魏硯明，任晉宏，欒智華，王永輝

(山西中醫(yī)藥大學 1制藥與食品工程學院；2實驗中心，晉中 030619)

細胞自噬是細胞內(nèi)重要的蛋白質(zhì)降解途徑，參與多種生理功能，已經(jīng)證實細胞自噬活性失調(diào)與多種人類疾病密切相關(guān)[1-2]。判斷細胞自噬活性的最常用方法是利用Western雜交檢測內(nèi)源性微管結(jié)合蛋白1輕鏈3I(LC3I)向微管結(jié)合蛋白1輕鏈3II(LC3II)的轉(zhuǎn)化[3-4]。LC3是最早發(fā)現(xiàn)的自噬標記物，其前體經(jīng)加工后將羧基末端切除產(chǎn)生LC3I，隨后LC3I通過類泛素樣修飾的方式與自噬小體膜上的磷脂共價結(jié)合，形成LC3II[5]。LC3II的量與自噬小體數(shù)量緊密相關(guān)，是反映細胞自噬活性的關(guān)鍵指標。細胞自噬受體蛋白p62作為泛素化底物和定位于自噬小體膜上LC3之間的連接因子可以被包裹進自噬小體降解。p62蛋白表達水平的高低與自噬活性成反比，是檢測自噬活性的一個輔助指標[6]。

細胞自噬調(diào)節(jié)劑可以上調(diào)或下調(diào)自噬活性，被廣泛應(yīng)用于細胞自噬過程的解析[7-8]。由于不同的細胞自噬調(diào)節(jié)劑的作用靶點不同，其可能對LC3II和p62表達的影響存在差異；同時鑒于LC3II自身可以被自噬降解[9]，而在某些條件下，p62蛋白水平的變化與細胞自噬并無關(guān)聯(lián)[10]，這就使在解釋兩者的Western雜交結(jié)果時存在不確定性，可能導(dǎo)致對實驗結(jié)果的解析產(chǎn)生矛盾的、甚至錯誤的結(jié)論，曲解細胞自噬活性的變化及生物學意義。因此，有必要比較不同的自噬調(diào)節(jié)劑對LC3II和p62表達的影響?？紤]到細胞自噬調(diào)節(jié)劑種類繁多，作用靶點各不相同，本研究通過多種常用的自噬調(diào)節(jié)劑調(diào)控細胞自噬過程不同階段，例如利用雷帕霉素或海藻糖分別以mTOR依賴或非依賴方式誘導(dǎo)細胞自噬發(fā)生[11-12]；利用3-甲基腺嘌呤阻斷自噬小體的形成[13]；利用巴弗洛霉素A1干擾自噬小體與溶酶體的融合[14]；利用E64d和pepstatin A抑制溶酶體中組織蛋白酶活性[9]，以自噬標記物LC3II和p62作為細胞自噬活性指標，觀察不同濃度或不同作用時間的細胞自噬調(diào)節(jié)劑對其表達的影響。實驗結(jié)果有望為這些細胞自噬調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用及細胞自噬檢測結(jié)果的正確解析提供參考。

1 材 料

1.1 藥物與試劑

DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胰蛋白酶、胎牛血清、雷帕霉素(rapamycin)、海藻糖(trehalose)、3-甲基腺嘌呤(3-MA)、巴弗洛霉素A1(bafilomycin A1)、E64d、pepstatin A及鼠抗p62抗體(索萊寶科技有限公司);RIPA細胞裂解液、苯甲基磺酰氟(PMSF)、兔抗LC3抗體、羊抗actin抗體、蛋白酶抑制劑及化學發(fā)光試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)；CCK8試劑盒(日本同仁化學研究所)。

1.2 儀 器

酶聯(lián)免疫檢測儀(美國伯騰公司)；冷凍離心機(美國Sigma公司)；電泳儀(美國伯樂公司)。

1.3 細胞株

HEK293細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

2 方 法

2.1 細胞培養(yǎng)

