趙夢鴿，楊慧敏，蔣翠花，張 健*，殷志琦

(1中國藥科大學(xué)天然藥物化學(xué)教研室&天然藥物活性組分與藥效國家重點實驗室，南京 210009；2江蘇省中醫(yī)藥研究院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)實驗室，南京 210028)

非酒精性脂肪肝(NAFLD)是指在除酒精和其他明確的損肝因素(如毒素或藥物)所致的以肝實質(zhì)細(xì)胞脂肪變性為主要表現(xiàn)的臨床病理綜合征，包括單純性脂肪肝以及由其演變的脂肪肝炎、脂肪肝纖維化和肝硬化[1]。近年來，隨著人們生活水平的提高和飲食方式的改變，NAFLD發(fā)病率逐漸升高[2]。NAFLD的發(fā)生與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，核因子相關(guān)因子2(Nrf2)-抗氧化反應(yīng)元件(ARE)通路是目前研究發(fā)現(xiàn)的重要內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激信號通路，Nrf2激活后能調(diào)控下游第Ⅱ相解毒酶的表達(dá)，發(fā)揮抗氧化作用，從而保護(hù)肝臟[3-4]，因此改善氧化應(yīng)激的藥物可能具有治療NAFLD的作用[5]。

青錢柳[Cyclocaryapaliurus(Batal)Ijinskaja]又名搖錢樹、麻柳，為胡桃科青錢柳屬植物，是我國特有珍稀樹種資源[6]?，F(xiàn)代藥理研究表明，青錢柳能夠改善胰島素抵抗，具有降血糖和降血脂等作用[6-8]。本課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)富含三萜化合物的青錢柳氯仿提取物具有抗氧化作用，能夠改善NAFLD[9-10]。青錢柳葉含有大量的三萜成分如阿江欖仁酸、齊墩果酸、熊果酸、青錢柳酸A和青錢柳酸B等[11-12]，而青錢柳三萜化合物(圖1)是否為治療NAFLD的有效成分，目前尚不清楚。本文擬通過混合脂肪酸(FFAs)誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞模型研究青錢柳三萜化合物對NAFLD的作用，并探討其可能的機(jī)制。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

供篩選的11個青錢柳三萜化合物分別為：2α,3β,19α,23-四羥基-12-烯-28-烏蘇酸(1)、1α,2α,3α,23-四羥基-12-烯-28-烏蘇酸(2)、3β,23-二羥基-12-烯-28-烏蘇酸(3)、2α,3α,23-三羥基-12,20(30)-二烯-28-烏蘇酸(4，TUA)、2α,3α,23-三羥基-12-烯-28-烏蘇酸(5)、青錢柳酸B(6)、2α,3β,23-三羥基-11,13(18)-二烯-28-齊墩果酸(7)、阿江欖仁酸(8)、cyclocarioside J(9)、cylocarioside H (10)、青錢柳苷C(11) (HPLC面積歸一化法測定純度大于98%，中國藥科大學(xué)天然藥化教研室自制)；胎牛血清(美國ScienCell公司，批號：20825)；DMEM、胰蛋白酶、噻唑藍(lán)(MTT)(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)；牛血清白蛋白(BSA)、油酸和棕櫚酸(美國Sigma Aldrich公司)；三酰甘油(TG)檢測試劑盒、油紅O染液、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒、丙二醛(MDA)檢測試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒(南京建成生物工程研究所)；細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞質(zhì)蛋白抽提試劑盒、PMSF、ROS檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)；鴉膽子苦醇(brusatol,成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司)；兔抗Nrf2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2)多克隆抗體、兔抗HO-1(heme oxygenase-1)多克隆抗體、兔抗NQO-1[NAD(P)H quinone oxidoreductase]多克隆抗體(美國Abcam公司)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀 器

全波長多功能酶標(biāo)儀(美國賽默飛世爾科技有限公司)；超速控溫離心機(jī)(美國Beckman Coulter公司)；熒光倒置顯微鏡(德國Carl Zeiss公司)；A101439電泳儀(美國Bio Rad公司)。

1.3 細(xì)胞株

人肝癌細(xì)胞株HepG2，購自ATCC細(xì)胞庫。HepG2細(xì)胞用含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的飽和濕度條件下培養(yǎng)，每隔3天用0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，按1∶2比例進(jìn)行傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實驗。

