王桂花，何連福

（大理大學第一附屬醫(yī)院呼吸內科，云南大理 671000）

結核?。╰uberculosis）是結核分枝桿菌（myco?bacterium tuberculosis，MTB）感染而引起的一種慢性傳染病，病變常累及胸膜、肺臟、脊柱、腸道等多個組織器官，以肺結核（pulmonary tuberculosis）最為常見。2016年，全球約1 040萬新發(fā)結核病例，死亡率22%，是全世界第十大死因，在傳染性疾病中排名第一〔1〕。引起結核病的因素有營養(yǎng)不良、環(huán)境因素、遺傳因素等，隨著結核病發(fā)病機制研究的深入及分子診斷技術的發(fā)展，遺傳因素誘發(fā)結核病的發(fā)生發(fā)展越來越受到關注。相關研究表明，遺傳因素在結核病的發(fā)生與發(fā)展中起到一定的作用〔2〕。與結核病易感的相關基因有VDR、MBL、NRAMP1（自然抗性相關巨噬細胞蛋白1）、Sp110、TLR2、HLA等〔3-8〕。

NRAMP1基因，又稱SLC11A1（溶質載體家族11成員1）基因，位于人類染色體2q35，全長14 Kb，編碼550個氨基酸。大量研究發(fā)現(xiàn)非洲、亞洲、歐洲結核病易感性與NRAMP1的D543N、3′UTR、5′（GT）n、INT4這4個多態(tài)位點有關，且不同種族的人群均存在差異〔9-10〕。云南大理是少數(shù)民族的聚居地，而少數(shù)民族中白族人群居多。目前有關大理白族人群結核病易感相關基因的研究尚未見報道，本研究采用病例—對照研究及PCR-RFLP方法，探究NRAMP1基因的3′UTR位點多態(tài)性與大理白族人群肺結核易感的相關性，并觀測患者抗結核治療后發(fā)生不良反應的情況，為世居大理白族人群結核病易感性的評估及防治提供遺傳基礎依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料 病例組選取2015年3月至2017年10月在大理大學第一附屬醫(yī)院呼吸內科確診的白族活動性肺結核患者共193例，平均年齡（39.98±14.55）歲，男性108例，女性85例，所有患者均符合2008年中華人民共和國衛(wèi)生部制定的肺結核診斷標準。對照組選取同期白族健康體檢人員191人，平均年齡（37.62±10.68）歲，男性111人，女性80人。病例組及對照組在性別及年齡上差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），存在可比性。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取及檢測 采集研究對象外周靜脈血2～3 mL。采用全血基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取總DNA。用ND2000超微量分光光度計對提取的總DNA進行濃度測定及純度分析，A260∕A280＞1.8及 A230∕A260＞1.7，提示提取的DNA合格。

1.2.2 PCR擴增與電泳 引物設計：參照NCBI中NRAMP1全基因序列號（NG_012128.1），用premier5.0軟件設計及由金斯瑞公司合成。PCR反應體系25μL：ddH2O 9.5 μL，2× PCR mix 12.5 μL，DNA模板1 μL，正反向引物各1 μL。見表1。

1.2.3 PCR?RFLP分析 PCR產物用Fok1內切酶進行酶切。酶切反應體系30 μL：PCR產物2 μL，F(xiàn)ok1內切酶 1 μL，ddH2O 24 μL，10×酶切 Buffer 3 μL，37℃酶切4 h。取產物上樣，2%瓊脂糖凝膠140 V電泳30 min，分析基因型。見表2。

表1NRAMP1基因3′UTR位點引物及PCR反應參數(shù)

表2NRAMP1基因3′UTR多態(tài)性分析

病例組患者抗結核治療1月后檢測血常規(guī)、肝腎功能，觀察病例組各基因型患者不良反應的發(fā)生率。

1.3 統(tǒng)計學分析 Hardy-Weinberg遺傳平衡分析對照組，并評估其人群代表性。使用軟件SPSS 21.0統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，χ2檢驗，P＜0.05差異具有統(tǒng)計學意義。根據(jù)統(tǒng)計結果，以OR值（比值比）及95%可信區(qū)間評估基因多態(tài)性對肺結核發(fā)病的相對風險度。

2 結果

2.1 NRAMP1基因3′UTR多態(tài)性分析

2.1.1 PCR產物 圖1A中，2～3為對照組PCR產物，5～6為病例組PCR產物。PCR擴增條帶大小為244 bp，與表1中的目的片段大小一致，提示設計的引物良好，可進行PCR反應及后續(xù)酶切實驗。

2.1.2 酶切產物分析 PCR產物經Fok1酶酶切后，據(jù)表2分析3′UTR位點多態(tài)性，比對PCR產物（見圖1A），可確定各樣品3′UTR的基因型（見圖1B）。GG型：7和8為病例組，10為對照組；GA型：6為病例組，9為對照組；AA型：1～3為病例組，4和5為對照組。

圖1 電泳圖譜

3′UTR位點基因型頻率及等位基因在兩組間的分布見表3。病例組中，GG基因型占66.32%，GA基因型占27.98%，AA基因型占5.70%；對照組中，GG基因型占82.20%，GA基因型占15.71%，AA基因型占2.10%。病例組中GA型和AA型明顯多于對照組（P＜0.05）。A等位基因在病例組的分布明顯高于對照組（P＜0.001）。風險評估提示，A等位基因（OR=2.219，95%CI=［1.470-3.349］）是白族人群肺結核發(fā)病的危險因素。

