趙水仙，郭耿蓉，于秋楠，錢金栿

（大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000）

天麻（Gastrodia elata Bl.）是我國(guó)名貴的中藥材。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為天麻味甘，性平，入肝經(jīng)，具有息風(fēng)定驚、鎮(zhèn)靜安眠之功效，主要用于治療頭暈?zāi)垦?、頭痛、肢體麻木、失眠等癥狀，療效確切，毒性較小〔1〕。近年來的研究發(fā)現(xiàn)天麻還具有提高智力、健腦、延緩衰老的作用，對(duì)老年性癡呆癥也有一定的療效，天麻越來越受到人們的廣泛關(guān)注〔2〕。我國(guó)對(duì)天麻化學(xué)成分的研究已有二十余年，所報(bào)道的化合物中，主要有酚類、有機(jī)酸類及植物中常見的甾醇類等幾種類型，化學(xué)成分含天麻素、天麻苷元等〔3〕。

云南昭通等地盛產(chǎn)天麻，新鮮天麻一般都按藥材和蔬菜食材出售，沒有進(jìn)行精加工，價(jià)格低廉，利潤(rùn)較薄。市場(chǎng)上的天麻主要以干品居多，干天麻質(zhì)硬，食用及藥用十分不便。目前天麻被深加工成為藥品或食品的成品種類不多。為了提升其附加值，改變這種現(xiàn)狀，本課題組對(duì)天麻產(chǎn)品進(jìn)行了研發(fā)，將新鮮天麻通過精加工，將其制造成為食用方便的天麻原汁口服液，產(chǎn)品最大限度地保存其有效成分，作為商品服務(wù)于有需要的人群，提高其附加值，增加藥農(nóng)產(chǎn)品收入的新渠道。

1 實(shí)驗(yàn)材料、儀器及試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 新鮮天麻（產(chǎn)自云南昭通彝良小草壩）；灌裝瓶（10 mL）；微孔濾膜（0.22 μm）；微孔濾頭（0.22 μm）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 美國(guó)Agilent-1200型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；高壓滅菌鍋；榨汁機(jī)；過濾設(shè)備（自制）。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 天麻素對(duì)照品（廠家：中國(guó)藥品檢定研究院；批號(hào)：110807-201608；供含量測(cè)定用）；乙腈（色譜純）；甲醇（色譜純）；0.05%磷酸（分析純）；甲殼素（食用級(jí)）。

2 試驗(yàn)方法

2.1 工藝流程 鮮天麻清洗→榨汁→過濾→離心澄清→分離天麻澄清液→計(jì)量灌裝→高壓滅菌→成品。

2.3 口服液的制備技術(shù)工藝 選瓶：考慮患者的依從性和藥物服用方便程度，在灌裝瓶的選擇上，選擇了10 mL的口服液瓶。洗瓶：先用自來水清洗2次，再用蒸餾水沖洗3次后烘干。口服液瓶的滅菌，將清洗好的瓶子放入高壓蒸汽滅菌鍋進(jìn)行滅菌，121 ℃，30 min〔6〕。灌裝入瓶：用無菌注射器將天麻汁的上清液取出灌裝入口服液瓶中。滅菌：將口服液放入高壓滅菌鍋，105℃，10 min，冷卻后即為成品。

2.4 甲殼素澄清試驗(yàn) 為了得到澄清的天麻汁口服液，加入甲殼素，利用其絮凝作用來達(dá)到澄清效果。分別從天麻汁的加入量V（mL）、甲殼素的濃度C（g∕L）、甲殼素的加入量V（mL）、靜止時(shí)間（th）4個(gè)方面來考察澄清效果。用“+”表示澄清效果，“+”越多表示溶液澄清效果越好。1個(gè)“+”代表重度渾濁，2個(gè)代表中度渾濁，3個(gè)代表輕度渾濁，4個(gè)代表輕度澄清，5個(gè)代表中度澄清，7個(gè)代表特級(jí)澄清。見表1。

2.5 離心澄清試驗(yàn) 與甲殼素的澄清試驗(yàn)作對(duì)比，考察哪個(gè)澄清試驗(yàn)澄清效果更好。分別從天麻汁是否加入甲殼素、加甲殼素的靜止時(shí)間、轉(zhuǎn)速（r∕min）、時(shí)間（tmin）4個(gè)方面考察。用“+”表示澄清效果，“+”越多表示溶液澄清效果越好。1個(gè)“+”代表重度渾濁，2個(gè)代表中度渾濁，3個(gè)代表輕度渾濁，4個(gè)代表輕度澄清，5個(gè)代表中度澄清，7個(gè)代表特級(jí)澄清。見表2。

2.6 滅菌溫度對(duì)質(zhì)量的影響試驗(yàn) 將配制好的天麻口服液分為灌裝后滅菌和滅菌后灌裝兩種形式在不同滅菌條件下滅菌，放置2 d后對(duì)滅菌后的口服液進(jìn)行感官評(píng)價(jià)（澄清度、有無沉淀）和有效成分的測(cè)定以選出最佳滅菌溫度〔7〕。見表3。

