曾永明 陳松武 欒潔 周麗珠 蒙芳慧 羅玉芬 韋曉娟 廖仲秋

【摘 要】金花茶葉、花中的總皂甙測定方法尚無國家標準。采用VM24固相萃取提取裝置具有洗脫液流速恒定可控、可批量處理，保證試驗系統(tǒng)的密閉性等優(yōu)點，可保證結果的平行性和準確性。用CNWBOND Alumina-N/XAD-2 SPE Cartridge固相萃取小柱、對總皂苷測定前處理過程進行了優(yōu)化，整套方法簡單，數(shù)據(jù)結果離散性小，平行性得到提高。人參皂苷Re含量（mg）的回歸方程為y=8.149 9x+0.234 1，R2=0.999 1，結果表明，總皂苷（以人參皂苷Re計）在0.000 0～0.114 2 mg范圍內線性關系良好。

【關鍵詞】金花茶;總皂甙;固相萃取;紫外分光光度法

【中圖分類號】R284.1 【文獻標識碼】A 【文章編號】1674-0688（2018）12-0073-02

金花茶[Camellia chrysanth（Hu）Tuyama]系山茶科（Theaceae）、山茶屬（Camellia）、金花茶組（set.Chrysantha）植物，是中國特產的傳統(tǒng)名茶，也是世界性的名貴觀賞植物。金花茶化學成份復雜，其主要活性物質有皂甙、黃酮、茶多酚、茶多糖等，研究證實金花茶中物質具有降低血清中膽固醇、提高機體免疫能力、抑制腫瘤生長、降血脂、降血糖等多種生理功能?？傇磉笆墙鸹ú枞~、花的主要活性成分之一，目前金花茶葉、花中的總皂甙測定方法尚無國家標準，大多都是按照《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范 （2003年版）》“保健食品中總皂甙的測定”方法檢測，本文主要研究金花茶葉、花總皂甙含量的固相萃取-紫外可見分光光度比色法測定方法，并以相對標準偏差、穩(wěn)定性、加標回收率為指標進行方法驗證，取得了可靠的試驗結果。

1 實驗目的

目前金花茶葉、花中的總皂甙測定方法尚無國家標準，大多都是按照《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范（2003年版）》“保健食品中總皂甙的測定”方法檢測。該方法采用人參皂苷Re為對照，用香草醛比色法測定總皂苷，其顯色體系為香草醛-冰醋酸-高氯酸。但在實際操作和相關文獻報道中，采用該方法檢測的結果誤差較大，尤其是不同實驗室間測定結果差異更大，不利于產品的質量控制。

本實驗采用VM24固相萃取提取裝置具有洗脫液流速恒定可控、可批量處理、保證實驗系統(tǒng)的密閉性等優(yōu)點，可保證結果的平行性和準確性。用CNWBOND Alumina-N/XAD-

2 SPE Cartridge固相萃取小柱（規(guī)格0.8 g/2.7 g，6 mL）、對總皂苷測定前處理過程進行了優(yōu)化，整套方法簡單，數(shù)據(jù)結果離散性小，平行性得到提高。

2 實驗方法

2.1 標準溶液制備

精密稱取5.71 mg人參皂苷Re對照品置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。吸取10 mL人參皂苷Re標準溶液（0.228 4 mg/mL）放蒸發(fā)皿中，水?。ǖ陀?0 ℃）揮干，準確加入10 mL水溶解，作為標準溶液。

2.2 樣品溶液制備

精密稱取適量樣品，置于50 mL離心管中，加水適量溶解，超聲30 min，放置至室溫，用水稀釋至刻度，搖勻，

3 500 r/min離心5 min，0.45μm微孔濾膜過濾。

2.3 樣品溶液吸附及洗脫

取樣品溶液上清液置于收集管中（大于2 mL），放置于VM24固相萃取系統(tǒng)中，按以下步驟進行吸附及洗脫。

（1）活化：在固相萃取柱中，以2.5 mL/min流速沖洗70%乙醇25 mL，然后以2.5 mL/min流速沖洗水25 mL。

（2）上樣：以1 mL/min流速加1 mL樣品溶液于固相萃取柱中。

（3）洗脫：以0.8 mL/min流速，依次用25 mL水，25 mL70%乙醇進行洗脫，收集70%乙醇洗脫液。

（4）揮干：將收集的洗脫液轉入50 mL的刻度試管中，在60 ℃下氮氣吹干。

2.4 顯色與測定

在上述已揮干的洗脫液中準確加入0.2 mL5%香草醛冰乙酸溶液，使殘渣全部溶解，再加0.8 mL高氯酸，混勻后60 ℃水浴上加熱10 min，冰浴冷卻后，準確加入冰乙酸5.0 mL，搖勻后，以1 cm比色管于540 nm波長處與標準管一起進行比色測定。實驗方案見表1。