HEK293細胞置于含10%胎牛血清，100 μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素的DMEM培養(yǎng)基中,于含5%CO2,95%空氣的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 藥物處理

取生長狀態(tài)良好的HEK293細胞，吸去培養(yǎng)基后，分別換成含有不同濃度的雷帕霉素、海藻糖、3-甲基腺嘌呤、巴弗洛霉素A1或E64d和pepstatin A的新鮮培養(yǎng)基，對照組添加對應(yīng)的溶劑。孵育指定時間后，收集、裂解細胞。雷帕霉素、巴弗洛霉素A1、E64d和pepstatin A溶于DMSO中，海藻糖溶于水中，3-甲基腺嘌呤于使用前直接溶于培養(yǎng)基中。

2.3 細胞裂解

細胞經(jīng)預(yù)冷的PBS漂洗后，加入含蛋白酶抑制劑及1 mmol/L PMSF的RIPA裂解液(1% NP-40，50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，150 mmol/L NaCl，0.25%脫氧膽酸，1 mmol/L EDTA)，冰上裂解15 min。用移液器將細胞吹打起來后轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，23號針頭反復(fù)吹打破碎細胞，4 ℃條件下，3 302 r/min離心10 min，取上清液，BCA法測定上清蛋白濃度。

2.4 Western雜交檢測LC3II和p62表達水平

細胞裂解液與5×SDS上樣緩沖液混勻后，95 ℃加熱5 min使蛋白質(zhì)變性，用于SDS-PAGE。隨后，蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。室溫下，經(jīng)含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h后，4℃條件下孵育一抗過夜后，室溫條件下分別與相應(yīng)的連接有辣根過氧化物酶的二抗孵育1 h，用TBST洗去未發(fā)生結(jié)合的二抗。利用化學發(fā)光試劑盒顯影蛋白條帶。膠片經(jīng)掃描后，利用Image J定量對應(yīng)條帶的強度。

2.5 細胞毒性實驗

將HEK293細胞接種于96孔板中，24 h后加入自噬調(diào)節(jié)劑處理，繼續(xù)培養(yǎng)指定時間，按照CCK8試劑盒說明書檢測自噬調(diào)節(jié)劑對細胞的毒性作用。

2.6 統(tǒng)計學分析

3 結(jié) 果

3.1 自噬活化劑對自噬標記物的影響

3.1.1 雷帕霉素對自噬標記物的影響 雷帕霉素作為一種應(yīng)用廣泛的自噬活化劑，其可以使mTOR激酶失活，下調(diào)p70 S6激酶活性，降低核糖體蛋白S6的磷酸化程度，從而上調(diào)自噬活性[11]。HEK293細胞經(jīng)不同濃度的雷帕霉素處理24 h后，Western雜交檢測LC3II和p62的表達，結(jié)果顯示雷帕霉素可以上調(diào)LC3II的表達，并且具有劑量依賴性；類似地，雷帕霉素可劑量依賴性地降低HEK293細胞中p62的表達(圖1-A，B)。為了比較雷帕霉素不同處理時間對LC3II和p62表達的影響，HEK293細胞經(jīng)100 nmol/L雷帕霉素處理12、24或48 h后，檢測LC3II和p62的表達，結(jié)果表明不同處理時間均引起LC3II表達顯著增多(P<0.05)，并隨著處理時間的延長，LC3II表達增加；而在經(jīng)雷帕霉素處理12 h 的HEK293細胞中未觀察到p62的表達有明顯變化，但隨著處理時間的延長，p62的表達顯著降低(P<0.05)(圖1-C，D)。

A，B：Incubated with rapamycin at different concentration for 24 h;C,D:Incubated with rapamycin (100 nmol/L) after different duration