Figure1 Structures of the triterpenoids fromCyclocaryapaliurus

2 方 法

2.1 脂肪變性模型建立及藥物的配制

稱取一定量的油酸和棕櫚酸(物質(zhì)的量比為2∶1)混合后置于0.1 mol/L NaOH溶液中，70 ℃水浴直至完全溶解，配成100 mmol/L混合脂肪酸溶液。然后用10% BSA溶液稀釋，配成濃度為5 mmol/L 的混合脂肪酸儲備液，0.22 μm濾膜過濾待用。混合脂肪酸使用終濃度為1 mmol/L，與細(xì)胞共孵育24 h后，建立脂肪變性細(xì)胞模型。

取一定量的青錢柳三萜化合物1～11，先用DMSO溶解至一定濃度，使DMSO濃度不超過藥物最終使用濃度的千分之一，然后用DMEM稀釋至相應(yīng)濃度。

2.2 青錢柳三萜化合物活性成分篩選

2.2.1 青錢柳三萜化合物細(xì)胞毒性篩選 取生長狀態(tài)良好的HepG2細(xì)胞進(jìn)行消化傳代，以每孔1×104個細(xì)胞接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后吸去培養(yǎng)基，加入不含血清的DMEM饑餓8 h后，分別給予10 μmol/L青錢柳三萜化合物1～11，空白組(Blank)加入不含血清的DMEM培養(yǎng)基，孵育24 h后吸去培養(yǎng)基，每孔加入5 mg/mL MTT 20 μL，孵育4 h，吸去上清液，加入DMSO 150 μL，酶標(biāo)儀測定490 nm處的吸收度，計算細(xì)胞活力，實驗平行3次。篩選無明顯細(xì)胞毒性的化合物進(jìn)行進(jìn)一步活性篩選。

2.2.2 青錢柳三萜化合物對細(xì)胞內(nèi)TG和SOD活力的影響 將HepG2細(xì)胞接種于24孔板，分別設(shè)置空白組(Blank)、模型組(Model)和青錢柳三萜化合物給藥組(10 μmol/L)?？瞻捉M每孔加入含10% BSA的DMEM培養(yǎng)基，模型組每孔加入1 mmol/L FFAs的DMEM培養(yǎng)基，給藥組每孔分別加入含1 mmol/L的FFAs和10 μmol/L青錢柳三萜化合物的DMEM培養(yǎng)基，孵育24 h后，試劑盒測定細(xì)胞胞漿中TG的含量和SOD的活性，細(xì)胞內(nèi)總蛋白含量用BCA蛋白定量試劑盒測定，實驗平行3次。篩選降脂和抗氧化活性較好的化合物進(jìn)行后繼機(jī)制探討。

2.3 MTT法測定青錢柳三萜化合物對HepG2細(xì)胞活力的影響

MTT法測定1、5、10 μmol/L青錢柳三萜化合物對HepG2細(xì)胞存活率的影響，實驗方法同“2.2.1”項。

2.4 油紅O染色觀察HepG2細(xì)胞內(nèi)的脂滴積累

HepG2細(xì)胞接種于24孔板，分別設(shè)置空白組(Blank)、模型組(Model)和青錢柳三萜化合物給藥組(1、5、10 μmol/L)和青錢柳三萜化合物+抑制劑組(10 μmol/L+40 nmol/L)。空白組每孔加入含10% BSA的DMEM培養(yǎng)基，模型組每孔加入含1 mmol/L FFAs的DMEM培養(yǎng)基，青錢柳三萜化合物給藥組每孔分別含1 mmol/L FFAs和各濃度青錢柳三萜化合物的DMEM培養(yǎng)基，青錢柳三萜化合物 +抑制劑組加入含1 mmol/L混合脂肪酸和10 μmol/L青錢柳三萜化合物以及40 nmol/L鴉膽子苦醇的DMEM培養(yǎng)基，孵育24 h后，去除培養(yǎng)液，PBS洗滌2遍，4%多聚甲醛固定15 min，棄去多聚甲醛，PBS潤洗3遍，加入油紅O工作液染色，染色15 min，棄去油紅O染液，PBS洗3遍，在顯微鏡下觀察染色效果并拍照，然后用異丙醇洗脫細(xì)胞中的油紅O染液并收集，在510 nm處用酶標(biāo)儀測定其吸收度，實驗平行3次。