圖1 天麻素的高效液相色譜圖

2.7 天麻素的含量測(cè)定

2.7.1 色譜條件 色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.05%磷酸（3：97）；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm；柱溫：30℃；流速：1 mL∕min；進(jìn)樣量：10 μL?！?〕

在廠區(qū)下游設(shè)置多個(gè)應(yīng)急監(jiān)測(cè)井，構(gòu)建應(yīng)急監(jiān)測(cè)防控體系。一旦污染物泄露，啟動(dòng)應(yīng)急檢測(cè)防控體系，檢查并切斷污染源，啟動(dòng)應(yīng)急井以恒定流量抽水，以保證形成降落漏斗，控制污染物的運(yùn)移。另外，在泄露源上做好防控措施，根據(jù)污染物泄露控制難易程度以及污染物類型做好分區(qū)分級(jí)防滲。

2.7.2 溶液的配制 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制〔9〕：精密稱取天麻素對(duì)照品1 mg置于10 mL的容量瓶中，加流動(dòng)相制成100 μg∕mL的溶液，即得。

供試品溶液的配制：取天麻原汁0.2 mL置于10 mL的容量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.7.3 測(cè)定 分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試品溶液各10 μL注入高效液相色譜儀。色譜圖見圖1。

2.8 加速試驗(yàn)預(yù)測(cè)口服液的保質(zhì)期 取同一批口服液分別在60℃ 24 h、65℃ 18 h、70℃ 12 h、75℃8 h、80℃ 6 h、85℃ 4.2 h、90℃ 2 h下進(jìn)行含量測(cè)定，觀察含量的變化〔10〕。

3 結(jié)果

3.1 甲殼素的澄清試驗(yàn)分析 由表1中結(jié)果可知：（1）隨著甲殼素加入量的增加，澄清效果也越來越好，但是到達(dá)一定程度后又會(huì)下降。（2）從序號(hào)5、6、7、8、10、11中可看出，靜止時(shí)間越長(zhǎng)，澄清效果也會(huì)越好。（3）16、17、18雖然澄清度好，但是得到的溶液粘稠。綜上所述，選定最后一組數(shù)據(jù)加入量為3 mg∕L，靜止時(shí)間60 min作為澄清的最佳條件。

表1 甲殼素澄清試驗(yàn)安排及結(jié)果

3.2 離心澄清試驗(yàn)分析 由表2中結(jié)果可知，加甲殼素和不加甲殼素的天麻汁離心后出現(xiàn)了鮮明的對(duì)比，加入甲殼素的天麻汁明顯澄清，而且還和靜止時(shí)間有關(guān)，靜止24 h比不靜止澄清，這里加入的甲殼素量參考了甲殼素的澄清試驗(yàn)。綜合表1和表2的結(jié)果可以得到：天麻汁的最佳澄清實(shí)驗(yàn)條件為加3 mg∕L的甲殼素后靜置24 h，4 000 r∕min離心25 min。

3.3 滅菌溫度的選擇試驗(yàn)分析 由表3結(jié)果可知：（1）灌裝前滅菌和灌裝后滅菌的效果相同；（2）未滅菌口服液中天麻素的含量低于滅菌后天麻素的含量，暫未找出其原因。綜上所述，選擇的滅菌條件為105℃、10 min。

表2 離心澄清試驗(yàn)及結(jié)果

表3 滅菌溫度的選擇及結(jié)果

3.4 方法學(xué)驗(yàn)證 線性關(guān)系考察〔11〕：分別精密吸取對(duì)照品溶液（100 μg∕mL）2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μL依次注入高效液相色譜儀，按“2.7.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（x）、天麻素峰面積為縱坐標(biāo)（y），得r=0.999 4（n=5），線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取同一供試品溶液10 μL連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得峰面積分別為64.1、60.6、56.6、56.7、56.4、55.4，RSD=5.761%（n=6）。

供試品溶液的穩(wěn)定性試驗(yàn)：將供試品溶液置室溫下取不同時(shí)間（0、2、4、6、8 h）分別進(jìn)樣10 μL，測(cè)得的峰面積分別為44.0、39.3、41.2、42.3、44.4，RSD=4.951%（n=5）。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品，精密量取天麻汁0.2 mL置于10 mL的量瓶中加流動(dòng)相稀釋至刻度，平行制備6份，各取10 μL注入色譜儀，測(cè)定。測(cè)得的峰面積分別為 44.0、42.5、43.3、41.4、43.6、43，RSD=2.147%（n=6）。

回收率試驗(yàn)：取已知天麻素含量（0.251 5 mg∕mL）的天麻汁0.2 mL，共6份，然后分別精密加入對(duì)照品溶液6 mL（100 μg∕mL），加入流動(dòng)相稀釋至刻度，按供試品制備方法制備樣品溶液。在上述色譜條件下分別測(cè)定6次，平均回收率為97.91%，RSD值為1.95%（n=6），表明回收率良好。