*P<0.05vscontrol group

3.1.2 海藻糖對自噬標記物的影響 海藻糖是一種非還原性雙糖，其以一種mTOR非依賴性的方式增強自噬活性[12]。HEK293細胞經(jīng)不同濃度海藻糖處理24 h后，Western雜交檢測LC3II和p62的表達，結(jié)果顯示海藻糖可以上調(diào)LC3II的表達，而p62的表達未觀察到明顯變化(圖2-A，B)。此外，利用20 mmol/L海藻糖處理HEK293細胞不同時間，觀察到海藻糖可以時間依賴性地增強LC3II的表達；類似地，其對p62的表達沒有明顯影響(圖2-C，D)。

A，B：Incubated with trehalose at different concentration for 24 h;C,D:Incubated with trehalose (20 mmol/L) after different duration

*P<0.05vscontrol group

3.2 自噬抑制劑對自噬標記物的影響

3.2.1 3-甲基腺嘌呤對自噬標記物的影響 3-甲基腺嘌呤通過特異抑制PI3KIII的激酶活性，阻斷自噬小體的形成[13]。HEK293細胞經(jīng)不同濃度的3-甲基腺嘌呤處理24 h后，Western雜交檢測LC3II和p62的表達，結(jié)果表明隨著3-甲基腺嘌呤濃度的增加，LC3II和p62的表達均明顯增加(圖3-A，B)。同樣地，利用5 mmol/L 3-甲基腺嘌呤處理HEK293細胞不同時間，LC3II和p62的表達呈現(xiàn)時間依賴性地增加(圖3-C，D)。

A，B：Incubated with 3-MA at different concentration for 24 h;C,D:Incubated with 3-MA (5 mmol/L) after different duration

*P<0.05vscontrol group

3.2.2 巴弗洛霉素A1對自噬標記物的影響 巴弗洛霉素A1可特異地抑制液泡膜上的氫離子ATP酶，使溶酶體腔內(nèi)不能酸性化，從而干擾自噬小體與溶酶體的融合[14]。利用不同濃度的巴弗洛霉素A1處理HEK293細胞24 h后，檢測LC3II和p62的表達，結(jié)果顯示巴弗洛霉素A1可顯著增加LC3II和p62的表達(P<0.05)，并呈現(xiàn)劑量依賴性(圖4-A，B)。利用40 nmol/L巴弗洛霉素A1處理HEK293細胞不同時間后，檢測LC3II和p62的表達，結(jié)果顯示巴弗洛霉素A1可時間依賴性地增加LC3II和p62的表達(圖4-C，D)。

A，B：Incubated with bafilomycin A1 at different concentration for 24 h;C,D:Incubated with bafilomycin A1 (5 mmol/L) after different duration

*P<0.05vscontrol group

3.2.3 E64d和pepstatin A對自噬標記物的影響 E64d是一種膜通透性的組織蛋白酶B、H和L抑制劑；pepstatin A是組織蛋白酶D和E抑制劑[9]。不同濃度的E64d和pepstatin A共同處理HEK293細胞24 h后，檢測LC3II和p62的表達，結(jié)果顯示E64d和pepstatin A可顯著增強兩者的表達(P<0.05)，并呈現(xiàn)劑量依賴性(圖5-A，B)。利用E64d和pepstatin A各20 μg/mL同時處理HEK293細胞不同時間，觀察不同作用時間對LC3II和p62表達的影響，結(jié)果顯示E64d和pepstatin A可時間依賴性地上調(diào)LC3II和p62的表達(圖5-C，D)。

3.3 細胞自噬調(diào)節(jié)劑的細胞毒性

為明確上述細胞自噬調(diào)節(jié)劑是否影響細胞活性，HEK293細胞經(jīng)不同濃度或不同時間雷帕霉素處理后，檢測細胞存活率，結(jié)果表明不同濃度或處理時間的雷帕霉素對細胞活性均無明顯影響(圖6)。同樣地，HEK293細胞經(jīng)不同濃度或不同時間的海藻糖、3-甲基腺嘌呤、巴弗洛霉素A1以及E64d和pepstatin A處理后，均未觀察到對HEK293細胞有明顯的毒性作用(結(jié)果未顯示)。