2.5 HepG2細(xì)胞內(nèi)TG含量、MDA含量和SOD活性的測定

將對數(shù)期的細(xì)胞消化后接種于24孔板中，分組給藥方法同“2.4”項，孵育24 h后，試劑盒測定細(xì)胞中TG、MDA的含量SOD的活性，細(xì)胞內(nèi)總蛋白含量用BCA蛋白定量試劑盒測定，實驗平行3次。

2.6 細(xì)胞內(nèi)ROS含量檢測

接種單層細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板中，分組給藥方法同“2.4”項，培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，PBS洗2遍，加入DCFH-DA熒光探針，于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育20 min，PBS清洗3次以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA探針，然后用全波長多功能酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm，實驗平行3次。

2.7 Western blot分析

HepG2細(xì)胞以每孔1×106個細(xì)胞接種于6孔板中，分組給藥方法同“2.4”項，培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，PBS洗2遍，用試劑盒提取細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞質(zhì)蛋白，BCA法測定蛋白濃度后，將蛋白質(zhì)樣品稀釋至相同且合適的濃度進(jìn)行SDS-PAGE(電泳時間：85 V、20 min；120 V、80 min)，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上在5%脫脂奶粉封閉液中室溫封閉1 h，加入一抗(1∶1 000) 4 ℃過夜，之后加入二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，采用電化學(xué)發(fā)光檢測法(ECL法)顯色檢測抗氧化相關(guān)蛋白Nrf2、HO-1和NQO-1的表達(dá)情況。對感光膠片條帶進(jìn)行灰度分析，以目的條帶與內(nèi)參照條帶β-actin的比值或核內(nèi)參Lamin B1的比值代表目的蛋白的相對表達(dá)量。

2.8 數(shù)據(jù)分析

3 結(jié) 果

3.1 青錢柳三萜化合物活性成分篩選

3.1.1 青錢柳三萜化合物對細(xì)胞活力的影響 MTT實驗結(jié)果顯示，與空白組相比，青錢柳三萜化合物3、10和11的細(xì)胞活力均低于80%，具有明顯的細(xì)胞毒性(P<0.01)；化合物1、2、4、5、6、7、8和9的細(xì)胞活力均在90%，無明顯的細(xì)胞毒性，故選擇這些化合物進(jìn)行活性篩選(圖 2-A)。

3.1.2 青錢柳三萜化合物降脂作用考察 如圖2-B所示，模型組與空白組相比細(xì)胞內(nèi)TG含量明顯升高，具有顯著性差異(P<0.01)，表明1 mmol/L混合脂肪酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂肪堆積模型建立成功。與模型組相比，化合物2、4、5、6和9均能顯著減少細(xì)胞內(nèi)TG含量，其中化合物4(TUA)降TG效果最佳。

3.1.3 青錢柳三萜化合物抗氧化活性考察 HepG2細(xì)胞經(jīng)混合脂肪酸刺激后，與空白組相比，HepG2細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶SOD活性顯著下降(P<0.01)。與模型組相比，化合物2、4、5、6和9能夠顯著增加HepG2細(xì)胞SOD活性且化合物4(TUA)的抗氧化活性最好(圖2-C)。

綜上所述，化合物4(TUA)具有較好的降脂和抗氧化活性，故進(jìn)一步考察其對NAFLD的干預(yù)作用和可能機(jī)制。

A：Cell viability measured by MTT assay；B:Intracellular tiglyceride (TG) content determined by the assay kits;C:Superoxid dismutase (SOD) activity determined by the assay kits

##P<0.01vsblank group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group

3.2 TUA對細(xì)胞活力的影響

通過MTT檢測不同濃度的TUA對HepG2細(xì)胞存活率的影響，篩選出對細(xì)胞毒性較小的樣品濃度作為實驗的加藥濃度。如圖3所示，1和5 μmol/L的TUA加入HepG2細(xì)胞24 h后，細(xì)胞存活率均在90%以上，結(jié)合圖2-A實驗結(jié)果，說明10 μmol/L及以下濃度的TUA無明顯的細(xì)胞毒性，因此后續(xù)實驗的給藥濃度設(shè)定在1～10 μmol/L之間。