3.5 加速試驗(yàn)結(jié)果及分析 由于藥典還沒有收錄天麻口服液，無法查到天麻口服液中天麻素含量的最低限度，經(jīng)查閱相關(guān)資料，參考天麻頭痛片、天麻祛風(fēng)補(bǔ)片、天麻醒腦膠囊中天麻素含量的最低限度作為口服液中天麻素的最低限量，求平均值得0.241 3 mg∕mL〔12〕；測(cè)得樣品天麻口服液中的天麻素含量為0.251 5 mg∕mL。見表4。

表4 天麻原汁口服液以天麻素為指標(biāo)的加速試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)Arrhenius（阿倫尼烏斯）定律，以表中的lgV0對(duì)1∕T進(jìn)行線性回歸，得以下回歸方程。根據(jù)回歸方程計(jì)算室溫下口服液的貯存期。

回歸方程：lgV0=11.20-450 0 ×1∕T，r=0.999 4。

室溫下的V030℃=0.000 279 h-1。

保存期t30℃=（100%-90%）∕V30℃

=［（0.251 5-0.241 3）∕0.251 5］×100∕0.000 279

=14 536.4 h≈1.66年≈20個(gè)月。

3.6 服用劑量計(jì)算 測(cè)得天麻素的含量為0.2515 mg∕mL，每瓶10 mL，每瓶含2.515 mg天麻素，參考全天麻膠囊的服用量為每日6～18 mg〔12〕，因此建議天麻原汁口服液用量為每日服用2次，每次2～3瓶。

4 討論

通過甲殼素澄清試驗(yàn)和離心澄清試驗(yàn)確定了天麻汁的最佳澄清實(shí)驗(yàn)條件為加3 mg∕L的甲殼素后靜置24 h，4 000 r∕min離心25 min。通過比較不同溫度滅菌前后有效成分的含量變化確定了最佳的滅菌條件為105℃10 min，實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)未滅菌口服液中天麻素的含量低于滅菌后天麻素的含量，暫未找出導(dǎo)致該實(shí)驗(yàn)結(jié)果的原因。加速試驗(yàn)中，從該口服液有效成分的測(cè)定結(jié)果看，在室溫條件下的貯藏期為1.66年?？紤]到其產(chǎn)品的食用安全性，實(shí)際貯藏期可暫定為1.5年，即18個(gè)月。建議在正式生產(chǎn)時(shí)，要用留樣觀察法來測(cè)定其他微生物指標(biāo)，讓保質(zhì)期制定更為科學(xué)可靠。本文建立的HPLC法測(cè)定天麻汁中天麻素含量的方法采用《中華人民共和國(guó)藥典》（2015年版）一部天麻藥材中天麻素含量測(cè)定的檢測(cè)方法。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)在探索天麻原汁口服液完備的制備工藝條件的基礎(chǔ)上，生產(chǎn)出一批可供相應(yīng)患者服用的口服液成品，改變了天麻深加工產(chǎn)品種類不多的現(xiàn)狀，同時(shí)制定出基本符合規(guī)定的地方生產(chǎn)工藝，為天麻原汁口服液的生產(chǎn)提供了經(jīng)驗(yàn)和參考數(shù)據(jù)。

〔1〕陶云海.天麻藥理研究新進(jìn)展〔J〕.中國(guó)中藥雜志，2008，33（1）：108-110.

〔2〕楊世林，蘭進(jìn)，徐錦堂.天麻的研究進(jìn)展〔J〕.中草藥，2000，31（1）：66-69.

〔3〕王倫，張興國(guó)，李曉倩.天麻主要活性成分及其結(jié)構(gòu)修飾研究〔J〕.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，49（5）：1146-1149.

〔4〕林靜，王靜暉，加雙艷，等.羅漢果口服液的研制〔J〕.黃石理學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，27（6）：45-49.

〔5〕祝佳新，張揚(yáng)，穆紅領(lǐng)，等.口服液常用輔料的應(yīng)用綜述〔J〕.吉林化工學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，31（5）：32-35.

〔6〕趙洪武，周宏進(jìn).口服液生產(chǎn)工藝技術(shù)及設(shè)備分析〔J〕.生物技術(shù)世界，2012（12）：20-21.

〔7〕田洋，史崇穎，穆穎超，等.烏雞天麻口服液的研制〔J〕.食品研究與開發(fā)，2015，36（13）：50-54.

〔8〕王國(guó)棟，曾艷，程志國(guó)，等.天麻中有效成分天麻素HPLC法測(cè)定含量的研究〔J〕.中國(guó)醫(yī)藥指南，2012，10（21）：92-94.

〔9〕李述智.高效液相色譜法測(cè)定天麻素注射液含量及有關(guān)物質(zhì)〔J〕.廣州化工，2014，42（15）：158-161.

〔10〕曹磊磊，沈郁，吳玉林.初均速法預(yù)測(cè)銀黃口服液的貯存期〔J〕.江蘇藥學(xué)與臨床研究，2001，9（1）：7-8.

〔11〕黃順旺，許龍，曹明成.HPLC法測(cè)定天麻素葡萄糖注射液中天麻素的含量〔J〕.安徽醫(yī)藥，2008，12（3）：220-221.

〔12〕國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部〔M〕.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：58.