表3 NRAMP1基因3′UTR位點等位基因及基因型分布［n（%）］

不同遺傳模式下兩組間3′UTR位點的基因型分布見表4。顯性遺傳模式下，3′UTR位點可分為GG、GA+AA，病例組中GA+AA基因型頻率明顯高于對照組（P＜0.01）。以GG基因型為對照，相對風險分析結果顯示白族人群中存在GA+AA基因型的個體肺結核的發(fā)病風險增高（OR=2.345，95%CI=［1.466-3.751］）；隱性遺傳模式下，3′UTR位點可分為GA+GG、AA，AA基因型頻率在兩組間的分布差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；加性遺傳模式下，3′UTR位點可分為GG、GA和AA，GA和AA基因型頻率在病例組中明顯高于對照組（P＜0.05），以GG基因型為對照，相對風險分析結果提示白族人群中AA及GA基因型個體患肺結核的風險增大（OR=3.373，95%CI=［1.114-10.210］；OR=2.208，95%CI=［1.343-3.630］）。表明白族人群中NRAMP1基因3′UTR位點多態(tài)性與肺結核病相關，3′UTR位點突變增加了患肺結核的概率。

表4 不同遺傳模式下NRAMP1基因3′UTR多態(tài)性位點基因型分布［n（%）］

2.2 NRAMP1基因3′UTR位點基因型分布與不良反應的相關性 193例患者出現(xiàn)199例次不良反應，包括胃腸道反應、肝損害、關節(jié)損害、神經系統(tǒng)反應、過敏反應、血液系統(tǒng)反應、腎損害等。從表5可知，各種不良反應在3種基因型中發(fā)生的情況，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。從表6得出，野生型（GG型）與突變型（GA+AA型）患者抗結核治療后不良反應的發(fā)生情況差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.3 NRAMP1 3′UTR位點基因型分布與不良反應嚴重性的關系 50例次發(fā)生的較重不良反應須進行臨床處理，常見胃腸道反應、肝損傷、過敏反應及血液系統(tǒng)等癥狀。GG型與GA+AA型患者間須臨床治療不良反應的發(fā)生情況無明顯區(qū)別（P＞0.05），見表7。臨床處理后，不良癥狀減輕或消退，未見因不良反應而不耐受停藥者。

3 討論

本文采用病例—對照研究及PCR-RFLP方法，研究NRAMP1基因3′UTR位點多態(tài)性與大理白族肺結核易感相關性，并分析各基因型與肺結核抗結核治療后的不良反應相關性。3′UTR位點多態(tài)性分析結果顯示，病例組中突變型（GA型和AA型）明顯多于對照組（P＜0.05）；等位基因分析結果表明，A等位基因（OR=2.219，95%CI=［1.470-3.349］）是白族人群肺結核病發(fā)病的危險因素；顯性遺傳模式下，病例組中GA+AA基因型分布顯著高于對照組（P＜0.001），風險評估提示存在GA+AA基因型的白族個體患肺結核的風險增高（OR=2.345，95%CI=［1.466-3.751］）；隱性遺傳模式下，兩組間AA基因型分布差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；加性遺傳模式下，突變基因型在病例組中的分布顯著高于對照組（P＜0.05），風險評估顯示具有GA和AA基因型的白族個體易患肺結核（OR=2.208，95%CI=［1.343-3.630］；OR=3.373，95%CI=［1.114-10.210］）。結果表明白族人群的NRAMP1基因3′UTR位點突變會引起肺結核的患病率增加及加劇病情的惡化。1998年，Bellarmy等〔11〕以西非人群為研究對象，發(fā)現(xiàn)NRAMP1基因的4個SNP位點［5′（CA）n、INT4、D543N和3′UTR］與結核病易感性相關；安雅臣等〔12〕以中國北方漢族人為研究對象，發(fā)現(xiàn)NRAMP1基因3′UTR位點多態(tài)性可能與中國北方漢族人群的肺結核易感性相關，且可影響肺結核病理學特點。以上研究結果進一步表明NRAMP1基因3′UTR位點突變與肺結核易感性相關。

表5 不同基因型肺結核患者抗結核治療中不良反應發(fā)生情況［n（%）］

表6 野生型及突變型肺結核患者抗結核治療中不良反應發(fā)生情況［n（%）］

表7 NRAMP1基因3'UTR位點不同基因型肺結核患者抗結核治療中須臨床處理不良反應的發(fā)生情況［n（%）］

常用的一線抗結核藥有異煙肼、利福平、乙胺丁醇等，多會引起胃腸道反應、肝損傷等副作用。本文對病例組患者抗結核治療后出現(xiàn)不良反應進行了統(tǒng)計分析，結果顯示NRAMP1基因3′UTR位點不同基因型間的副作用發(fā)生率及嚴重程度均無明顯差異。

本文僅探討了NRAMP1基因對大理白族人群結核病易感性的作用，但引發(fā)結核病的相關因素很多，如居住條件、營養(yǎng)狀況、細菌毒力等均增加了結核病早期防治困難，而關于結核病易感相關基因的研究有利于結核病的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，為其防治提供參考。

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