3.3 TUA對HepG2細(xì)胞中脂質(zhì)蓄積的改善作用

3.3.1 TUA對HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積的作用 油紅O染色結(jié)果顯示，空白組中HepG2細(xì)胞邊緣清晰，未見紅色油滴沉積；與空白組相比，模型組中HepG2細(xì)胞內(nèi)可見明顯的紅色脂滴環(huán)繞于胞核周圍，脂肪堆積明顯(P<0.01)，而藥物組與模型組相比隨著TUA給藥劑量的增加，HepG2細(xì)胞紅色脂滴的數(shù)量逐漸減少，且脂滴變小，顏色變淺。當(dāng)TUA濃度為10 μmol/L時，HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積和脂滴的數(shù)量顯著下降(P<0.05)。當(dāng)同時加入TUA(10 μmol/L)和Nrf2抑制劑鴉膽子苦醇后，HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積和脂滴的數(shù)量與TUA(10 μmol/L)組相比顯著增加，表明TUA可以改善脂質(zhì)堆積(圖4-A、4-B)。

3.3.2 TUA對HepG2細(xì)胞TG的作用 如圖4-C所示，模型組與空白組相比TG含量明顯升高，具有顯著性差異(P<0.01)。在1～10 μmol/L濃度范圍內(nèi)隨TUA給藥濃度的增加，與空白組相比，HepG2細(xì)胞內(nèi)TG的含量逐漸降低，表現(xiàn)明顯的濃度依賴性。當(dāng)TUA濃度為10 μmol/L時，細(xì)胞內(nèi)TG的含量顯著下降(P<0.05)，TG的清除率達(dá)19.4%。與TUA(10 μmol/L)組相比，而TUA(10 μmol/L)+鴉膽子苦醇組細(xì)胞內(nèi)TG的含量顯著增加，表明TUA的降脂作用可能與Nrf2信號通路有關(guān)。綜上可知，TUA具有良好的體外降脂活性，可能對脂肪肝具有一定的防治作用。

3.4 TUA對HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

3.4.1 TUA對ROS含量的影響 DCFH-DA熒光探針與各組細(xì)胞共孵育后，模型組細(xì)胞內(nèi)ROS與空白組相比顯著增加(P<0.01)，當(dāng)給予10 μmol/L TUA后，細(xì)胞內(nèi)ROS與模型組相比顯著降低(P<0.05)，而TUA(10 μmol/L)+鴉膽子苦醇組與TUA(10 μmol/L)組相比，細(xì)胞內(nèi)ROS顯著增加(圖5-A)。

3.4.2 TUA對抗氧化酶SOD活性及脂質(zhì)過氧化物MDA的影響 HepG2細(xì)胞經(jīng)混合脂肪酸刺激后，與空白組相比，抗氧化酶SOD活力顯著下降(P<0.01)而脂質(zhì)過氧化物MDA的含量卻明顯增加(P<0.01)(圖5-B、5-C)。不同劑量的TUA干預(yù)后，與模型組相比，細(xì)胞內(nèi)SOD活力明顯升高(P<0.01)，脂質(zhì)過氧化物MDA的含量逐漸下降，當(dāng)給藥濃度為10 μmol/L時，細(xì)胞內(nèi)MDA的含量顯著下降(P<0.05)。當(dāng)加入Nrf2抑制劑鴉膽子苦醇后，與TUA(10 μmol/L)組相比，細(xì)胞內(nèi)SOD活力明顯降低而細(xì)胞內(nèi)MDA的含量顯著增加。

Figure4 Effect of TUA (10 μmol/L) on lipid accumulation in FFAs-induced hepatic steatosis cells

##P<0.01vsblank group;*P<0.05vsmodel group

ROS:reactive oxygen species;MDA:malondialdehyde

##P<0.01vsblank group;*P<0.05;**P<0.01vsmodel group;&&P<0.01vsTUA group

3.5 TUA對HepG2細(xì)胞抗氧化相關(guān)蛋白的影響

如圖6-A～6-D所示，與模型組相比，TUA能夠提高混合脂肪誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞內(nèi)Nrf2和Nrf2所調(diào)控的抗氧化酶HO-1和NQO-1的蛋白表達(dá)量；當(dāng)TUA達(dá)到10 μmol/L時，Nrf2、HO-1和NQO1的蛋白表達(dá)量顯著增加(P<0.01)；加入Nrf2的抑制劑鴉膽子苦醇后，同TUA(10 μmol/L)組相比，Nrf2、HO-1和NQO1的蛋白表達(dá)量均顯著降低。如圖6-E和6-F顯示，與空白組相比，10 μmol/L的TUA能夠顯著增加Nrf2從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)入細(xì)胞核(P<0.01)，當(dāng)加入鴉膽子苦醇后，Nrf2從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)入細(xì)胞核的量顯著降低(P<0.01)，且細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的Nrf2表達(dá)量均降低。上述實驗結(jié)果表明，TUA可能具有激活Nrf2的作用，增加Nrf2的入核，從而提高其介導(dǎo)的抗氧化酶的表達(dá),發(fā)揮抗氧化的作用。