A，B：Incubated with E64d and pepstatin A at different concentration for 24 h;C,D:Incubated with E64d (20 μg/mL)+pepstatin A (20 μg/mL) after different duration

*P<0.05vscontrol group

The value in rapamycin treated cells was shown as a percentage of the corresponding one in control cell,which was set as 100%

A，B：Incubated with rapamycin at different concentration for 24 h;C,D:Incubated with rapamycin (100 nmol/L) after different duration

4 討 論

由于細胞自噬活性檢測中分析方法或標準的差異，可能引起對實驗結(jié)果的誤讀[9,15-16]。本實驗中利用雷帕霉素或海藻糖誘導(dǎo)自噬小體形成；或者利用3-甲基腺嘌呤抑制自噬起始階段、巴弗洛霉素A1抑制自噬小體與溶酶體的融合以及E64d和pepstatin A阻斷自噬溶酶體的降解過程，均引起LC3II表達水平明顯升高。因此，LC3II的增多既可反映自噬活性增強引起的自噬小體數(shù)量增加，也可能是由于自噬小體與溶酶體融合受阻或者自噬溶酶體的降解受阻引起的。一般情況下，LC3I的表達量比較穩(wěn)定，但在5和10 mmol/L 3-甲基腺嘌呤處理組中其表達量與其他組有較大差別(圖3-A)，這可能與不同處理條件下自噬活性狀態(tài)不同相關(guān)，但具體原因仍待進一步深入研究。

為了明確自噬活性的變化，通常結(jié)合觀察自噬特異降解底物p62的表達。抑制細胞自噬的各個階段時，LC3II的堆積伴隨著p62表達的明顯升高，并且呈現(xiàn)時間和劑量依賴性；而利用雷帕霉素誘導(dǎo)細胞自噬活性，促進p62降解，并且與LC3II的增多相比，p62的減少具有滯后性，例如在誘導(dǎo)自噬的早期，LC3II升高的同時未能檢測到p62下調(diào)，提示清除作為自噬底物的p62需要較長時間，這可能與雷帕霉素誘導(dǎo)自噬的能力相對較慢有關(guān)[3]，也可能和p62與自噬小體膜結(jié)合不夠緊密相關(guān)[6]。

通過同時檢測LC3II和p62來判斷自噬活性的方法具有一定的局限性。由于自噬過程中LC3II被溶酶體中的水解酶降解[9]，如果LC3II的溶酶體降解速度遠小于自噬小體形成速度，LC3II水平的升高代表自噬的活化，而LC3II的表達在不同細胞中具有差異性，如果在某些細胞中自噬的本底水平較高，自噬活化時形成的LC3II被迅速降解，LC3II水平保持不變甚至降低，則其不能真實準確反映自噬的活化。另外，p62作為自噬標記物，尤其是作為自噬活化時的標記物時，由于表達變化的滯后性，同時其他自噬非依賴途徑參與了p62代謝[10]，其可能不能準確反映真實的自噬狀態(tài)。盡管同樣作為自噬誘導(dǎo)劑，但雷帕霉素和海藻糖對LC3II和p62表達的影響存在差異。海藻糖可以上調(diào)LC3II的表達，但對p62的表達未見明顯影響，這可能是由于與雷帕霉素相比，海藻糖增強自噬活性的能力較弱，也可能與細胞系相關(guān)[17]。

最后，由于LC3II和p62的堆積可以是阻斷細胞自噬的不同階段引起的，目前還難以區(qū)分具體是哪一步驟受到抑制。因此，要客觀評價細胞自噬狀態(tài)也可選擇其他多種方法綜合評定，包括觀察自噬小體的超微結(jié)構(gòu)或長壽命蛋白的自噬性降解等[3-4,18]。