3 實驗數(shù)據(jù)

樣品含量測定：分別取金花茶葉、花，進行測定，于540 nm波長處測定吸光度值，根據(jù)所得到的標準曲線計算樣品中總皂苷的含量。實驗數(shù)據(jù)見表2。

4 結果分析及討論

線性關系考察：精密吸取前述“2.1”項標準溶液0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL人參皂苷Re標準溶液（0.228 4 mg/mL），按“2.3”“2.4”項的方法進行前處理并測定。以吸光度值為橫坐標，以人參皂苷Re含量（mg）為縱坐標進行回歸計算，回歸方程為y=8.149 9x+0.234 1，R2=0.999 1，結果表明，總皂苷（以人參皂苷Re計）在0.000 0～0.114 2 mg范圍內線性關系良好，圖1為線性關系圖。

加樣回收率試驗：采用加標回收率法，精密稱取金花茶花適量，分別按樣品量100%的比例各6份加入對照品，進行測定，并分別計算回收率，結果加標回收率在99.58%～100.05%，RSD0.18%，并與傳統(tǒng)方法（手填層析柱、人工進行柱洗脫）進行比較，表明該方法準確度良好，且離散度低于傳統(tǒng)方法。加樣回收率試驗結果見表3。凹脈金花茶花加標回收率試驗結果見表4。

5 穩(wěn)定性試驗

將顯色后樣品分別放置0 h、0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h，測定吸光值，結果表明該顯色體系在1 h內吸光度基本不變，1 h后吸光度有所降低，故在顯色后1 h內測定。

6 討論

（1）《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范（2003年版）》中，保健食品總皂苷的測定，樣品采用過大孔吸附樹脂，再加顯色劑顯色后測定吸收值。操作過程中，在柱層析時，樹脂活化的時間長短以及樣品在過柱時，洗脫速度快慢不一，使得測定的總皂苷結果誤差較大，無法確保檢測結果穩(wěn)定。采用VM24固相萃取提取裝置具有洗脫液流速恒定可控、樹脂活化時間適當延長，可大批量處理樣品，保證實驗系統(tǒng)的密閉性等優(yōu)點，可保證結果的平行性和準確性。

（2）不同廠家的大孔樹脂、填料松緊和載藥量也對總皂苷測定影響較大，選擇CNWBOND Alumina-N/XAD-2 SPE Cartridge固相萃取小柱，簡化實驗前處理過程，數(shù)據(jù)結果離散性小，平行性得到提高。

（3）本實驗分析的金花茶有葉和花，在上柱前的樣品需經離心，并經微孔濾膜過濾，保證不阻塞固相萃取提取儀進樣系統(tǒng)。

（4）對于總皂苷的測定實驗，柱層析是關鍵步驟，而柱層析的關鍵在于柱子是否裝好和淋洗劑是否選擇恰當。傳統(tǒng)手裝的柱子很難保證填料的質量相同、松緊一致，在洗脫過程中可能會出現(xiàn)氣泡，柱子塌陷等現(xiàn)象，進而導致提取效果不佳，測定的數(shù)據(jù)重復性差。CNWBOND Alumina-N/XAD-2 SPE Cartridge固相萃取小柱將所需的填料質量細化，并且采用了砂芯隔板，使填料的松緊一致，而且頂端的砂芯隔板使層析面平整，在洗脫時防止了柱子內部質量不均現(xiàn)象出現(xiàn)，優(yōu)化了本實驗的前處理方案。采用SPE小柱進行多次試驗，發(fā)現(xiàn)試驗的數(shù)據(jù)重復性明顯優(yōu)于傳統(tǒng)實驗方案。將CNWBOND Alumina-N/XAD-2 SPE Cartridge固相萃取小柱與VM24固相萃取儀相結合，也實現(xiàn)了多批樣品的同時測定，減輕實驗室工作量。

參 考 文 獻

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