A-D:Protein levels of Nrf2,HO-1 and NQO-1 were measured by Western blot in HepG2 cells treated with indicated concentrations of TUA with or without FFAs in the absence or presence of Nrf2 inhibitor brusatol;E,F:Cytosolic and nuclear levels of Nrf2 were analyzed in HepG2 cells treated with indicated concentrations of TUA in the absence or presence of Nrf2 inhibitor brusatol

##P<0.01vsblank group;**P<0.01vsmodel group;&&P<0.01vsTUA group

4 討 論

本研究采用FFAs刺激HepG2細(xì)胞，建立肝細(xì)胞脂肪變性模型，評價了11個青錢柳三萜化合物的生物活性，實驗結(jié)果顯示化合物4(TUA)具有良好降脂和抗氧化活性，其機(jī)制可能是通過激活Nrf2-ARE通路，提高Nrf2介導(dǎo)的抗氧化酶表達(dá)，從而改善肝臟脂肪變性。

本實驗用1.0 mmol/L油酸和棕櫚酸(物質(zhì)的量比為2∶1)的游離脂肪酸作用于HepG2細(xì)胞24 h后，HepG2細(xì)胞中脂滴積累明顯，ROS和MDA含量增加而SOD的活力下降，這與文獻(xiàn)[13-14]等結(jié)果一致，表明肝細(xì)胞脂肪變性模型建立成功。

本研究共篩選了11個青錢柳三萜化合物的降脂和抗氧化活性?；衔?～5為烏蘇烷型三萜苷元，化合物4(TUA)的降脂和抗氧化效果最佳，化合物2和5也有降脂和抗氧化活性，且化合物2的活性略優(yōu)于化合物5，說明烏蘇烷型三萜苷元藥效較好，30位環(huán)外雙鍵、A環(huán)3位α羥基和羥基個數(shù)對活性有影響?；衔?～8為齊墩果烷型三萜苷元，化合物6具有降脂和抗氧化作用，但其作用低于化合物4，說明齊墩果烷型降脂和抗氧化活性不如烏蘇烷型，齊墩果烷型中3位氧化成羰基對其活性有利?；衔?～11為達(dá)瑪烷型三萜皂苷，化合物9也具有一定降脂和抗氧化效果，說明達(dá)瑪烷型三萜皂苷A環(huán)開環(huán)的化合物降脂和抗氧化活性優(yōu)于A環(huán)閉環(huán)的化合物。

本實驗發(fā)現(xiàn)TUA可顯著減少HepG2細(xì)胞中脂質(zhì)積累，降低ROS和MDA的含量并且增加SOD的活性，而鴉膽子苦醇可阻斷這些作用，說明表明TUA可能是通過激活Nrf2保護(hù)肝臟，使其免受氧化應(yīng)激損傷。