總之，本研究比較了多種調(diào)控細胞自噬不同階段的調(diào)節(jié)劑對自噬標記物LC3II和p62表達的影響，結(jié)果驗證了LC3II和p62的表達在細胞自噬的不同階段均受到嚴格調(diào)控，不同的自噬調(diào)節(jié)劑對其表達的調(diào)控存在明顯差異，為利用兩者表達的變化解析細胞自噬活性檢測結(jié)果及篩選新型自噬調(diào)節(jié)劑提供了參考。

參 考 文 獻

[1] Choi AM,Ryter SW,Levine B.Autophagy in human health and disease[J].NEnglJMed,2013,368(7):651-662.

[2] Schneider JL,Cuervo AM.Autophagy and human disease:emerging themes[J].CurrOpinGenetDev,2014,26:16-23.

[3] Klionsky D,Abdalla F,Abeliovich H,etal.Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy in higher eukaryotes[J].Autophagy,2012,8(4):445-544.

[4] Klionsky D,Cuervo A,Seglen P.Methods for monitoring autophagy from yeast to human[J].Autophagy,2007,3(3):181-206.

[5] Kabeya Y,Mizushima N,Ueno T,etal.LC3,a mammalian homologue of yeast Apg8p,is localized in autophagosome membranes after processing[J].EMBOJ,2000,19(21):5720-5728.

[6] Ichimura Y,Kominami E,Tanaka K,etal.Selective turnover of p62/A170/SQSTM1 by autophagy[J].Autophagy,2008,4(8):1063-1066.

[7] Law BY,Mok SW,Wu AG,etal.New potential pharmacological functions of Chinese herbal medicines via regulation of autophagy[J].Molecules,2016,21(3):359.

[8] Cheng Y,Ren X,Hait WN,etal.Therapeutic targeting of autophagy in disease:biology and pharmacology[J].PharmacolRev,2013,65(4):1162-1197.

[9] Tanida I,Minematsu-Ikeguchi N,Ueno T,etal.Lysosomal turnover,but not a cellular level,of endogenous LC3 is a marker for autophagy[J].Autophagy,2005,1(2):84-91.

[10] Kuusisto E,Suuronen T,Salminen A.Ubiquitin-binding protein p62 expression is induced during apoptosis and proteasomal inhibition in neuronal cells[J].BiochemBiophysResCommun,2001,280(1):223-228.

[11] Gao L,Lv G,Guo X,etal.Activation of autophagy protects against cholestasis-induced hepatic injury[J].CellBiosci,2014,4:47.

[12] Tang Q,Zheng G,Feng Z,etal.Trehalose ameliorates oxidative stress-mediated mitochondrial dysfunction and ER stress via selective autophagy stimulation and autophagic flux restoration in osteoarthritis development[J].CellDeathDis,2017,8(10):e3081.

[13] Wu Y,Wang X,Guo H,etal.Synthesis and screening of 3-MA derivatives for autophagy inhibitors[J].Autophagy,2013,9(4):595-603.

[14] Yu M,Xu X,Jiang N,etal.Dehydropachymic acid decreases bafilomycin A1 induced β-amyloid accumulation in PC12 cells[J].JEthnopharmacol,2017,198:167-173.

[15] Gottlieb R,Andres A,Sin J,etal.Untangling autophagy measurements:all fluxed up[J].CircRes,2015,116(3):504-514.

[16] Mizushima N,Yoshimori T.How to interapret LC3 immunoblotting[J].Autophagy,2007,3(6):542-545.

[17] Honma Y,Sato-Morita M,Katsuki Y,etal.Trehalose activates autophagy and decreases proteasome inhibitor-induced endoplasmic reticulum stress and oxidative stress-mediated cytotoxicity in hepatocytes[J].HepatolRes,2018,48(1):94-105.

[18] Lyu X,Hu Z.New methods to detect autophagic flux[J].ActaPharmSin(藥學學報),2016,51(1):45-51.