shù)培養(yǎng)體外軟骨細(xì)胞證明IGF-1可以促進(jìn)COL2的表達(dá)，并且認(rèn)為≤100ng/ml的IGF-1可以促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖，呈劑量依賴(lài)性。Ikeda等[19]將IGF-1基因轉(zhuǎn)染到人滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其成軟骨能力、增殖能力均明顯增強(qiáng)，并且呈現(xiàn)出高營(yíng)養(yǎng)和成骨特性，極大的促進(jìn)了對(duì)受損軟骨細(xì)胞的修復(fù)作用。研究者用吡格列酮治療30例胰島素抵抗的多囊卵巢綜合征患者后發(fā)現(xiàn)血清IGF-1水平顯著增加，這可能與直接或間接改善胰島素敏感性有關(guān)[20]。而關(guān)于LPIUS對(duì)軟骨細(xì)胞IGF-1的影響研究甚少，LIPUS可以上調(diào)骨髓來(lái)源的ST2細(xì)胞的骨鈣蛋白和IGF-1， 并刺激ST2細(xì)胞的向軟骨細(xì)胞分化[21]。Tang等[22]利用超聲微泡轉(zhuǎn)染IGF-1cDNA至軟骨細(xì)胞提高大鼠跟腱損傷愈合速度。

本研究結(jié)果顯示，LIPUS可以降低LPS誘導(dǎo)的OA軟骨細(xì)胞PGE2的表達(dá)增高，但吡格列酮作用較LIPUS強(qiáng)。PGE2被認(rèn)為是骨關(guān)節(jié)炎的促炎癥細(xì)胞因子和分解代謝介質(zhì)，可以促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)的合成，抑制COL2和蛋白多糖的生成，從而改變軟骨基質(zhì)修復(fù)和降解的平衡狀態(tài)，加重關(guān)節(jié)退化和臨床癥狀[23]。王濤等[24]使用聚焦超聲單次治療慢性軟組織30min后出現(xiàn)受損組織的PGE2含量降低，提示超聲可以較快緩解組織炎癥。而在成骨細(xì)胞中，LIPUS可以導(dǎo)致PGE2的釋放增加以及環(huán)氧合酶的表達(dá)上調(diào)[25]。Chen等[26]用高糖誘導(dǎo)人軟骨細(xì)胞PGE2，IL-6，MMP-13高表達(dá)，但這些被吡格列酮所逆轉(zhuǎn)，且呈劑量依賴(lài)性。

mTOR是一種存在于哺乳動(dòng)物中的Ser/Thr激酶，阻斷各種對(duì)軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)刺激信號(hào)，負(fù)性調(diào)控軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝，參與OA的病理學(xué)進(jìn)展[27-28]。超聲治療可以選擇性抑制巨噬細(xì)胞磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/mTOR信號(hào)通路起到抑制炎癥、抗凋亡、抗脂質(zhì)聚集作用[29]。而吡格列酮通過(guò)PPARα和PPARγ依賴(lài)性自噬途徑增加細(xì)胞脂肪分解，β-氧化和自噬減輕肝臟脂肪變性[30]。本研究結(jié)果顯示，LIPUS和吡格列酮分別可以減少LPS誘導(dǎo)的OA軟骨細(xì)胞mTOR的表達(dá)。因此，我們猜測(cè)LIPUS和吡格列酮可能通過(guò)抑制IGF-1/ mTOR/PGE2信號(hào)途徑減輕軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)，促進(jìn)受損軟骨組織修復(fù)，阻斷關(guān)節(jié)軟骨退變或骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[31]。

綜上所述，LIPUS和吡格列酮可能通過(guò)IGF-1/mTOR/PGE2信號(hào)通路上調(diào)LPS誘導(dǎo)的OA軟骨細(xì)胞IGF-1的表達(dá)，同時(shí)抑制PGE2表達(dá)，起到OA軟骨細(xì)胞保護(hù)作用。LIPUS促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的OA軟骨細(xì)胞IGF-1的表達(dá)作用較吡格列酮強(qiáng)，而吡格列酮抑制PGE2的表達(dá)作用較LIPUS強(qiáng)。

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