已有研究表明HO-1和NQO-1在調(diào)控肝臟ROS水平方面發(fā)揮著重要的作用，且HO-1和NQO-1主要受Nrf2-ARE通路調(diào)控[15]。正常生理狀況下，Nrf2在細(xì)胞質(zhì)中與胞漿蛋白伴侶分子Keap1結(jié)合處于被抑制狀態(tài)，當(dāng)發(fā)生氧化應(yīng)激時，親電子試劑或促氧化劑直接作用于Keap1的半胱氨酸殘基，使Nrf2與其解偶聯(lián)進(jìn)入細(xì)胞核，與ARE結(jié)合，從而調(diào)控HO-1和NQO-1表達(dá)[16]。本實驗中發(fā)現(xiàn)TUA能夠顯著增加混合脂肪酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞中Nrf2、HO-1和NQO-1的蛋白表達(dá)，但當(dāng)給予Nrf2的抑制劑鴉膽子苦醇干預(yù)后，Nrf2、HO-1和NQO-1的蛋白表達(dá)量降低。此外，TUA能夠增加細(xì)胞核中的Nrf2表達(dá)而減少細(xì)胞質(zhì)中的Nrf2的表達(dá)，增加Nrf2的入核，但當(dāng)加入Nrf2的抑制劑鴉膽子苦醇后，Nrf2的入核減少，且細(xì)胞質(zhì)中的Nrf2表達(dá)量也減少，這可能與鴉膽子苦醇抑制Nrf2的作用機(jī)制有關(guān)。以上結(jié)果表明，TUA可能是通過激活Nrf2，增加Nrf2入核，從而活化Nrf2-ARE通路抵抗氧化應(yīng)激，緩解NAFLD的發(fā)生。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] Hardy T,Oakley F,Anstee QM,etal.Nonalcoholic fatty liver disease:pathogenesis and disease spectrum[J].AnnuRevPathol,2016,11:451-496.

[2] Gariani K,Philippe J,Jornayvaz FR.Non-alcoholic fatty liver disease and insulin resistance:from bench to bedside[J].DiabetesMetab,2013,39(1):16-26.

[3] Spahis S,Delvin E,Borys JM,etal.Oxidative stress as a critical factor in nonalcoholic fatty liver disease pathogenesis[J].AntioxidRedoxSign,2017,26(10):519-541.

[4] Ma Q.Role of Nrf2 in oxidative stress and toxicity[J].AnnuRevPharmacol,2013,53:401-426.

[5] Li WW,Ma FF,Zhang LY,etal.S-Propargyl-cysteine exerts a novel protective effect on methionine and choline deficient diet-induced fatty liver via Akt/Nrf2/HO-1 pathway[J].OxidMediCellLongev,2016,2016:4690857.

[6] Wang QQ,Jiang CH,Fang SZ,etal.Antihyperglycemic,antihyperlipidemic and antioxidant effects of ethanol and aqueous extracts ofCyclocaryapaliurusleaves in type 2 diabetic rats[J].JEthnopharmacol,2013,150(3):1119-1127.

[7] Wu ZF,Gao TH,Zhong RL,etal.Antihyperlipidaemic effect of triterpenic acid-enriched fraction fromCyclocaryapaliurusleaves in hyperlipidaemic rats[J].PharmBiol,2017,55(1):712-721.

[8] Jiang CH,Yao N,Wang QQ,etal.Cyclocaryapaliurusextract modulates adipokine expression and improves insulin sensitivity by inhibition of inflammation in mice[J].JEthnopharmacol,2014,153(2):344-351.

[9] Lin Z,Wu ZF,Jiang CH,etal.The chloroform extract ofCyclocaryapaliurusattenuates high-fat diet induced non-alcoholic hepatic steatosis in Sprague Dawley rats[J].Phytomedicine,2016,23(12):1475-1483.

[10] Wang YT,Zhao MG,Sheng XP.etal.Effect of triterpenic acid-enriched fraction fromCyclocaryapaliuruson high glucose-induced pancreatic α cells insulin resistance[J].JChinaPharmUniv(中國藥科大學(xué)學(xué)報)，2018，49(2)：215-221.

[11] Xie MY,Xie JH.Review about the research onCyclocaryapaliurus(Batal.) Iljinskaja[J].JFoodSciBiotechnol(食品與生物技術(shù)學(xué)報),2008,27(1):113-121.

[12] Li XL.Study on chemical constituents ofCyclocaryapaliurus[D].Changchun:Changchun University of Chinese Medicine,2012.

[13] Guo XX,Sha XH,Liu J,etal.Chinese Purple Yam (DioscoreaalataL.) extracts inhibit diabetes-related enzymes and protect HepG2 cells against oxidative stress and insulin resistance induced by FFA[J].FoodSciTechnolRes,2015,21(5):677-683.

[14] Yin JJ,Luo YQ,Deng HL,etal.HuganQingzhimedication ameliorates hepatic steatosis by activating AMPK and PPARα pathways in L02 cells and HepG2 cells[J].JEthnopharmacol,2014,154(1):229-239.

[16] Lee JM,Johnson JA.An important role of Nrf2-ARE pathway in the cellular defense mechanism[J].BMBRep,2004,37(2):139-143.